專利名稱：：對氨基苯甲酰殼聚糖及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種殼聚糖化學改性的功能衍生物，其應用于食品行業，屬于高分子化學領域。殼聚糖是甲殼素的脫乙酰化產物，是生物界中大量存在的唯一一種帶有陽離子的堿性多糖。因分子內和分子間氫鍵的作用，殼聚糖只溶于酸和酸性水溶液。殼聚糖分子鏈上含有大量的羥基、氨基等可修飾的基團，可通過化學改性得到各種具有特殊功能的衍生物，因此可以擴大其應用范圍。例如，殼聚糖具有優良的生物降解性、生物相容性、成膜特性和較強的抗菌防腐保鮮能力，在食品工業等領域得到廣泛的應用。殼聚糖僅能溶解于酸性介質中，限制了其應用范圍。通常人們通過在殼聚糖分子上引入季銨鹽、烷基、無機酸等，改進殼聚糖的溶解性或絮凝性。將對氨基苯甲酰基接枝到殼聚糖分子鏈上，得到對氨基苯甲酰殼聚糖衍生物，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉為實驗菌種，對衍生物進行了抗菌活性研究，繪制了抑菌生長曲線，可望為該產物應用于食品防腐劑中提供實驗依據。通過酰氯與殼聚糖的酰化反應制備出對氨基苯甲酰殼聚糖衍生物，并對其進行抗菌作用研究，尚未見報道。本發明的目的是要克服殼聚糖不溶于水的缺點，提供一種具有抗菌效果的殼聚糖衍生物，可用作食品中抗菌防腐添加劑。本發明的另一目的是提供上述殼聚糖衍生物——對氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法。本發明的對氨基苯甲酰殼聚糖的結構為NH2其中，n在160-180之間，在殼聚糖分子鏈上引入對氨基苯甲酰基后，該化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的最低抑菌濃度分別達到0.1%，0.1%和1%。該化合物的物化
背景技術：
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發明內容指標淺黃色粉末狀固體，溶于水和乙二醇，分子量為45-50KD。本發明通過對氨基苯甲酸與氯化亞砜反應，制備出對氨基苯甲酰氯，然后與殼聚糖反應制備得到對氨基苯甲酰殼聚糖。取對氨基苯甲酸放入三頸瓶中，加入一定量的無水乙醚，再加入氯化亞砜，放入到水溫3(TC的超聲波洗滌器中，反應10分鐘；向三頸瓶中加入一定量的殼聚糖乙酸溶液，在5。C一45。C下超聲波振蕩1.5小時，然后靜置過夜；反應完成后，加入大量丙酮使產物沉淀出來，過濾，再用無水乙醇和無水乙醚的混合溶劑浸泡24小時后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進行索氏提取24小時，真空干燥后得產物。本發明涉及的主要反應有兩步(1)制備對氨基苯甲酰氯,2NH，+S0C12COOH(2)制備對氨基苯甲酰殼聚糖Q~C=0HCH2OH0—H\OHHyNH2HCH2OHH/l""^"Q「O-+」nc卜c-o所述對氨基苯甲酰殼聚糖化合物的制備方法，其制備步驟如下(1)將稱量的對氨基苯甲酸溶于50-65'C蒸餾水中，熱抽濾；(2)濾液冷卻到室溫，在室溫下抽濾；(3)取濾餅，真空干燥，得到純凈的對氨基苯甲酸；(4)將對氨基苯甲酸放入到三頸瓶中，加入無水乙醚使對氨基苯甲酸完全溶解，再加入氯化亞砜，放入到水溫為20-4(TC的超聲波洗滌器中，超聲波振蕩10-60分鐘，反應產物為對氨基苯甲酰氯；(5)冷卻(4)步的反應產物到0-3(TC，將殼聚糖溶于無水乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在5-45'C下超聲波振蕩1-3.5小時，靜置過夜；(6)將(5)步的反應產物加入丙酮直至產物對氨基苯甲酰基殼聚糖沉淀出來，抽濾；(7)將(6)步的沉淀用無水乙醇和無水乙醚的混合溶劑浸泡12-24小時后，抽濾，取濾餅；(8)再將(7)步的濾餅用丙酮進行索氏提取24-30小時，真空干燥后得到產物對氨基苯甲酰殼聚糖。所述的(l)步中抽濾的工藝條件是用濾瓶和布氏漏斗在50-65°〇烘箱中烘1-3小時，再在50-65'C下用水泵抽濾反應液，抽濾結束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中；所述的(2)、(6)和(7)步中抽濾的工藝條件都是用濾瓶和布氏漏斗在50-65'C烘箱中烘l-3小時，再在室溫下用水泵抽濾反應液，抽濾結束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中。所述的對氨基苯甲酸氯化亞砜殼聚糖的投料重量比為(l-5):(3-9):l。所述的(7)步的無水乙醇和無水乙醚的體積比為l:(i-io)。所述的(8)步的索氏提取的工藝條件為55-65"水浴加熱，提取24-30小時。所述的(8)步的真空干燥的工藝條件為30-5(TC下，真空度為8X10"Pa，干燥12-24小時。所述對氨基苯甲酰殼聚糖化合物作為制備食品防腐添加劑的應用。本發明的有益效果在于將對氨基苯甲酰基引入到殼聚糖分子上制備出的新型殼聚糖衍生物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉具有良好的抗菌活性，擴大了殼聚糖的抑菌范圍，可用作食品防腐添加劑。圖1為殼聚糖的紅外光譜圖。圖2為所制備的對氨基苯甲酰殼聚糖的紅外光譜圖。圖3為殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖乙酸溶液的紫外吸收光譜圖。圖4殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖對大腸桿菌生長的抑制作用圖。圖5殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用圖。圖6殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖對黑曲霉生長的抑制作用圖。具體實施方式實施例1:取干燥過的對氨基苯甲酸lg放入三頸瓶中，加入30ml的無水乙醚，再加入2ml氯化亞砜，放入到水溫30。C的超聲波洗滌器中，反應10分鐘。冷卻到25'C，0.5g殼聚糖溶于30ml乙酸中，將其加入三頸瓶中，在25'C下超聲波振蕩1小時，靜置過夜。反應完成后，加入70ml丙酮使產物沉淀出來，抽濾，再用50ml體積比為l:1的無水乙醇和無水乙醚的混合溶劑浸泡24小時后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進行索氏提取24小時，真空干燥后得產物——對氨基苯甲酰殼聚糖。實施例2:取干燥過的對氨基苯甲酸lg放入三頸瓶中，加入30ml的無水乙醚，再加入2ml氯化亞砜，放入到水溫30'C的超聲波洗滌器中，反應10分鐘。加熱到45'C，0.5g殼聚糖溶于30ml乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在45'C下超聲波振蕩1小時，靜置過夜。反應完成后，加入70ml丙酮使產物沉淀出來，抽濾，再用50ml體積比為l:1的無水乙醇和無水乙醚的混合溶劑浸泡24小時后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進行索氏提取24小時，真空干燥后得產物——對氨基苯甲酰殼聚糖。實施例3:取干燥過的對氨基苯甲酸lg放入三頸瓶中，加入30ml的無水乙醚，再加入2ml氯化亞砜，放入到水溫3(TC的超聲波洗滌器中，反應10分鐘。冷卻到5'C，0.5g殼聚糖溶于30ml乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在5'C下超聲波振蕩1小時，靜置過夜。反應完成后，加入70ml丙酮使產物沉淀出來，抽濾，再用50ml體積比為l:1的無水乙醇和無水乙醚的混合溶劑浸泡24小時后抽濾，再將抽濾后的濾餅用丙酮進行索氏提取24小時，真空干燥后得產物——對氨基苯甲酰殼聚糖。分析圖l和圖2兩幅紅外譜圖可見，殼聚糖紅外譜圖中1597.2cm—1處為氨基N-H變形振動峰，2875.7cm"處為C-H伸縮振動吸收峰，3417.7cm"處歸屬于殼聚糖分子中O-H伸縮振動和N-H伸縮振動的吸收峰，1082.4cm"處為C-OH的吸收峰；產物中出現1735.5cm"是C=0伸縮振動峰；1602.3cm'1和1517.8cm—1處是苯環的骨架振動吸收峰；1082.4cm"處的C-OH吸收峰沒有大的變化，可推知對氨基苯甲酰氯主要在殼聚糖的氨基上發生酰化反應。圖3為以lg/L的醋酸溶液為溶劑，將殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖制成濃度為1X10"VmL的溶液，測得的紫外吸收光譜圖。其中，2為殼聚糖的紫外吸收光譜圖，1為對氨基苯甲酰殼聚糖的紫外吸收光譜圖。從圖中可以看出，將對氨基苯甲酰基接到殼聚糖分子上，由于酰胺、碳氧雙鍵、苯環等生色團的影響，殼聚糖衍生物在284nm處有個大的吸收峰，即在284nm處有強的紫外線吸收峰值。實施例4:本發明所得產物對氨基苯甲酰殼聚糖和殼聚糖對大腸桿菌的抑菌效率(％)樣品濃度(％)0.50.250.10.080.050.0250.010.005殼聚糖100100979187736757對氨基苯甲酰殼聚糖1001001009693898372實施例5:本發明所得產物對氨基苯甲酰殼聚糖和殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發明所得產物對氨基苯甲酰殼聚糖和殼聚糖對黑曲霉的抑菌效率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述抑菌效率的測定配制不同質量分數的殼聚糖溶液和衍生物溶液(以0.5%的醋酸溶液為溶劑)。分別將0.1mL菌懸液和0.1mL不同濃度的樣品溶液均勻涂布在培養基平板上，空白為不加樣品溶液的菌懸液。所有平板在37'C恒溫培養箱中培養24h，取出觀察各個平板上的細菌生長情況，計算抑菌率-I-(m-n2)/n!X1000/0其中，m和ti2分別為空白和涂有樣品的平板上的菌落數。對于黑曲霉采用干重法測定殼聚糖和衍生物的抑菌效率。配制不同質量分數的殼聚糖溶液和衍生物溶液(以0.5%的醋酸溶液為溶劑)。分別將lmL黑曲霉菌懸液和2mL不同濃度的樣品溶液添加到沙氏培養基中，空白為不加樣品溶液的菌懸液，在28"C恒溫振蕩培養箱中培養48h，抽濾，干燥并稱菌體干重，計算抑菌率I二(m廣m2)/nuX1000/0其中，rm和m2分別為不加樣品培養液中和添加樣品培養液中的菌絲干重。抑菌活性實驗對于細菌采用比濁法，添加一定量的殼聚糖溶液和衍生物溶液分別于液體營養肉湯培養基中，使樣品濃度為0.01%，分別接入0.2mL濃度為1(^個/mL的菌懸液，在37"C恒溫振蕩培養，定時取樣測定吸光度值，用吸光度值的變化反映細菌數量的變化。以培養時間為橫坐標，不同培養時間細菌懸濁液在620nm下的吸光度OD值為縱坐標，繪制細菌的生長曲線和相同菌種在加入殼聚糖或衍生物后的抑菌曲線。以未接種細菌的液體營養肉湯培養基為空白。對于黑曲霉菌采用菌體干重法，添加一定量的殼聚糖溶液和衍生物溶液分別于沙氏培養基中，使樣品質量分數為0.01%，接入黑曲霉懸浮液lmL，在28'C恒溫振蕩培養。定時取8樣，用布氏漏斗抽濾，干燥并稱菌體干重。以培養時間為橫坐標，不同培養時間的菌體干重為縱坐標，繪制霉菌的生長曲線和相同菌種在加入殼聚糖或衍生物后的抑菌曲線。所得到的殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用曲線如圖4、圖5和圖6。圖4和圖5分別為殼聚糖和產物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的抑制作用曲線。從圖中可知殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖的存在顯著地抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在培養4h后便開始繁殖，吸光度增大，當添加殼聚糖后，生長適應期均延長為8h;當添加對氨基苯甲酰殼聚糖后，40h內培養基中的菌生長被抑制在一個較低水平，起到了很好的抑制作用。表明殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均具有抑制作用，且對氨基苯甲酰殼聚糖的抑菌效果優于殼聚糖。圖6為殼聚糖和對氨基苯甲酰殼聚糖對黑曲霉生長的抑制作用曲線。殼聚糖對黑曲霉不僅沒有抑制作用，反而有助于其生長。原因可能是黑曲霉屬于真菌類，真菌的細胞壁含有殼聚糖，而黑曲霉中就有較高的殼聚糖含量，使得黑曲霉對殼聚糖的抗菌性能有一定的抗性，決定了殼聚糖對黑曲霉沒有抑制能力，反而可能用于促進細胞的生長和繁殖。添加對氨基苯甲酰殼聚糖后，黑曲霉的菌體干重比對照組有所減少，說明產物可以有效地抑制黑曲霉的生長，擴大了殼聚糖的抑菌范圍。本領域的普通技術人員都會理解，在本發明的保護范圍內，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發明的保護范圍。權利要求1、對氨基苯甲酰殼聚糖，其特征在于該衍生物具有下式所示結構其中，n在160-180之間。2、一種如權利要求l所述對氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的制備步驟如下(1)將稱量的對氨基苯甲酸溶于50-65'C蒸餾水中，熱抽濾；(2)濾液冷卻到室溫，在室溫下抽濾；(3)取濾餅，真空干燥，得到純凈的對氨基苯甲酸；(4)取純凈的對氨基苯甲酸放入到三頸瓶中，加入無水乙醚使對氨基苯甲酸完全溶解，再加入氯化亞砜，放入到水溫為20-40'C的超聲波洗滌器中，超聲波振蕩10-60分鐘，反應產物為對氨基苯甲酰氯；(5)冷卻(4)步的反應產物到0-3(TC，將殼聚糖溶于無水乙酸中，再將其加入三頸瓶中，在5-45'C下超聲波振蕩1-3.5小時，靜置過夜；(6)將(5)步的反應產物加入丙酮直至產物對氨基苯甲酰基殼聚糖沉淀出來，抽濾；(7)再用無水乙醇和無水乙醚的混合溶劑浸泡12-24小時后，抽濾，取濾餅；(8)再將(7)步的該濾餅用丙酮進行索氏提取24-30小時，真空干燥后得對氨基苯甲酰殼聚糖產物。3、根據權利要求2所述對氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(l)步中抽濾的工藝條件是用濾瓶和布氏漏斗在50-65。C烘箱中烘1-3小時，再在50-65'C下用水泵抽濾反應液，抽濾結束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中；(2)、(6)和W步中抽濾的工藝條件都是用濾瓶和布氏漏斗在50-65。C烘箱中烘l-3小時，再在室溫下用水泵抽濾反應液，抽濾結束后，迅速把濾液倒入到干凈的燒杯中。4、根據權利要求2所述對氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的對氨基苯甲酸氯化亞砜殼聚糖的投料重量比為(l-5):(3-9):l。5、根據權利要求2所述對氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(7)步的無水乙醇和無水乙醚的體積比為1:(1-10)。6、根據權利要求2所述對氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(8)步的索氏提取的工藝條件為55-65'C水浴加熱，提取24-30小時。7、根據權利要求2所述對氨基苯甲酰殼聚糖的制備方法，其特征在于所述的(8)步的真空干燥的工藝條件為30-5(TC下，真空度為8xlO"Pa，干燥12-24小時。8、根據權利要求1所述對氨基苯甲酰殼聚糖作為制備食品防腐添加劑的應用。全文摘要本發明公開了一種對氨基苯甲酰殼聚糖及其制備方法，其結構如右所示，其中，n在160-180之間，在殼聚糖分子鏈上引入對氨基苯甲酰結構后，該化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的最低抑菌濃度分別達到0.1％，0.1％和1％。該化合物的物化指標淺黃色粉末狀固體，溶于水和乙二醇，分子量為45-50KD。對氨基苯甲酰殼聚糖增強了殼聚糖的抗菌活性，且擴大了殼聚糖的抗菌范圍，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉具有良好的抗菌活性，可作為制備食品中抗菌防腐添加劑的應用。文檔編號C08B37/08GK101649005SQ200910018199公開日2010年2月17日申請日期2009年9月9日優先權日2009年9月9日發明者王江濤,金曉曉申請人:中國海洋大學