專利名稱：一種溫敏性殼聚糖衍生物―羥戊基殼聚糖及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物材料技術領域，具體涉及一種溫敏性殼聚糖衍生物一輕戊基殼聚糖及其制備方法。
背景技術：
殼聚糖[Chitosan，(I, 4) _2_氨基_2脫氧-P -D-葡聚糖]是高分子量的多糖，它通過甲殼素部分脫乙酰化作用而獲得。生物界中每年生物合成的甲殼素估計有將近100億噸，是地球上數量僅次于纖維素的天然有機化合物，且主要由動物合成。20世紀中后期，國際上十分重視這一資源的開發和利用，其應用已經涉及到食品、醫藥、化工、環境保護及農業等許多部門和領域。但由于殼聚糖分子中-O-H--O-型 及-N-H---0-型的氫鍵作用，分子間的有序結構使結晶致密穩定，雖然可以溶于醋酸等某些酸性溶液中，但不能溶于一般的有機溶劑和水，當PH值>6. 5時，殼聚糖就會從溶液中析出，再加上醋酸的引入極大地影響到其生物安全性，這在很大程度上限制了它的推廣應用。因此，在殼聚糖分子內引入功能性基團改變或增加其溶解性和功能性，以拓寬其應用范圍，是殼聚糖應用開發的主要方向之一。因其分子中含有6-0H和-NH2等活性基團，于是就提供了化學修飾改性的基礎。現在有很多的修飾方法得到水溶性殼聚糖，如羧甲基殼聚糖、羥乙基殼聚糖、羥丙基殼聚糖、羥丁基殼聚糖、烷基化殼聚糖，經過改性的殼聚糖衍生物的水溶性得到了極大的提高，從而拓展了殼聚糖的應用范圍。溫敏性水凝膠是一類對外界溫度刺激能產生敏感響應的水凝膠，隨著溫度的變化水凝膠的狀態隨之發生變化，如由流動液態變為固態凝膠狀，或反之由固態轉變為液態等。由于溫敏性水凝膠的獨特響應性，在藥物載體、基因載體，組織工程，傳感器、人造肌肉、化學存儲器、分子分離體系等方面具有很好的應用前景，因而對這一類材料的研究引起越來越多科學家的注意。但現有的溫敏性水凝膠主要是一些嵌段共聚物，如聚異丙基丙烯酰類和聚乙二醇/聚(乳酸-Co-乙醇酸)類，這些材料雖然具有溫敏性，但存在著一些不足，如聚合度低、分子量小以及當溫度升高時會造成凝膠的相分離現象。針對嵌段共聚物分子量低以及聚合單體的殘留量高等缺陷，通過對高分子進行化學改性、接枝或共混，得到了一些高分子量的溫敏性水凝膠，如殼聚糖-聚乙二醇、羧甲基殼聚糖與聚乙烯醇的共混物等，但由于存在不同程度，工藝復雜，收率低，溫敏性較差，凝膠化溫度偏高，凝膠強度較低等缺點限制了其開發應用。已有專利及文獻報道稱殼聚糖衍生物-羥丁基殼聚糖具有較好的水溶性、溫敏性和細胞及生物相容性。其中包括本發明人所在課題組申請的中國專利申請CN200810033699. 6，發明名稱一種溫敏性殼聚糖衍生物-羥丁基殼聚糖的制備方法，公開號CN101284884A ;中國專利申請CN200910052695. 7，發明名稱溫敏性幾丁糖制劑及其制備與應用，公開號CN101579353A。羥戊基殼聚糖比羥丁基殼聚糖多了一個-CH2基團，理論上同樣具有良好的水溶性及溫敏性，且性質應該比羥丁基殼聚糖更優越。但目前國內外還沒有關于羥戊基殼聚糖的制備、性質及應用的研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種同時具有良好的水溶性和溫敏性的殼聚糖衍生物一羥戊基殼聚糖的制備方法。為實現以上目的，本發明的技術方案是提供一種溫敏性殼聚糖衍生物一羥戊基殼聚糖的制備方法，其方法為第一步，殼聚糖的制備取100克新鮮蝦殼，用清水洗凈，用500-2000毫升濃度為5% (W/V)的鹽酸浸泡除鈣，然后用500-2000毫升10% (W/V)的氫氧化鈉浸泡去除雜蛋白，用去離子水洗滌PH至 7-8，烘干、磨粉得到粉末幾丁質，然后將幾丁質加入500-2000毫升50% (W/V)的氫氧化鈉 溶液中，溫度為800C -1000C條件下脫乙酰反應12-32小時，用去離子水洗滌固形物PH值至
7-8，然后用濃度為95%的酒精脫水，最后真空干燥得脫乙酰度為75-95%的殼聚糖。第二步，殼聚糖的純化將第一步制備的殼聚糖加至500-2000毫升濃度為2% (W/V)的氫氧化鈉溶液中，控制溫度在70-80°C之間，攪拌1-3小時，抽濾固形物，相同過程重復2-4次，將得到的固形物用去離子水洗PH值至7-8，50°C真空干燥，烘干得到殼聚糖的粗品。將殼聚糖粗品溶解在2000-10000毫升濃度為1-2%的醋酸溶液中，300目絹布過濾除雜，用10% (W/V)氫氧化鈉溶液調PH值至8-9之間得到沉淀，然后300目絹布過濾固形物，用去離子水洗滌PH值至7-8 ;用1000-3000毫升濃度為95%乙醇脫水，然后用1000-3000毫升濃度為70%乙醇洗滌3-4次脫鹽；最后50°C真空干燥得純化殼聚糖。第三步，純化殼聚糖的堿化處理將純化所得到的殼聚糖經強堿氫氧化鉀或氫氧化鈉作用活化成為堿化殼聚糖；具體步驟為將10克純化殼聚糖加入50-150毫升40% -60% (W/V)的氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液中，常溫下放置18-32小時。第四步，殼聚糖的羥戊基化將活化的10克堿化殼聚糖中多余的堿液用100目絹布過濾擠去，固形物轉至容器(較佳為三口瓶)中，加入200-300毫升異丙醇分散相，攪拌1-3小時使殼聚糖完全分散開，然后用分液漏斗慢慢滴加200-400毫升醚化劑1，2-環氧戊烷，常溫下在容器中以200-600轉/分的速度攪拌，反應約3-6天，反應完全后，用6-12倍體積的丙酮沉淀產物，用75%或95%乙醇洗滌pH值至7-8，脫水，50°C真空干燥得到白色粉末狀羥戊基殼聚糖。本發明通過1，2_環氧戊烷作為醚化劑與堿化殼聚糖，在異丙醇體系下控制一定的條件進行化學改性，丙酮和乙醇使反應產物沉淀。本發明通過篩選堿化的反應條件、控制殼聚糖/1，2-環氧戊烷的比例和反應時間得到不同取代度的羥戊基殼聚糖，其產物的水溶性及溫敏性，分子量具有差異。從而得到較佳的方法和良好水溶性及溫敏性的羥戊基殼聚糖。本發明還提供了根據上述方法得到的羥戊基殼聚糖，該羥戊基殼聚糖具有良好的水溶性，紅外光譜分析表明羥丁基化主要發生在6-0H上，流變學性能測定結果表明其最低臨界溶液溫度(Lower critical solution temperature LCST)2% 時為 17°C。
本發明的優點是制備方法簡便，制備得到的羥戊基殼聚糖水溶性好，同時具有溫敏性，最低臨界溶液溫度較低，在生理溫度37°C下可快速固化為凝膠狀態。，本發明制備得到的溫敏性的羥戊基殼聚糖可用于藥物載體、基因載體，組織工程，傳感器、人造肌肉、化學存儲器、分子分離體系等領域。
圖I為殼聚糖紅外圖譜；圖2為羥戊基殼聚糖的紅外圖譜；
圖3為羥戊基殼聚糖的核磁共振氫譜；圖4為羥戊基殼聚糖與對照羥丁基殼聚糖的流變學性質變化圖，表現為溫度變化對其存儲模量G’和損耗模量G”的影響(2%，m/v)；圖5為羥戊基殼聚糖與對照羥丁基殼聚糖在37°C下的固化時間，表現為樣品存儲模量G’和損耗模量G”隨著時間延長的變化(2%，m/v)。
具體實施例方式下面結合本發明的實施例和附圖對本發明的實施作詳細說明，以下實施例是在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例I :羥戊基殼聚糖的制備第一步，殼聚糖的制備取100克新鮮蝦殼，用800毫升濃度為5% (W/V)的鹽酸浸泡除鈣，然后用800毫升10% (W/V)的氫氧化鈉浸泡去除雜蛋白，用去離子水洗滌PH至7-8、烘干、磨粉得到粉末幾丁質，然后加入800毫升50% (W/V)的氫氧化鈉溶液中溫度為90°C脫乙酰反應24小時，用去離子水洗滌PH值至7，然后用濃度為95%的酒精脫水，最后真空干燥得脫乙酰度為85%的殼聚糖。第二步，殼聚糖的純化將第一步制備的殼聚糖加至1000毫升濃度為2% (W/V)的氫氧化鈉溶液中，控制溫度在75°C左右，攪拌2小時，抽濾，再加入800毫升2% (W/V)的氫氧化鈉溶液，相同過程重復3次，將得到的固形物用去離子水洗PH值至7，50°C真空干燥烘干得到殼聚糖的粗品。將殼聚糖粗品溶解在2000毫升濃度為1%的醋酸溶液中，300目絹布過濾除雜，用10% (W/V)氫氧化鈉溶液調PH值至8-9之間得到沉淀，然后300目絹布過濾固形物，用去離子水洗滌PH值至7 ;用2000毫升濃度為95%乙醇脫水，然后用2000毫升濃度為70%乙醇洗滌3次脫鹽；最后50°C真空干燥得純化殼聚糖。第三步，純化殼聚糖的堿化處理將10克純化殼聚糖加入20毫升異丙醇，在1000毫升三口燒瓶中膨脹60分鐘，100目絹布擠出多余的異丙醇，然后將固形物加入100毫升50% (W/V)的氫氧化鉀溶液，攪拌I小時，_20°C中凍存，次日拿出融化，相同的過程重復2次。第四步，殼聚糖的羥戊基化將10克堿化好的殼聚糖中多余的堿液用100目絹布過濾擠出，轉至三口瓶中，力口Λ 80毫升異丙醇攪拌2小時使殼聚糖完全分散開，然后用分液漏斗慢慢滴加100毫升的1，2-環氧戊烷，常溫下在容器中以300轉/分的速度攪拌，反應5天，反應完全后，用9倍體積的丙酮沉淀產物，用75%乙醇洗滌pH值至7-8，脫水，50°C真空干燥得到白色粉末狀羥戊
基殼聚糖。實施例2 :羥戊基殼聚糖的制備第一步，殼聚糖的制備同實施例I ;第二步，殼聚糖的純化同實施例I ;第三步，殼聚糖的堿化同實施例I ; 第四步，殼聚糖的羥戊基化將10克堿化好的殼聚糖中多余的堿液用100目絹布過濾擠出，轉至三口瓶中，力口入80毫升異丙醇攪拌2小時使殼聚糖完全分散開，然后分液漏斗慢慢滴加200毫升1，2-環氧戊烷，常溫下在容器中以300轉/分的速度攪拌，反應5天，反應完全后，用9倍體積丙酮沉淀，用75%乙醇洗滌pH值至7-8，脫水，50°C真空干燥得到白色粉末狀羥戊基殼聚糖。實施例3 :羥戊基殼聚糖的制備第一步，殼聚糖的制備同實施例I ;第二步，殼聚糖的純化同實施例I ;第三步，殼聚糖的堿化將純化殼聚糖10克加入100毫升50 % (W/V)的氫氧化鉀溶液中，常溫下放置24小時。第四步，殼聚糖的羥戊基化同實例2。實施例4 :對照品羥丁基殼聚糖的制備第一步，殼聚糖的制備同實施例I ;第二步，殼聚糖的純化同實施例I ;第三步，殼聚糖的堿化同實施例3 ；第四步，殼聚糖的羥丁基化將10克堿化好的殼聚糖中多余的堿液用100目絹布過濾擠出，轉至三口瓶中，力口入80毫升異丙醇攪拌2小時使殼聚糖完全分散開，然后分液漏斗慢慢滴加200毫升1，2-環氧丁烷，常溫下在容器中以300轉/分的速度攪拌，反應5天，反應完全后，9倍體積丙酮沉淀，用75%乙醇洗滌pH值至7-8，脫水，50°C真空干燥得到白色粉末狀羥丁基殼聚糖。實施例5 :性質檢測及結構表征將以上4個實施例的樣品進行初步水溶性溫敏性檢測，結果見表1，表明不同條件下制備的實施例樣品1、2、3羥戊基殼聚糖及實施例4對照樣品羥丁基殼聚糖均具有不同程度的水溶性、溫敏性及不同的最低臨界溫度(LCST )。將實施例3羥戊基殼聚糖樣品及純化殼聚糖進行紅外光譜分析，結果表明羥戊基化主要發生在6-0H上(見圖1，圖2)。將實施例3羥戊基殼聚糖樣品由核磁共振氫譜表征可知(見圖3)，衍生化后的產物在I. Oppm處出現明顯的-CH3質子峰的化學位移，表明殼聚糖上引入了羥戊基基團。將實施例3羥戊基殼聚糖樣品經元素分析結果表明，其羥戊基取代度為O. 645。實施例4對照樣品羥丁基殼聚糖經元素分析結果表明，其羥丁基取代度為O. 678。分析表明相同的反應條件下，羥戊基與羥丁基的取代度相似。將實施例3羥戊基殼聚糖樣品流變學性能測定結果表明其最低臨界溶液溫度(LCST) 2%時為17°C (見圖4)，其固化時間為在37°C等溫條件下，在60秒內，由溶液狀態固化為穩定的彈性凝膠(見圖5)。將實施例4對照樣品羥丁基殼聚糖流變學性能測定結果表明其最低臨界溶液溫度(LCST)2%時為22°C (見圖4)，其固化時間為在37°C等溫條件下，在60秒內，由溶液狀態固化為穩定的彈性凝膠(見圖5)。分析表明相同的反應條件下，制備的羥戊基殼聚糖與羥丁基殼聚糖相比溫敏性要好。表I :實例樣品和原料殼聚糖主要性能對比表
權利要求
1.一種溫敏性殼聚糖衍生物一羥戊基殼聚糖的制備方法，其特征在于該方法由以下步驟組成 第一步，殼聚糖的制備 取100克新鮮蝦殼，用清水洗凈，用500-2000毫升濃度為5% (W/V)的鹽酸浸泡除鈣，然后用500-2000毫升10% (W/V)的氫氧化鈉浸泡去除雜蛋白，用去離子水洗滌PH至7-8，烘干、磨粉得到粉末幾丁質，然后將幾丁質加入500-2000毫升50% (W/V)的氫氧化鈉溶液中，溫度為800C -1000C條件下脫乙酰反應12-32小時，用去離子水洗滌固形物PH值至7-8，然后用濃度為95%的酒精脫水，最后真空干燥得脫乙酰度為75-95%的殼聚糖； 第二步，殼聚糖的純化 將第一步制備的殼聚糖加至500-2000毫升濃度為2% (W/V)的氫氧化鈉溶液中，控制溫度在70-80°C之間，攪拌1-3小時，抽濾固形物，相同過程重復2-4次，將得到的固形物用去離子水洗PH值至7-8，50°C真空干燥，烘干得到殼聚糖的粗品； 將殼聚糖粗品溶解在2000-10000毫升濃度為1-2%的醋酸溶液中，300目絹布過濾除雜，用10% (W/V)氫氧化鈉溶液調PH值至8-9之間得到沉淀，然后300目絹布過濾固形物，用去離子水洗滌PH值至7-8 ;用1000-3000毫升濃度為95%乙醇脫水，然后用1000-3000毫升濃度為70%乙醇洗滌3-4次脫鹽；最后50°C真空干燥得純化殼聚糖； 第三步，純化殼聚糖的堿化處理 將純化所得到的殼聚糖經40% -60% (W/V)氫氧化鉀或氫氧化鈉作用活化成為堿化殼聚糖； 第四步，殼聚糖的羥戊基化 將活化的10克堿化殼聚糖中多余的堿液用100目絹布過濾擠去，固形物轉至容器中，加入200-300毫升異丙醇分散相，攪拌1-3小時使殼聚糖完全分散開，然后用分液漏斗慢慢滴加200-400毫升醚化劑1，2-環氧戊烷，常溫下在容器中以200-600轉/分的速度攪拌，反應約3-6天，反應完全后，用6-12倍體積的丙酮沉淀產物，用75%或95%乙醇洗滌pH值至7-8，脫水，50°C真空干燥得到白色粉末狀羥戊基殼聚糖。
2.根據權利要求I所述的一種溫敏性殼聚糖衍生物一羥戊基殼聚糖的制備方法，其特征在于，第三步，純化殼聚糖的堿化處理 將10克純化殼聚糖加入50-150毫升40% -60% (W/V)的氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液中，常溫下放置18-32小時。
3.根據權利要求I或2所述的溫敏性殼聚糖衍生物一羥戊基殼聚糖的制備方法制備得到的羥戊基殼聚糖。
全文摘要
本發明涉及生物材料技術領域，具體涉及一種溫敏性殼聚糖衍生物―羥戊基殼聚糖及其制備方法。本發明提供了一種溫敏性殼聚糖衍生物―羥戊基殼聚糖的制備方法，該法首先將純化殼聚糖經強堿活化，然后以1,2-環氧戊烷為醚化劑，以異丙醇為分散相，室溫下溫和反應3-6天，反應完畢后丙酮沉淀、洗滌至中性，50℃真空干燥得到羥戊基殼聚糖。本發明的羥戊基殼聚糖其具有水溶性及溫敏性，其最低臨界溶液溫度(LCST)為17℃(2%W/V)，在生理溫度37℃時可由液體狀態快速固化為穩定的凝膠狀態。
文檔編號C08B37/08GK102702389SQ20121022024
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者侯春林, 劉 文, 魏長征 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學