專利名稱：一種雙水相體系富集分離紅車軸草異黃酮類物質的方法
技術領域：
本發明屬雙水相體系富集分離紅車軸草異黃酮類物質的方法。
背景技術：
紅三葉也稱紅車軸草(Trifolium. Pratense. L)，為豆科(Leguminosae)車軸草 (Trifolium. L)屬多年生草本植物。原產于小亞西亞及歐洲西南部，是歐洲、美國東部、新西蘭等海洋性氣候地區的最重要的牧草和飼料之一，我國南北各地均有栽培。岷縣于1944 年由美國引進紅三葉，已有60余年的種植歷史，經多年的馴化、選育，現已成為當地的優勢草種。由于岷山紅三葉蛋白質含量高、營養豐富，1987年經全國飼料牧草品種審定委員會審定登記并命名為岷山紅三葉，并被譽為中國第一草。研究表明，岷山紅三葉是重要的藥材，含豐富的異黃酮類物質，因其獨特的藥用價值，已由牧草型向藥用型發展，該草的主要異黃酮成分為鷹嘴豆芽素A(bionchanin Α)和 B (formonetin)、芒柄花素(Formononetin)、朿Ij芒柄花苷(Ononin)、染料木素(genistein)、 大豆素(daidzein)、大豆甙元、大豆甙、染料木甙等，其中以鷹嘴豆芽素A和芒柄花素含量最尚。異黃酮的主要作用是調節人體的內分泌，防止婦女更年期綜合癥，降低血脂，減少冠心病的發生、防止骨質疏松癥、抗癌、止痛消腫、保護神經系統、抗感染、延緩衰老等。異黃酮類物質在醫學上具有多種用途，是一種很有價值的藥物原料，但是其提取工藝報導得還很少，尤其是完整的提取工藝還未見到。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種產品的安全性高、生產成本低、適合產業化開發的富集分離紅車軸草異黃酮類物質的方法。本發明以如下技術方案解決上述技術問題將紅車軸草干燥、粉碎、乙醇回流提取、過濾除雜濃縮得紅車軸草粗提液的濃縮液，用雙水相體系富集分離此濃縮液中的異黃酮類物質，上相液處理后真空干燥得到紅車軸草異黃酮類物質；其特征是取上述紅車軸草粗提液的濃縮液，按以下比例加入硫酸銨和乙醇濃縮液體積占濃縮液和乙醇體積之和的70 90%;液體體積(mL)硫酸銨質量(g) 為100 15 31 ；加熱至40°C 45°C，混勻，靜置1 3h，分為上、下兩相，將上相、下相分開，下相降溫、結晶，過濾得硫酸銨晶體供循環使用；上相液加無水乙醇沉淀除殘存雜質后回收乙醇，上清液濃縮真空干燥即得紅車軸草異黃酮類物質。應用乙醇-硫酸銨雙水相富集分離紅車軸草異黃酮類化合物，具有明顯的優點(1)分相迅速在實驗中觀察到，采用乙醇-硫酸銨雙水相富集分離法，紅車軸草粗提液的濃縮液、硫酸銨和乙醇按合適比例加入加熱，混勻后，約10分鐘左右即可分相(不需要離心分離)，且沒有乳化層，縮短了實驗周期。
⑵過程集成乙醇-硫酸銨雙水相富集分離既達到了初步純化的目的，又濃縮了料液。表現為雜質(如親水性物質糖、蛋白質等)進入下相，異黃酮類物質富集在上相，上相較原始處理液減少，異黃酮濃度和純度都提高。(3)降低物耗本發明方法用乙醇作為雙水相的有機溶劑，毒性小，乙醇和硫酸銨容易回收利用， 大大降低了原材料的消耗。(4)用本發明的方法紅車軸草異黃酮類物質的回收率高，生產方法簡單，易于掌握，不受環境影響；成本低廉，適合產業化生產。
具體實施例方式實施例1(1)紅車軸草異黃酮類物質的提取紅車軸草烘干、粉碎，以料液比1 9 (g/mL)加入Φ (C2H50H) = 70%乙醇溶液，回流提取4次，每次1.證，過濾除雜后得到紅車軸草粗提液，真空濃縮至原體積的約1/6得濃縮液。(2)紅車軸草異黃酮類物質的雙水相富集分離取紅車軸草濃縮液9mL，加入硫酸銨3. Ig和乙醇ImL混勻，45 V水浴2h，期間不斷振搖，分相后趁熱分開上下相，冷卻至室溫量取上下相體積，分別為3. 36mL和8. OOmL, 相比(上下相體積比，下同)0. 420。分別測定(分光光度法，下同)上相液的異黃酮濃度為7380. 110mg/L，下相液的異黃酮濃度為259. 43%ig/L，異黃酮在上下相的分配系數為 28. 447，總異黃酮的收率達92.。將下相降溫、結晶，過濾，過濾所得硫酸銨晶體供循環使用。(3)上相液用無水乙醇純化、濃縮、干燥得成品將上相液加5倍體積無水乙醇沉淀除去硫酸銨等殘存雜質后，上層清液旋轉真空蒸發回收乙醇循環使用，所得濃縮液70°C下真空干燥即得到紅車軸草異黃酮類物質成品 (0. 151 )。實施例2(1)紅車軸草異黃酮類物質的提取紅車軸草烘干或陰干、粉碎，以料液比1 9 (g/mL)加入Φ (C2H50H) = 70%乙醇溶液，回流提取4次，每次1. 5h，過濾除雜后得到紅車軸草粗提液，真空濃縮至原體積的約 1/6得濃縮液，測定濃縮液異黃酮濃度為3238. Ollmg/L。(2)紅車軸草異黃酮類物質的雙水相富集分離取紅車軸草濃縮液16mL，加入硫酸銨5. 2g和乙醇4mL混勻，40°C水浴3h，期間不斷振搖，分相后趁熱分開上下相，冷卻至室溫量取上下相體積，分別為10. OOmL和 12. 20mL，相比0. 820。測定上、下相液的異黃酮濃度分別為4520. 44mg/L和156. 053mg/L, 異黃酮在上下相的分配系數為28. 967，總異黃酮的收率達95. 96%。將下相降溫、結晶，過濾，所得硫酸銨晶體供循環使用。(3)上相液加無水乙醇純化、濃縮、干燥得成品
將上相液加4倍體積無水乙醇沉淀除去硫酸銨等殘存雜質后，上層清液旋轉真空蒸發回收乙醇循環使用，所得濃縮液60°C下真空干燥即得到紅車軸草異黃酮類物質成品 (0. 2958g)。
權利要求
1. 一種富集分離紅車軸草異黃酮類物質的方法，將紅車軸草干燥、粉碎、乙醇回流提取、過濾除雜濃縮得紅車軸草粗提液的濃縮液，用雙水相體系富集分離此濃縮液中的紅車軸草異黃酮類物質，上相液處理后真空干燥得到紅車軸草異黃酮類物質；其特征是取上述紅車軸草粗提液的濃縮液，按以下比例加入硫酸銨和乙醇濃縮液體積占濃縮液和乙醇體積之和的70 90% ；液體體積mL 硫酸銨質量g為100 15 31，加熱至40°C 45°C， 混勻，靜置1 3h，分為上、下兩相，將上相、下相分開，下相降溫、結晶，過濾得硫酸銨晶體供循環使用；上相液加無水乙醇沉淀除殘存雜質后回收乙醇，上清液濃縮真空干燥即得紅車軸草異黃酮類物質。
全文摘要
一種雙水相體系富集分離紅車軸草異黃酮類物質的方法，先將紅車軸草干燥、粉碎，回流提取、除雜后得到紅車軸草粗提液，濃縮后按比例加入硫酸銨和乙醇，加熱，混勻，分為上、下兩相，異黃酮類物質主要分配在含乙醇的上相，并得到濃縮和純化。將上、下兩相分開后，下相降溫、結晶、過濾，回收硫酸銨晶體；上相液加無水乙醇沉淀除去硫酸銨等殘存雜質后回收乙醇，濃縮液真空干燥得產品。本方法的優點是分相迅速，過程集成，提高了紅車軸草異黃酮類物質在上相的濃度和純度；物耗降低，毒性小，乙醇和硫酸銨易回收利用；且紅車軸草異黃酮類物質的回收率高，生產方法簡單，易于掌握，不受環境影響；成本低廉，適合產業化生產。
文檔編號A61P25/00GK102406693SQ20111037174
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者畢云英 申請人:威海天泓農業科技有限公司