一種雙水相體系分離富集牡丹花色苷的方法
【專利摘要】本發明屬于天然產物有效成分的分離純化領域，特別公開了一種雙水相體系分離富集牡丹花色苷的方法。本發明將牡丹鮮花低溫烘干粉碎，加入由乙醇和硫酸銨構成的雙水相體系，并添加蔗糖和有機酸作為花色苷的穩定劑，冰水浴條件下進行磁力攪拌，離心得上相、下相以及牡丹花殘渣，進一步對殘渣和下相進行多次萃取，然后合并上相進行醇沉除雜和萃取除雜，真空濃縮得牡丹花色苷。本發明采用雙水相體系條件溫和，提取時間短，有機相易回收，提取成本低，易于工業化放大生產。
【專利說明】一種雙水相體系分離富集牡丹花色苷的方法
[0001] (一）【技術領域】 本發明屬于天然產物有效成分的分離純化領域，特別涉及一種雙水相體系分離富 集牡丹花色苷的方法。
[0002] (二）【背景技術】 牡丹又名鹿亜、白術、木巧藥，屬巧藥科、巧藥屬的多年生 落葉灌木。菏澤市是著名的牡丹之鄉，是全國乃至全世界最大的牡丹栽培中心和種質資源 中心，栽培面積達0.8萬公頃。伴隨著牡丹產業的迅速發展，對花卉種植地區的旅游業和經 貿業起到一定的促進作用，但是受到花期和氣候條件的限制，形成了花開時經貿和旅游活 動繁榮，花落時慘淡經營的不良局面，并且由于深加工技術的落后，每年有成千上萬噸的牡 丹花被白白地浪費在田間地頭。
[0003] 花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結合形成的一種化合物，其廣泛存在于植物的花、 果實、莖、葉等組織器官的細胞液中，使其呈現由紅、紫紅到蘭等不同顏色。牡丹花瓣中 含有豐富的花色苷類成分，經鑒定主要為：矢車菊-3-0-葡萄糖苷、矢車菊_3, 5-0-二葡 萄糖苷、天竺葵-3-0-葡萄糖苷、天竺葵-3, 5-0-二葡萄糖苷、芍藥-3-0-葡萄糖苷和芍 藥-3, 5-0-二葡萄糖苷。大量文獻研究表明花色苷類成分具有多種生理藥理功效，包括清 除自由基、抗突變、抗發炎、抗癌、抗病毒、抗菌、抗過敏、防止血管舒張、預防糖尿病、保護胃 黏膜、緩解眼疲勞、抑制脂質過氧化和血小板凝集等。花色苷作為一種安全、無毒的天然色 素，對人體具有多種保健功能，被廣泛應用于食品、保健品、化妝品、醫藥等行業。
[0004] 花色苷易溶于水、甲醇、乙醇等溶劑，傳統提取方法包括水提、有機溶劑浸提，或以 超聲、微波、酶法進行輔助提取，但此類方法所需溶劑量大、提取時間長，設備要求高，提取 物中雜質較多，還需進一步分離純化，不利于工業化放大生產，此外，花色苷穩定性差，提取 過程中易受溫度、pH、金屬離子等外界因素的影響而褐變或降解，導致提取率相對較低。
[0005] 雙水相萃取技術始于20世紀60年代，傳統的雙水相包括雙聚合物體系、聚合物/ 葡萄糖體系、聚合物/無機鹽體系等，但由于高聚物價格昂貴、粘度大、回收處理困難，無法 適應工廠化大規模生產，近年來，小分子親水醇/鹽雙水相萃取在生物分離純化方面成為 研究的熱點，相對于傳統高聚物雙水相萃取其具有分相快、效果好、有機相易回收、成本低 等優點，此外雙水相萃取條件溫和，有利于分離過程中花色苷的結構穩定性。
[0006](三）
【發明內容】
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種條件溫和、提取時間短、成本低的雙水相 體系分離富集牡丹花色苷的方法。
[0007] 本發明是通過如下技術方案實現的： 一種雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，以牡丹鮮花為原料，包括如下步驟： (1) 將牡丹鮮花于35-40°C下低溫烘干至恒重，粉碎至40-60目，得到牡丹花干粉； (2) 將硫酸銨溶于蒸餾水中，然后添加無水乙醇，充分震蕩混勻，構成雙水相體系； (3) 在雙水相體系中添加牡丹花干粉、蔗糖和有機酸，調節pH為3-4,在冰水浴條件下 進行磁力攪拌，冷凍離心，得到上相、下相以及牡丹花殘渣，取牡丹花殘渣，重復上述步驟； (4) 取分離所得的下相溶液和牡丹花殘渣，分次添加無水乙醇進行多級萃取，調節pH 為3-4,在冰水浴條件下進行磁力攪拌，離心，合并多級萃取和首次萃取所得的上相溶液； (5) 在上相溶液中添加5倍體積的無水乙醇，0-4°C避光靜置24h，過濾，醇沉除去蔗糖 以及殘留在上相中的雜質； (6) 真空濃縮除去上相中的乙醇，用蒸餾水對固形物進行分散，用乙醇和正丁醇的混合 溶液對牡丹花色苷進行萃取，最后得到產品。
[0008] 本發明將牡丹鮮花低溫烘干粉碎，加入由乙醇和硫酸銨構成的雙水相體系，并添 加蔗糖和有機酸作為花色苷的穩定劑，冰水浴條件下進行磁力攪拌，離心得上相、下相以及 牡丹花殘渣，進一步對殘渣和下相進行多次萃取，然后合并上相進行醇沉除雜和萃取除雜， 真空濃縮得牡丹花色苷。
[0009] 本發明包括原料預處理、建立雙水相體系、萃取分離牡丹花色苷、多級萃取、醇沉 除雜、萃取除雜等步驟。
[0010] 本發明的更優技術方案為； 步驟（2)中，無水乙醇和蒸餾水的體積比為1:1. 5-2. 5,硫酸銨在雙水相體系中的質量 分數為10-14%。
[0011] 步驟（2)中，震蕩次數為3次，每次30s。
[0012] 步驟（3)中，牡丹花干粉與雙水相體系的料液比為lg:30-50mL，蔗糖在雙水相體 系中的濃度為20-50mg/mL，有機酸的濃度為0. 05-0.Imol/mL，有機酸為丙二酸、單寧酸和 草酸中的一種或多種。
[0013] 步驟（3)和（4)中，磁力攪拌時間為1.5-3h，冷凍離心溫度為4°C，轉速為5000r/ min，時間為5min。
[0014] 步驟（3)中，牡丹花殘渣重復萃取的次數為2-3次。
[0015] 步驟（4)中，多級萃取過程中，無水乙醇的添加量與下相溶液的體積比為 0. 5-0. 75:1，萃取次數為2-4次。
[0016] 步驟（6)中，蒸餾水的添加量為固形物質量的40倍，萃取相混合溶液中乙醇和正 丁醇的體積比為1:3,萃取相與水相的體積比為1:1,萃取次數為2-3次。
[0017] 本發明花色苷含量的測定采用分子示差法。
[0018] 本發明的有益效果是： (1) 采用雙水相體系對牡丹花色苷進行分離富集，使花色苷類成分集中在上層有機相， 而多糖等雜質主要集中下層水相，達到邊提取邊純化的目的； (2) 花色苷在溶解狀態下穩定性較差，在提取過程中易受溫度、pH、金屬離子等外界因 素的影響而降解，在雙水相體系中添加穩定劑可最大程度保證花色苷的穩定性，提高花色 苷得率。糖可通過減小水分活度或水分可利用程度而穩定花色苷，起到護色作用，有機酸作 為輔色劑可通過離子相互作用、疏水作用及范德華力與花色苷形成穩定性強的復合物，防 止親核集團的攻擊而褪色； (3) 通過改變上相的極性對下相和牡丹花殘渣進行多級萃取，可獲得不同極性的花色 苷，使花色苷的萃取更加完全； (4) 雙水相體系條件溫和，提取時間短，有機相易回收，提取成本低，易于工業化放大生 產。
[0019] (四）【具體實施方式】 下面結合實施例對本發明的方法作進一步說明，但不限于此。
[0020] 實施例1: (1)乙醇與水添加比例的選擇 考察有機相添加量時，一般要求最后形成的雙水相體系相比接近于1，這樣有利于物質 的分離。分別添加體積比1:1. 5、1:1· 75、1:2、1:2· 25、1:2· 5、1:2· 75、1:3的乙醇和水混合 溶液，硫酸銨添加量接近飽和狀態，充分振蕩搖勻，構成雙水相體系，按原料與體系之比為 l:40(g/mL)加入牡丹花干粉，添加蔗糖、丙二酸、單寧酸作為穩定劑，使其濃度分別為20mg/ mL、0. 075mol/L、0. 075mol/L，調節pH為3,冰水浴條件下磁力攪拌2h，然后4°C條件下冷凍 離心5min，測定上相中花色苷含量，計算花色苷提取率分別為I. 70wt%，I.68wt%，I. 65wt%， I. 56wt%，I. 44wt%，I. 25wt%。實驗結果表明，隨著乙醇與水體積比的減小，上相中花色苷提 取率逐漸減小。原因可能是由于乙醇比例較低時，形成的雙水相體系相比較小，不利于花色 苷的萃取。考慮乙醇使用成本以及實際萃取效果，選擇乙醇與水體積比為1:2進行后續實 驗。
[0021] (2)硫酸銨添加量的選擇 在圓底燒瓶中添加體積比1:2的乙醇和水混合溶液，添加不同質量的硫酸銨作為分相 鹽，使其在整個體系中的濃度分別為10% (g/mL)，ll% (g/mL)，12% (g/mL)，13% (g/mL)，14% (g/mL)，15% (g/mL)，充分振蕩搖勻，構成雙水相體系，原料和穩定劑添加量同（1)，調節pH 為3,冰水浴條件下磁力攪拌2h，然后4°C條件下冷凍離心5min，測定上相中花色苷含量，計 算花色苷提取率分別L 57wt%，I. 64wt%，I. 73wt%，I. 74wt%，I. 69wt%，I. 65wt%。實驗結果表 明，隨著硫酸銨添加量的增加，花色苷提取率先增加后減少，硫酸銨濃度為12% (g/mL)和 13% (g/mL)時，提取率最高，且相差不大。原因是由于隨著分相鹽添加量的增加，雙水相體 系的分相能力逐漸增強，上下相物理化學性質的差別趨于顯著，有利于花色苷與多糖等雜 質的分離；但分相鹽添加量過大時，下相易析出晶體，雙水相體系不穩定，影響花色苷的萃 取。
[0022] (3)雙水相體系pH值的選擇 在圓底燒瓶中添加體積比1:2的乙醇和水混合溶液，以硫酸銨為分相鹽，使其在體系 中的濃度為12% (g/mL)，充分振蕩搖勻，構成雙水相體系，原料和穩定劑添加量同（1)，分別 調節pH至3、4、5、6、7,冰水浴條件下磁力攪拌2h，然后4°C條件下冷凍離心5min，測定上相 中花色苷含量，計算花色苷提取率分別為I. 73wt%，I. 72wt%，I. 56wt%，I. 50wt%，I. 44wt%。實 驗結果表明隨著pH值升高，花色苷提取率逐漸降低，pH值為3和4條件下，花色苷提取率 最高，且相差不大，原因可能是花色苷在強酸性條件下以黃烊鹽陽離子狀態存在，呈穩定的 紅色，隨著PH增加，花色苷會形成無色的甲醇堿。
[0023] (4)穩定劑添加量的選擇 在圓底燒瓶中添加體積比1:2的乙醇和水混合溶液，以硫酸銨為分相鹽，使其在體系 中的濃度為12% (g/mL)，充分振蕩搖勻，構成雙水相體系，原料添加量同（1)，穩定劑的添 加比例及添加量如下表所示，調節pH至4,冰水浴條件下磁力攪拌2h，然后4°C條件下冷 凍離心5min，測定上相中花色苷含量，計算花色苷提取率，實驗結果如表所示，蔗糖、丙二 酸、單寧酸的添加量分別為30mg/mL、0.050m〇l/L、0.lOOmol/L時，花色苷提取率最高，為 I. 81wt%〇
[0024] 穩定劑對花色苷提取率的影響
【權利要求】
1. 一種雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，以牡丹鮮花為原料，其特征為，包括如下步 驟：（1)將牡丹鮮花于35-40°C下低溫烘干至恒重，粉碎至40-60目，得到牡丹花干粉；（2) 將硫酸銨溶于蒸餾水中，然后添加無水乙醇，充分震蕩混勻，構成雙水相體系；（3)在雙水 相體系中添加牡丹花干粉、蔗糖和有機酸，調節pH為3-4,在冰水浴條件下進行磁力攪拌， 冷凍離心，得到上相、下相以及牡丹花殘渣，取牡丹花殘渣，重復上述步驟；（4)取分離所得 的下相溶液和牡丹花殘渣，分次添加無水乙醇進行多級萃取，調節pH為3-4,在冰水浴條件 下進行磁力攪拌，離心，合并多級萃取和首次萃取所得的上相溶液；（5)在上相溶液中添加 5倍體積的無水乙醇，0_4°C避光靜置24h，過濾，醇沉除去蔗糖以及殘留在上相中的雜質； (6)真空濃縮除去上相中的乙醇，用蒸餾水對固形物進行分散，用乙醇和正丁醇的混合溶液 對牡丹花色苷進行萃取，最后得到產品。
2. 根據權利要求1所述的雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步驟 (2) 中，無水乙醇和蒸餾水的體積比為1:1.5-2. 5,硫酸銨在雙水相體系中的質量分數為 10-14%。
3. 根據權利要求1所述的雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步驟（2) 中，震蕩次數為3次，每次30s。
4. 根據權利要求1所述的雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步驟 (3) 中，牡丹花干粉與雙水相體系的料液比為lg:30-50mL，蔗糖在雙水相體系中的濃度為 20-50mg/mL，有機酸的濃度為0. 05-0. Imol/mL，有機酸為丙二酸、單寧酸和草酸中的一種或 多種。
5. 根據權利要求1所述的雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步驟（3)和 (4) 中，磁力攪拌時間為1. 5_3h，冷凍離心溫度為4°C，轉速為5000r/min，時間為5min。
6. 根據權利要求1所述的雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步驟（3) 中，牡丹花殘渣重復萃取的次數為2-3次。
7. 根據權利要求1所述的雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步驟（4) 中，多級萃取過程中，無水乙醇的添加量與下相溶液的體積比為0.5-0. 75:1，萃取次數為 2-4 次。
8. 根據權利要求1所述的雙水相分離富集牡丹花色苷的方法，其特征在于：步驟（6) 中，蒸餾水的添加量為固形物質量的4 0倍，萃取相混合溶液中乙醇和正丁醇的體積比為 1:3,萃取相與水相的體積比為1:1,萃取次數為2-3次。
【文檔編號】C07H17/065GK104341473SQ201410496565
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】王成忠, 袁亞光, 趙曉紅 申請人:齊魯工業大學