火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法
【專利摘要】本發明涉及火木層孔菌桑黃中單體成分HypholomineB的制備方法，步驟如下：1)桑黃藥材粉碎，超聲提取；2)提取物經第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取；3)分取2)中下層溶液經第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取；取上層萃取液，得到萃取物干粉；4)制備流動相，得到上相溶液與下相溶液；5）下相溶液溶解萃取物干粉，上相溶液泵入高速逆流色譜儀分離管，主機為正轉，將下相溶液泵入，到平衡后，取濾液注入進樣閥，每15min收集1個流分；合并其中60-70min時間段內所收集流分，減壓回收溶劑，得到單體化合物HypholomineB的干粉。本發明提取分離采用的技術手段新、分離效率高、方法穩定可重復。
【專利說明】火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及一種屬于藥物領域，尤其涉及提取自火木層孔菌桑黃 中的一種單體成分：Hypholomine B的制備方法。 【背景技術】
[0002] 桑黃為擔子菌門（Basidiomycotas)、層菌綱（Hymenomycetes)、非裙菌目 (Aphyllophorales)、鎊革孔菌科（Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬（Phellinus Quel.) 大型藥用真菌的子實體。桑黃始記于《本草綱目》，又名桑臣、桑耳、胡孫眼、桑黃姑，可 用于治療治血崩、血淋、脫肛瀉血、帶下、經閉、脾虛泄瀉等。其來源主要包含火木層孔菌 {Phellinus igniarius (Berk, et Curt.) Teng)、裂蹄木層孑L菌linteus (L.ex Fr.) Quel)和鮑氏層孔菌Aaa? ii /Wai)三個種。目前國內外對桑黃 研究較多集中于生物學特征、化學成分分析、藥用機理以及菌種培育工藝等方面。
[0003] 桑黃因其臨床確有療效的抗腫瘤作用，近年來逐漸成為研究熱點。早在1968年， 日本學者Ikekawa研究發現桑黃子實體提取物對小鼠 S180肉瘤的抑制率為96. 7%，第一 次提出了桑黃具有腫瘤抑制作用。有關桑黃多糖免疫刺激和抗腫瘤活性研究報道較多，結 果顯示多糖能夠促進抗體的產生，降低荷瘤小鼠毒副作用和增強體內協同作用，具有抑制 S180肉瘤細胞和H22肝癌細胞小鼠移植瘤的生長作用。Ge Li等研究后認為桑黃蛋白多糖 可降低人結腸癌細胞SW480中Bcl-2的表達，增加細胞色素 C的釋放和減少細胞周期蛋白 B1來抑制SW480的生長，進而引發細胞凋亡作用。Jong-Jin Lee等研究發現桑黃菌絲體 多糖對人肺腺癌細胞A549具有直接殺傷作用，而對正常細胞NIH3T3和L1210沒有影響。 Ji D F等研究發現桑黃多糖可通過P27kipl-cyclin D1/E-CDK2途徑抑制人結腸腺癌細胞 HT-29和人肝癌細胞Η印G2的細胞S期，從而抑制HT-29和Η印G2的生長，引起細胞凋亡 作用。
[0004] 桑黃的其他化學成分，如黃酮類、多酚類、三萜類等，相關生物活性研究報道集中 于抗炎、抗氧化，抗病毒、降糖以及抗自由基等作用研究，其中Inoscavin A、Hypholomine B等成為是桑黃中含量較高的多酚類成分，研究證實具有抗氧化、抗自由基作用。本發明采 用溶劑提取，高速逆流色譜分離技術，自火木層孔菌桑黃中純化 制備得到一種單體成分，結合波譜解析，確定為多酚類物質Hypholomine B，是桑黃醇提物 中主成分，生藥中含量達0.78%，并且峰位居中、與鄰峰分離度良好。據報道該成分具有顯著 的抗氧化、抗炎活性，本發明確定了該成分的制備方法，應用該方法，能夠批量制備桑黃單 體成分，為桑黃藥效學研究及藥材質量控制提供物質基礎。經檢索，為見與本發明類似的關 于Hypholomine B單體成分制備方法的公開，除了采用植化分離手段，得到微量成分用于化 學結構研究的研究報道。如文獻 1 "In-Kyoung Lee, Myung-Suk Han, Myeong-Seok Lee, Young-Sook Kim, Bong-Sik Yun, Styrylpyrones from the medicinal fungus Phellinus baumii and their antioxidant properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010) 5459 - 5461，';文獻二"Shunyan Mo, Sujuan Wang, Guangxiong Zhou, et al. Phelligridins C_F: Cytotoxic Pyrano[4,3_c][2]benzopyran_l, 6-dione and Furo[3, 2-c]pyran-4-〇ne Derivatives from the Fungus Phellinus igniarius. Nat. Prod. 67 (2004)823-828";文獻三"Yeon Sil Lee, Il-Jun Kang, Moo Ho Won, Jae-Yong Lee, Jin Kyu Kim and Soon Sung Lim. Inhibition of Protein Tyrosine Phosphatase 1 β by Hispidin Derivatives Isolated from the Fruiting Body of Phellinus linteus. , Natural Product Communications 5 (2010) 1927-1930"。上述文獻中均提 到了化合物Hypholomine B并明確指出其結構式，文獻1、2、3均采用溶劑提取-柱分離技 術，得到系列化合物，經光譜、質譜及核磁分析，鑒定所得化合物。文獻3證實該化合物具有 鐵螯合活性，因而發揮抗氧化作用。但所有文獻均以植化分離技術得到微量化合物，采用成 分結構鑒定技術進行化合物結構解析，其目的是為了證明被研究植物中含有該化合物，而 非批量純化制備該化合物，因而不涉及該化合物的純化制備過程。
【發明內容】
[0005] 為了解決上述的技術問題，本發明的目的是提供一種火木層孔菌桑黃中單體成分 Hypholomine B的制備方法，該方法具有分離效率高、方法穩定可重復和技術應用前景良好 的特點。
[0006] 為了實現上述的目的，本發明采用了以下的技術方案： 火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法，該方法包括以下的步驟： 1) 桑黃藥材粉碎，采用60%體積百分比濃度的乙醇水溶液超聲提取； 2) 乙醇提取物經第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第一石油醚和乙酸乙酯混合溶 液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:1，棄去； 3) 分取2)中下層溶液經第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第二石油醚和乙酸乙 酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為1:1 ;取上層萃取液，濃縮，干燥，得到萃取物 干粉； 4) 制備流動相，流動相采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系，精密計量體積，配制成 體積比為1:1. 7:1:2的混合溶液，充分振搖后靜置3 h，上下兩層完全分層澄清，分離上下 層，得到上相溶液與下相溶液，分別超聲脫氣30 min，備用； 5) 取萃取物干粉，精密稱重，取下相溶液，體積相當于萃取物干粉質量數的10倍量，溶 解萃取物干粉，用〇. 45 Mm孔徑的微孔濾膜濾過，濾液備用；取上相溶液，泵入高速逆流色 譜儀分離管，待固定相充滿整個分離管后，調節主機為正轉，至800 r/min轉速，同時將下相 溶液泵入，待流動相從柱口流出且固定相不流出，兩相溶劑在分離管中達到動態平衡后，取 濾液10mL，注入進樣閥進樣，流速2. 5 mL/min的條件下，395 nm波長下檢測，分離樣品，總 分析時間200 min，每15 min收集1個流分；合并其中60-70 min時間段內所收集流分，減 壓回收溶劑，得到單體化合物Hypholomine B的干粉。
[0007] 作為優選，所述的步驟1)中取桑黃藥材，粉碎成蠶豆大顆粒，加入相當于8倍藥材 質量的濃度為60 %的乙醇水溶液，浸泡15 min，超聲提取30 min，濾過，該過程重復三次合 并3次濾液，減壓回收溶劑，得到干燥粉末，備用。
[0008] 作為優選，所述的步驟2)中取步驟1)的乙醇提取物，20%乙醇水溶液充分溶解，轉 移至分液漏斗中，放冷；加入同體積的第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振搖萃取；靜置分 層；分取下層水液，棄去上層；下層水液采用同樣的萃取過程，重復萃取1次；棄去上層，得 石油醚乙酸乙酯混合溶液萃取去雜后的水液，備用。
[0009] 作為優選，所述的步驟3)中取步驟2)的下層溶液，加入等體積的第二石油醚和乙 酸乙酯混合溶液，振搖萃取；靜置分層；分取上層，下層水液采用同樣的萃取過程，重復萃 取2次；合并3次的萃取液；50°C水浴蒸干，殘渣冷藏備用。
[〇〇1〇] 作為優選，該方法還包括精制步驟：取制備的干粉，加50%乙腈水溶液充分溶解， 體積相當于干粉質量數的10倍，備用；采用C18制備色譜柱，在流動相乙腈-水體積比為 1:1，流速3 mL/min條件下，精密吸取上述制備的溶液，進樣lmL，分離精制，395nm波長檢 測，總運行時間25 min，收集22. 5-23. 5 min的洗脫液，減壓干燥，得到淡黃色無定形粉末， 即 Hypholomine B 精制品。
[0011] 上述的方法制備的Hypholomine B化合物用于用于作為桑黃藥材的質量評價與質 量控制的指標成分，或者用于制備抗炎、抗氧化等藥物的主成分。
[0012] 本發明由于采用了上述的技術方案，提供了桑黃中的一種單體成分：Hypholomine B及其制備方法和應用，具體來說，本發明的方法可以實現桑黃中單體成分Hypholomine B 化合物的批量制備，該化合物為hispidin的衍生物，具有顯著的抗氧化、抗炎的功效，被廣 泛用于保健品、化妝品中。同時，本發明的化合物為桑黃醇提取物中主成分，在桑黃醇提取 物特征圖譜中峰位居中，吸收最高（395 nm條件下)，與鄰峰分離度好，能夠作為指標成分， 進行桑黃藥材的質量評價與質量控制，為桑黃的實驗研究及研發提供物質基礎。
[0013] 本發明的有益效果是： 1、提取分離采用的技術手段新 高速逆流色譜技術是目前中藥與天然藥物化學研究領域較為先進的分離技術，與傳統 的柱分離方法以及溶劑萃取方法相比，分離效率及分離效果均有明顯的優勢。本方法在溶 劑粗提的基礎上，采用高速逆流色譜技術，在技術手段上具有先進性。
[0014] 2、分離效率高 本方法采用乙醇提取，溶劑萃取的方式得到桑黃乙醇提取石油醚：乙酸乙酯（1:1，V/ v)混合溶劑萃取物，進一步采用高速逆流色譜技術，半制備液相純化，分離得到純度95%以 上的單體成分，基本達到含量測定標準物質的純度要求。本方法省略了反復液-液萃取以 及柱分離過程，簡化分離流程，節約了大量的溶劑處理時間。在不到一天的分離流程內，能 夠達到毫克級單體成分的制備能力。
[0015] 3、方法穩定可重復 本方法在液-液萃取的基礎上，采用高速逆流色譜及半制備液相色譜儀，完成單體成 分純化精制的關鍵環節，與傳統反復液-液萃取、柱分離制備方法相比，方法穩定，可重復 性好。
[0016] 4、技術應用前景良好 藥物及保健品的研發是研究重點領域，本發明建立的單體制備方法，能夠為批量生產 單體物質提供技術與方法，為后續的藥效學研究，藥材質量控制標準研究及藥物研發提供 基礎。具有良好的應用前景。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1為實施例1制備的Hypholomine B的結構式。
[0018] 圖2為實施例1制備的Hypholomine B的液質分析圖。
[0019] 圖3為實施例1制備的Hypholomine B的高速逆流色譜圖。
[0020] 圖4為實施例1制備的Hypholomine B的半制備液相色譜圖。
[0021] 圖5為實施例1制備的Hypholomine B的單體HPLC純度檢測圖。
[0022] 圖6為桑黃醇提取物HPLC特征圖譜。
[0023] 圖7為不同來源、產地桑黃藥材的HPLC指紋圖譜。 【具體實施方式】
[0024] 實施例1 Hypholomine B化合物的制備純化方法，該方法包括以下的步驟： 1)取桑黃藥材，粉碎成蠶豆大顆粒，精密稱取1000 g，加入8000 mL質量濃度為60%的 乙醇水溶液，浸泡15 min，超聲提取30 min，濾過；濾渣再加8000 mL質量濃度為60%的乙 醇水溶液，超聲提取30 min，濾過；濾渣再次加8000 mL質量濃度為60%的乙醇水溶液，超 聲提取30 min，濾過；合并3次濾液，減壓濃縮，得到醇提取物粉末50. 8 g。
[0025] 2)取步驟1)中醇提取物10 g，加500 mL20%乙醇溶液充分溶解，轉移至分液漏斗 中；加入500 mL實現配好的石油醚：乙酸乙酯（3:1，v/v)混合溶液，振搖萃取；靜置分層； 分取下層水液，上層棄去；下層水液再加500 mL同種混合溶劑萃取；棄去上層，得石油醚： 乙酸乙酯（3:1，v/v)混合溶液除雜后的溶液。
[0026] 3)取步驟2)的下層溶液液，體積約540 mL,加入540mL石油醚：乙酸乙酯（3:1, v/v)混合溶液，振搖萃取；靜置分層；分取上層溶液，下層重復采用同樣的萃取過程，重復 萃取2次；合并3次萃取的上層溶液；50°C水浴蒸干。10g醇提取按此操作共得到約1. 66 g 殘渣，冷藏備用； 4) 精密量取石油醚200 mL、乙酸乙酯340 mL、甲醇200 mL和純水400 mL，配制體積比 1:1. 7:1:2的混合溶液，充分振搖后靜置3 h，上下兩層完全分層澄清，分離上下層，得到上 相溶液與下相溶液，分別超聲脫氣30 min，備用； 5) 取步驟3)的殘渣20 mg，取步驟4)的下相溶液10 mL，溶解殘渣，溶液用0.45 Mm孔 徑的微孔濾膜濾過，濾液備用； 6) 取步驟4)的上相溶液，泵入高速逆流色譜儀分離管，待固定相充滿整個分離管后，調 節主機為正轉，至最大轉速（800 r/min)，同時將步驟3)的下相溶液泵入，待流動相從柱口 流出且固定相不流出，兩相溶劑在分離管中達到動態平衡后，取步驟5)的濾液10 mL，注入 進樣閥，流速2.5 mL/min的條件下，395 nm波長下檢測，分離樣品，總分析時間200 min，每 15 min收集1個流分；合并其中60-70 min內所收集的流分，約25 mL，減壓回收溶劑，同次 操作最后合并共得到干粉29. 5mg，備用； 7) 取步驟6)的干粉29. 5 mg，加29. 5mL50%的乙腈水溶液完全溶解，0.45 μ m濾膜過 濾，備用； 8) 利用制備型高效液相色譜儀，采用C18制備色譜柱（10 mmX250mm，5 Mm)，設置流動 相乙腈（A相)-水（B相)體積比為1:1，流速3 mL/min條件下，取步驟7)的溶液，進樣2 mL, 395 nm波長檢測，分離樣品，總運行時間25 min,收集12. 5-23. 5 min的洗脫液，減壓干燥， 步驟6)的溶液經15次進樣，得到淡黃色無定形粉末，即Hypholomine B，約15 mg。HPLC純 度檢測含量為95%。
[0027] 桑黃藥材質量評價應用 1) 取采用本發明制備的單體成分-Hypholomine B，加甲醇配制成質量濃度為0. lmg/mL 的溶液，備用； 2) 取全國各主產區桑黃藥材樣品粗粉，精密稱定，加質量濃度為60%的乙醇溶液，浸泡 15min，超聲提取30min，提取液以0. 45 Mm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液，備用； 3) 利用分析型高效液相色譜儀，采用C18柱（4.6 mmX250 mm，5 Mm)，柱溫30°C，以甲 醇（A相)、0. 2%磷酸水溶液（B相）為流動相。梯度洗脫程序：0-20 min，A相30-40% ;20-30 min，A 相 30-40% ;30-45 min，A 相 45% ;45-60 min，A 相 45-55%，流速 lmL/min，395 nm 波 長下檢測，分別吸取步驟1)的Hypholomine B溶液1〇μ?，步驟2)的桑黃藥材供試品溶液 各1〇μ?，進樣分析，得到不同樣品的HPLC特征圖譜(見發明附圖7)。各樣品色譜圖中，在 與Hypholomine Β相同保留時間位置，為藥材中所含Hypholomine Β的色譜峰，根據該峰 面積，計算不同藥材中Hypholomine B的含量，結果見表1，可以直觀地比較不同樣品中 Hypholomine B的含量，從而評價不同藥材的質量。
[0028] 表1.不同來源及產地桑黃藥材中Hypholomine B的含量
【權利要求】
1. 火木層孔菌桑黃中單體成分Hypholomine B的制備方法，其特征在于該方法包括以 下的步驟： 1) 桑黃藥材粉碎，采用60%體積百分比濃度的乙醇水溶液超聲提取； 2) 乙醇提取物經第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第一石油醚和乙酸乙酯混合溶 液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為3:1，棄去； 3) 分取2)中下層溶液經第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液萃取，第二石油醚和乙酸乙 酯混合溶液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為1:1 ;取上層萃取液，濃縮，干燥，得到萃取物 干粉； 4) 制備流動相，流動相采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系，精密計量體積，配制成 體積比為1:1. 7:1:2的混合溶液，充分振搖后靜置3 h，上下兩層完全分層澄清，分離上下 層，得到上相溶液與下相溶液，分別超聲脫氣30 min，備用； 5) 取萃取物干粉，精密稱重，取下相溶液，體積相當于萃取物干粉質量數的10倍量，溶 解萃取物干粉，用〇. 45 Mm孔徑的微孔濾膜濾過，濾液備用；取上相溶液，泵入高速逆流色 譜儀分離管，待固定相充滿整個分離管后，調節主機為正轉，至800 r/min轉速，同時將下相 溶液泵入，待流動相從柱口流出且固定相不流出，兩相溶劑在分離管中達到動態平衡后，取 濾液10mL，注入進樣閥進樣，流速2. 5 mL/min的條件下，395 nm波長下檢測，分離樣品，總 分析時間200 min，每15 min收集1個流分；合并其中60-70 min時間段內所收集流分，減 壓回收溶劑，得到單體化合物Hypholomine B的干粉。
2. 根據權利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于：步驟1)中 取桑黃藥材，粉碎成蠶豆大顆粒，加入相當于8倍藥材質量的濃度為60 %的乙醇水溶液，浸 泡15 min，超聲提取30 min，濾過，該過程重復三次合并3次濾液，減壓回收溶劑，得到干燥 粉末，備用。
3. 根據權利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于：步驟2)中 取步驟1)的乙醇提取物，20%乙醇水溶液充分溶解，轉移至分液漏斗中，放冷；加入同體積 的第一石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振搖萃取；靜置分層；分取下層水液，棄去上層；下層 水液采用同樣的萃取過程，重復萃取1次；棄去上層，得石油醚乙酸乙酯混合溶液萃取去雜 后的水液，備用。
4. 根據權利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于：步驟3)中 取步驟2)的下層溶液，加入等體積的第二石油醚和乙酸乙酯混合溶液，振搖萃取；靜置分 層；分取上層，下層水液采用同樣的萃取過程，重復萃取2次；合并3次的萃取液；50°C水浴 蒸干，殘渣冷藏備用。
5. 根據權利要求1所述的Hypholomine B化合物的制備方法，其特征在于該方法還 包括精制步驟：取制備的干粉，加50%乙腈水溶液充分溶解，體積相當于干粉質量數的10 倍，備用；采用C18制備色譜柱，在流動相乙腈-水體積比為1:1，流速3 mL/min條件下， 精密吸取上述制備的溶液，進樣lmL，分離精制，395nm波長檢測，總運行時間25 min,收集 22. 5-23. 5 min的洗脫液，減壓干燥，得到淡黃色無定形粉末，即Hypholomine B精制品。
【文檔編號】C07D493/04GK104059080SQ201410112506
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2014年3月24日
【發明者】董宇, 李洪玉, 壽旦, 張揚, 俞忠明 申請人:浙江省中醫藥研究院