專利名稱：一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種吸附介質及其制備方法，特別是涉及一種以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質分離的膨脹床吸附介質及制備方法，屬于層析分離中膨脹床吸附分離蛋白質技術。
背景技術：
生物分離技術是生物工程技術的重要環節，改進生物分離技術，低成本、高收率、 高效率地純化目標產物，以及有效地控制有害雜質的含量，是生物活性物質能否轉變為具有實用價值和競爭力的產品的首要問題。膨脹床吸附(expanded bed adsorption, EBA)是一種新型的蛋白質分離操作技術，形成于20世紀90年代，近年來在生物工程領域得到了廣泛的應用。膨脹床操作可將離心、初步分離及濃縮過程集成為一個單元操作，從而簡化了蛋白質分離的步驟，并可以提高目的蛋白的收率，減少操作時間。吸附介質性能的好壞直接影響分離效果，開發出性能良好的吸附劑基質，是該項技術得以廣泛應用的關鍵。既要易于流化，又要使分離效果接近于固定床，必須確保吸附劑顆粒在膨脹床內能夠適度膨脹，并穩定分級，停留在各自特定的位置，因此需要對膨脹床吸附劑進行特殊的設計，譬如密度、粒徑及其分布、功能基團種類及其數量等。目前常用的膨脹床吸附介質多為GE Healthcare公司提供的Mreamline系列介質，采用石英砂作增重內核，外層為交聯瓊脂糖，外觀球形，粒徑在100-300μπι之間。但其昂貴的價格制約了它在國內的應用，另外，Mreamline系列樹脂仍然存在著流速操作范圍偏窄的不足。為了提高EBA的處理能力，開發高密度、高吸附容量的膨脹床吸附劑是必然趨勢。構建合適化學結構的配基，高選擇性地捕獲目標產物，而顆粒等雜質則被帶出床層，對于擴張床吸附層析過程來說，是非常重要的。金屬螯合親和層析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC)，是一項常用的親和層析分離技術。該方法一般將 Cu2+、Zn2\ Ni2+等通過螯合劑亞氨基二乙酸交聯到色譜填料上，利用蛋白質表面的組氨酸、 色氨酸、半胱氨酸等能和金屬離子發生特殊的相互作用的原理，從而對蛋白質加以分離。由于IMAC具有吸附容量大，選擇性及通用性較好，易于再生，成本低等優點，逐漸成為分離純化蛋白質等生物工程產品最有效的技術之一，也是基因工程中對融合蛋白表達純化的最常見的一種手段。混合模式吸附層析(mixed-mode chromatography)是近年開發的生物分離新方法，其功能配基同時含有疏水基團和離子交換基團，兼具疏水作用和靜電相互作用， 可以通過靜電相吸來強化吸附或靜電排斥來協助解吸，具有廣闊的應用前景(BURTON S C，et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2001，49 :275)。同時， 配基密度通常比較高，具有典型的耐鹽吸附性能，對目標蛋白有很強的捕獲能力，可以從較低濃度的體系中富集目標蛋白，特別適合于生物對象初分離的要求(GH0SE S, et al. Biotechnology Progress, 2005， 21:498. BURTON S C, et al. Biotechnology andBioengineering, 1997, 56: 45)。將膨脹床吸附和混合模式吸附層析有機地結合起來，實現混合模式膨脹床吸附，可以充分發揮二者的優勢，達到低原料要求、高處理量和高選擇性的分離目標。
發明內容
本發明的目的在于提供一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質及其制備方法，以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質分離的膨脹床吸附介質及制備方法，達到金屬螯合親和配基和疏水作用配基協同作用，提高對料液中目標蛋白質的吸附分離效率及選擇性，形成一種高效集成化蛋白質分離方法，有效促進蛋白質的規模化分離純化。本發明的目的是通過以下技術方案實現的
一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質，介質的組成中基質為殼聚糖/不銹鋼粉復合微球，配基為經苯甲醛活化后引入的苯基和環氧氯丙烷活化后再偶聯的亞氨基二乙酸，化學結構式為
權利要求
1. 一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質，其特征在于，介質的組成中基質為殼聚糖/不銹鋼粉復合微球，配基為經苯甲醛活化后引入的苯基和環氧氯丙烷活化后再偶聯的亞氨基二乙酸，化學結構式為
2.根據權利要求1所述的一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質，其特征在于， 所述的殼聚糖/不銹鋼粉復合微球的骨架為殼聚糖，增重劑為不銹鋼粉，增重劑占濕球的質量百分比為69Γ40%，殼聚糖/不銹鋼粉復合微球的粒徑為5(Γ300 μ m。
3.根據權利要求1所述的一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質，其特征在于， 所述的配基為苯基和亞氨基二乙酸。
4.根據權利要求1所述的一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質，其特征在于， 所述的配基密度為20-160 μ mol / ml介質。
5.一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質的制備方法，其特征在于該方法包括如下過程首先將質量分數為5%的殼聚糖溶液與不銹鋼粉、PEG2000充分混合，PEG2000和不銹鋼粉在混合物中的質量百分含量分別為3%和69Γ40%，再加入與殼聚糖溶液等體積的液體石蠟及乳化劑span-80，高速攪拌30min使體系成乳液狀，然后加入0. 12倍殼聚糖溶液體積的甲醛，攪拌Ih后將乳液倒入10 % NaOH/無水乙醇(V(NaOH) V(無水乙醇)=1 1)的混合液中靜置2h，用二甲苯、無水乙醇、去離子水充分洗滌，篩分得到粒徑5(Γ300 μ m的殼聚糖/不銹鋼粉復合微球作為基質；其次將復合微球、甲醇、苯甲醛混合，苯甲醛添加的體積量為復合微球體積的0. 3^1倍，60°C下200rpm搖床中反應纊16h，再加入硼氰化鈉室溫反應12h，抽濾，用去離子水洗滌后得苯甲醛化基質；然后將苯甲醛化基質、0. 2mol/L的NaOH 水溶液、2、倍基質微球體積的環氧氯丙烷混合，50°C反應他，抽濾、洗滌，得環氧基活化基質；最后將環氧基活化基質、lmol/L的Na2CO3溶液、廣2倍環氧基活化基質質量的亞氨基二乙酸混合，使體系PH值始終保持在10，在70°C下200rpm搖床中反應8 16h，抽濾，水洗至中性，得到以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質分離的膨脹床吸附介質。
全文摘要
一種雙功能配基的殼聚糖基膨脹床吸附介質及其制備方法，涉及一種吸附介質及其制備方法。基質為殼聚糖/不銹鋼粉復合微球，配基為經苯甲醛活化后引入的苯基和環氧氯丙烷活化后再偶聯的亞氨基二乙酸。采用反相懸浮交聯法，制備殼聚糖/不銹鋼粉復合微球作為空白基質；采取兩種配基分開設計的方法，先將微球基質C2位苯甲醛化，構建一個疏水相互作用配基，再用環氧氯丙烷活化基質C6位羥基，再和亞氨基二乙酸偶聯，得到以苯基和亞氨基二乙酸為配基用于蛋白質分離的膨脹床吸附介質。本發明所研制的新型膨脹床吸附介質，同時具有金屬螯合親和配基和疏水作用配基，提高對料液中目標蛋白質的吸附分離效率及選擇性，可用于蛋白質的規模化分離純化。
文檔編號B01J20/24GK102553537SQ201110440588
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者朱建星, 王紅艷 申請人:沈陽化工大學