克雷伯氏肺炎桿菌突變菌及其生產1,3-丙二醇的應用的制作方法

本發明屬于菌株的基因工程改造技術領域，具體涉及克雷伯氏肺炎桿菌突變菌及其生產1,3-丙二醇的應用。

背景技術：

1,3-丙二醇是一種重要的化學品，其與二元酸聚合可以合成聚酯材料，其中比較重要的是與對苯二甲酸聚合形成聚對苯二甲酸丙二醇酯，是一種性能優良的紡織材料。1,3-丙二醇可以通過化學方法合成，也可以利用生物方法合成。包括丁酸梭菌、弗氏檸檬酸菌、克雷伯氏產酸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌肺炎桿菌等細菌可以利用甘油代謝合成1,3-丙二醇。杜邦公司開發了利用大腸桿菌工程菌株以葡萄糖為碳源合成1,3-丙二醇的方法。

克雷伯氏肺炎桿菌是一種重要的工業微生物，用于生物法生產1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基-D-葡萄糖酸等化學品的生產菌株。克雷伯氏肺炎桿菌具有生長旺盛，培養條件粗放等優點。克雷伯氏肺炎桿菌生產1,3-丙二醇具有底物轉化率高，產物終濃度高等優點。

丙酮酸是生物體的一個中間代謝產物，多種碳源通過代謝都可以合成丙酮酸，而細胞內的丙酮酸又可以合成多種其他代謝產物，丙酮酸處于細胞代謝的一個非常重要的位置。在克雷伯氏肺炎桿菌中，丙酮酸是合成乳酸的原料，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下，還原生成乳酸。在克雷伯氏肺炎桿菌中，丙酮酸是合成乙酰輔酶A的原料，丙酮酸合成乙酰乳酸有兩條途徑，一條是在丙酮酸脫氫酶系的催化下形成乙酰輔酶A，放出二氧化碳，同時還原NAD形成NADH，另外一條途徑是在丙酮酸甲酸裂解酶的催化下形成乙酰輔酶A，同時形成甲酸。這樣在克雷伯氏肺炎桿菌的細胞內丙酮酸就處于一個多通道的節點。

在克雷伯氏肺炎桿菌中，甘油脫水可以形成3-羥基丙醛，3-羥基丙醛經過還原形成1,3-丙二醇，另外一部分甘油可以氧化形成二羥基丙酮，進而磷酸 化形成磷酸二羥基丙酮進入酵解途徑，甘油也可以先磷酸化形成甘油-3-磷酸，再氧化形成磷酸二羥基丙酮進入酵解途徑，也形成丙酮酸。

技術實現要素：

本發明的目的是，提供克雷伯氏肺炎桿菌突變菌及所述突變菌的制備方法和所述突變菌用于發酵生產1,3-丙二醇的應用。

本發明為實現上述目的所采用的技術方案如下：

本發明提供一種克雷伯氏肺炎桿菌突變菌，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸脫氫酶系活性失活通過丙酮酸脫氫酶系基因中的一個或多個基因失活來實現；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活來實現；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脫氫酶ldhA基因同時失活來實現。

所述丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法為：將克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸脫氫酶系的基因中一個或多個基因進行失活來獲得丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。所述丙酮酸脫氫酶系是指催化丙酮酸形成乙酰輔酶A，同時釋放出二氧化碳并轉化NAD形成NADH的酶系。丙酮酸脫氫酶系也稱為乙偶姻脫氫酶系或丙酮酸脫氫酶復合物，可以催化乙偶姻分解成乙酰輔酶A和乙醛。所述丙酮酸脫氫酶系由焦磷酸硫胺素依賴的丙酮酸脫氫酶、二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶和二氫硫辛酰胺脫氫酶組成；其中丙酮酸脫氫酶α亞基由acoA基因編碼，丙酮酸脫氫酶β亞基由acoB基因編碼，二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶由acoC基因編碼，二氫硫辛酰胺脫氫酶由acoD基因編碼，其中的調節基因為acoK基因。

所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法為：將克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因失活來獲得丙酮酸甲酸裂解酶活 性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。所述丙酮酸甲酸裂解酶是催化丙酮酸形成乙酰輔酶A，同時形成甲酸的酶。所述丙酮酸甲酸裂解酶由pflB基因編碼。

所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法為：將克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因失活來獲得丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的的克雷伯氏肺炎桿菌。所述乳酸脫氫酶由催化丙酮酸還原形成乳酸的酶。乳酸脫氫酶由ldhA基因編碼。

所述基因失活的方法采用同源重組法或Red重組酶介導的同源重組法。

本發明還提供了克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產1,3-丙二醇的應用，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌通過丙酮酸脫氫酶系基因中的一個或多個基因失活獲得。

本發明還提供了克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產1,3-丙二醇的應用，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活獲得。

本發明還提供了克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產1,3-丙二醇的應用，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脫氫酶ldhA基因同時失活獲得。

本發明還提供了所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產1,3-丙二醇的方法，該方法為：將所述的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌接種到以甘油為碳源的培養基中，進行微氧發酵生產1,3-丙二醇。

進一步地，所述微氧發酵生產1,3-丙二醇的培養條件為：發酵液pH值為6.8～7.2，發酵溫度為30～40℃。

相對于現有技術，本發明的有益效果為：

相對于克雷伯氏肺炎桿菌野生菌株，失活丙酮酸脫氫酶酶系的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌可以提高1,3-丙二醇的生產強度；失活丙酮酸甲酸裂解酶的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌可以提高1,3-丙二醇的底物轉化率；同時失活丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌可以進一步提高1,3-丙二醇的底物轉化率。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業化產品。

實施例1

利用基因重組方法對克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸脫氫酶系基因進行失活，來實現丙酮酸脫氫酶系活性失活。

本實施例中的克雷伯氏肺炎桿菌采用CGMCC 1.6366的菌株(該菌株也稱為TUAC01、AC01)，CGMCC 1.6366的菌株已經在授權發明專利ZL201310346916.8中公開，另外在公開文獻(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中也已經公開該菌株。該菌株是一株用于生產1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。該菌分離自土壤，分離過程及性狀描述見文獻(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。

利用Red重組酶輔助的同源重組方法敲除克雷伯氏肺炎桿菌中aocK基因，來實現消除菌株丙酮酸脫氫酶系活性，步驟如下：

1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸酶系及調控基因序列(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。

根據克雷伯氏肺炎桿菌342(Genbank:NC_011283)基因組信息，設計丙酮酸脫氫酶系及調控基因PCR引物，上游引物aco-s： TTAATCCAGTAATTTCATCTCCAGCGCCCG(SEQ ID NO.1所示)，下游引物aco-a：TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.2所示)。

通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366基因組DNA為模板，經PCR擴增，獲得丙酮酸脫氫酶系(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)基因片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質粒(商業產品)上，命名為pMD18T-aco質粒，序列測定結果如(SEQ ID NO.3所示)。其中1-2766為acoK閱讀框，3019-3978為acoA閱讀框，3990-5009為acoB閱讀框，5013-6548為acoC閱讀框，6538-7935為acoD閱讀框。

2)利用步驟1克隆到的基因序列，制備兩側連有長同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

本步驟中的操作，采用在大腸桿中利用Red重組酶催化，具有短同源臂連接抗性盒的DNA片段與pMD18T-aco質粒進行同源重組，獲得pMD18T-aco質粒上重組失活的acoK基因，利用該質粒作為模板通過PCR擴增具有長的同源臂的DNA片段，該片段兩側連有與acoK基因同源的序列，中間連接抗性盒。

本步驟操作原理和使用的質粒和菌株等材料可參見(Wei et.al.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具體步驟如下：

a.pMD18T-aco質粒熱擊轉化到含有pIJ790質粒的大腸桿菌DH5α-pIJ790中，命名為DH5α-pMD18T-aco。

b.設計引物acoK-s1和acoK-a1，序列分別為：

CTCAGCCAGTAAAATGCAGGCTTGCGGCGCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.4所示)和GCTGCAGGCCCAGGACCAACTGGTGGAAATTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.5所示)。

利用引物acoK-s1和acoK-a1，以質粒pIJ773為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段A。該片段的兩端分別具有與acoK序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ773質粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段A轉化感受態DH5α-pMD18T-aco感受態細胞。利用電擊轉化方法，轉化電壓為2000V，選擇安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量為50mg/L。

DNA片段A兩側的同源序列與質粒pMD18T-aco上的acoK同源部分發生重組，獲得質粒，并命名為pMD18T-ΔacoK質粒。

d.利用引物aco-s(SEQ ID NO.1所示)和acoK-a2ATGAAGCCATTGGATTTAGAAGGTCGCCAA(SEQ ID NO.6所示)，以pMD18T-ΔacoK質粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kb的DNA片段B。

DNA片段B兩端分別具有acoK基因序列，該序列作為同源臂。DNA片段B中間具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于進行CGMCC1.6366染色體上acoK基因重組的線性DNA片段。

3)利用轉化將制備的DNA片段B轉入到克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中，DNA片段B與染色體上的丙酮酸脫氫酶酶系基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體丙酮酸脫氫酶酶系調控基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質粒轉化到CGMCC 1.6366中，獲得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，線性DNA片段B電擊轉化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受態細胞。利用安普霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-acoK^-。該菌株的丙酮酸脫氫酶系的調控基因通過同源重組而失活。

實施例2

利用Red重組酶輔助的同源重組方法敲除克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中的aocA基因，來實現菌株丙酮酸脫氫酶系活性失活。

1)制備兩側連有aocA基因同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

具體步驟如下：

a.設計引物acoA-s1和acoA-a1，序列分別為：

ATGCTCAGCAAACAGGCGTTATTGCAGGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.7所示)和TCAGTATGAGACATAAACGTCTGTCAGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO.8所示)。

利用引物acoA-s1和acoA-a1，以質粒pIJ773為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段A1。該片段的兩端分別具有與acoA序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ773質粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

b.利用DNA片段A1轉化實施例1中制備的感受態DH5α-pMD18T-aco感受態細胞。利用電擊轉化方法，轉化電壓為2000V，選擇安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量為50mg/L。

DNA片段A1兩側的同源序列與質粒pMD18T-acoA上的aco同源部分發生重組，獲得質粒，并命名為pMD18T-ΔacoA質粒。

c.利用引物acoA–s2GGCGATACGTTCACCCTGGGCGACCATCTG(SEQ ID NO.9所示)和acoA-a2GTCGTCGTCGCGAATTGACTGGATTAACAG(SEQ ID NO.10所示)，以pMD18T-ΔacoA質粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kbp的DNA片段B2。

DNA片段B2兩端分別具有acoA基因外側相鄰序列，該序列作為同源臂。DNA片段B2中間具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B2用于進行CGMCC1.6366染色體上acoA基因重組的線性DNA片段。

2)將制備的DNA片段B2轉入到克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366中，DNA片段B2與染色體上的丙酮酸脫氫酶系基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體丙酮酸脫氫酶酶系基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質粒轉化到CGMCC 1.6366中，獲得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，線性DNA片段B2電擊轉化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受態細胞。利用安普霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-acoA^-。該菌株的丙酮酸脫氫酶系的acoA基因通過同源重組而失活。

實施例3

利用Red重組酶輔助的同源重組方法克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366中失活aocB基因，來實現菌株丙酮酸脫氫酶系活性失活。

操作過程同實施例2，其中引物acoB-s CATTACCGAGTCGGCCATCATCGGAATGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ ID NO.11所示)和acoB-a ACCACCTCGACCGAGATCCCCTCTCTGGCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.12所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoB-s2CGGTCAAACGTGCGCGAGAAGGCGGTGGCC(SEQ ID NO.13所示)和acoB-a2CGCCTACCTGAAGCGTCTCACCCTCTCGGG(SEQ ID NO.14所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通過基因敲除工作，獲得丙酮酸脫氫酶系acoB基因突變的菌株，命名為Kp-acoB^-。

實施例4

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中失活aocC基因，來實現消除菌株丙酮酸脫氫酶系活性。

操作過程同實施例2，其中引物acoC-s AGTCCGCGGCAGCGGGCGCG GGGATCGTATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.15所示)和acoC-a CCTTCACCAGCAGGTCATTAACCGAAATCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.16所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoC-s2ATGAGCGAAATCAAGACGCTTGAAATGCCA(SEQ ID NO.17所示)和acoC-a2GCACATCGTATTTATCGTGCATAGCTCGTC(SEQ ID NO.18所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通過基因敲除工作，獲得丙酮酸脫氫酶系acoC基因突變的菌株，命名為Kp-acoC^-。

實施例5

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中失活aocD基因，來實現消除菌株丙酮酸脫氫酶系活性。

操作過程同實施例2，其中引物acoD-s TTGCCCAGGTCGCTATTAA TCATCGGTTCAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.19所示)和acoD-a TTACTTGCGTCACCAGGGTCTGGGTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.20所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoD-s2ATGCACGATAAATACGATGTGCTGATCATC(SEQ ID NO.21 所示)和acoD-a2TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.22所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通過基因敲除工作，獲得丙酮酸脫氫酶系acoD基因失活的菌株，命名為Kp-acoD^-。

實施例6

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中失活丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，來實現消除菌株丙酮酸甲酸裂解酶活性。

1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸甲酸裂解基因序列(pflB)，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。

根據克雷伯氏肺炎桿菌342(Genbank:NC_011283)基因組信息，設計丙酮酸甲酸裂解酶基因PCR引物，上游引物pflB-s：ATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACA(SEQ ID NO.23所示)，下游引物pflB-a：TTACATGGTCTGAGTGAAGGTACGGGTAAT(SEQ ID NO.24所示)。

通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366基因組DNA為模板，經PCR擴增，獲得丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)基因片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質粒上，命名為pMD18T-pflB質粒，序列測定結果如(SEQ ID NO.25所示)。

2)利用步驟1克隆到的基因序列，制備兩側連有長同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

a.pMD18T-pflB質粒熱擊轉化到含有pIJ790質粒的大腸桿菌DH5α-pIJ790中，命名為DH5α-pMD18T-pflB。

b.設計引物pflB-s1和pflB-a1，序列分別為：CTGGTCTGCCGGATGCTTACGGCCGTGGTCATTCCGGGGATCCGTCGACC

(SEQ ID NO.26所示)和GTGCAGTTTCTGAATTTTCTTCATGAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO.27所示)。

利用引物pflB-s1和pflB-a1，以質粒pIJ773為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段C。該片段的兩端分別具有與pflB序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ773質粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段C轉化感受態DH5α-pMD18T-pflB感受態細胞。選擇安普霉素抗性的轉化子，安普霉素用量為50mg/L。

DNA片段C兩側的同源序列與質粒pMD18T-pflB上的pflB同源部分發生重組，獲得質粒，并命名為pMD18T-ΔpflB質粒。

d.利用引物pflB-s(SEQ ID NO.23所示)和pflB-a(SEQ ID NO.24所示)，以pMD18T-ΔpflB質粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kb的DNA片段D。

DNA片段D兩端分別具有pflB基因序列，該序列作為同源臂。DNA片段D中間具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段D用于進行CGMCC1.6366染色體上pflB基因重組的線性DNA片段。

3)利用轉化將制備的DNA片段D轉入到克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中，DNA片段D與染色體上的丙酮酸甲酸裂解酶基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體丙酮酸甲酸裂解酶基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質粒轉化到CGMCC 1.6366中，獲得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，線性DNA片段D電擊轉化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受態細胞。利用安普霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-pflB^-。該菌株的丙酮酸甲酸裂解酶基因通過同源重組而失活。

實施例7

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌Kp-pflB^-中失活乳酸脫氫酶基因(ldhA)，來實現同時消除菌株丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶活性。

1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌乳酸脫氫酶基因序列(ldhA)，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。

根據克雷伯氏肺炎桿菌342(Genbank:NC_011283)基因組信息，設計乳酸脫氫酶基因PCR引物，上游引物ldhA-s： GTGTCGTTAATTATCTCGCTCATTGAGAGC(SEQ ID NO.28所示)，下游引物ldhA-a：CTAATGCATCAGGTCGGCGAGCTTATAGAC(SEQ ID NO.29所示)。

通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366基因組DNA為模板，經PCR擴增，獲得乳酸脫氫酶(ldhA)基因片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質粒上，命名為pMD18T-ldhA質粒，序列測定結果如(SEQ ID NO.30所示)。其中649-1638為ldhA閱讀框。

2)利用步驟1克隆到的基因序列，制備兩側連有長同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

a.pMD18T-ldhA質粒熱擊轉化到含有pIJ790質粒的大腸桿菌DH5α-pIJ790中，命名為DH5α-pMD18T-ldhA。

b.設計引物ldhA-s1和ldhA-a1，序列分別為：AACTTTGTCTTTCAAAGAGATTCCGCAAATATTCCGGGGATCCGTCGACC

(SEQ ID NO.31所示)和AATCAGACGATAGCGTTCGGGCAGGTTTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.32所示)。

利用引物ldhA-s1和ldhA-a1，以質粒pIJ778為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段E。該片段的兩端分別具有與ldhA序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ778質粒的鏈霉素抗性基因aadA。

c.利用DNA片段E轉化感受態DH5α-pMD18T-ldhA感受態細胞。選擇鏈霉素抗性的轉化子，鏈霉素用量為25mg/L。

DNA片段E兩側的同源序列與質粒pMD18T-ldhA上的ldhA同源部分發生重組，獲得質粒，并命名為pMD18T-ΔldhA質粒。

d.利用引物ldhA-s(SEQ ID NO.28所示)和ldhA-a(SEQ ID NO.29所示)，以pMD18T-ΔldhA質粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kb的DNA片段F。

DNA片段F兩端分別具有ldhA基因序列，該序列作為同源臂。DNA片段F中間具有鏈霉素抗性基因aadA，DNA片段F用于進行Kp-pflB^-染色體上 ldhA基因重組的線性DNA片段。

3)利用轉化將制備的DNA片段F轉入到克雷伯氏肺炎桿菌Kp-pflB^-中，DNA片段F與染色體上的乳酸脫氫酶(ldhA)基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體乳酸脫氫酶基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質粒轉化到Kp-pflB^-中，獲得Kp-pflB^--pDK6-red菌株，線性DNA片段F電擊轉化Kp-pflB^--pDK6-red感受態細胞。利用鏈霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-pflB^--ldhA^-。該菌株的乳酸脫氫酶基因和丙酮酸甲酸裂解酶基因通過同源重組而同時失活。

實施例8

將實施例1-7中獲得的丙酮酸脫氫酶系活性失活的菌株、丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的菌株、丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶活性同時失活的菌株進行1,3-丙二醇發酵實驗。

1)種子培養，將構建的突變株和出發野生型菌株接種到250ml錐形瓶中，瓶中含有50ml液體種子培養基。種子培養基成分為：蛋白胨5g/L，NaCL 5g/L，酵母粉10g/L。將種子瓶放置在30℃震蕩培養過夜。

2)發酵培養，將一瓶種子接種到5L發酵罐中，罐中裝有3L發酵培養基，通風0.5L/min，攪拌轉速200轉/min，利用堿液調節發酵液pH值為7.0，37℃培養12小時。

發酵培養基配方為：硫酸銨4g/L；磷酸氫二鉀0.69g/L；磷酸二氫鉀0.25g/L；硫酸鎂0.2g/L；酵母粉1.5g/L；甘油30g/L；微量元素1.0ml/L；鐵溶液1.0ml/L。

其中，微量元素為：硫酸錳100mg/L；氯化鋅70mg/L；鉬酸鈉35mg/L；硼酸60mg/L；氯化鈷200mg/L；硫酸銅29.28mg/L；氯化鎳25mg/L；濃鹽酸(37％)0.9ml/L。

鐵溶液為：每升水中加入硫酸亞鐵5.0g，37％的濃鹽酸4ml。

定時取樣，測定發酵液中各組分含量，甘油消耗完全為發酵終點。測定方法采用液相色譜法測定，利用HPX-87H色譜柱對發酵液組分進行分離，利用紫外和視差檢測器檢測。流動相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min， 柱溫箱60℃。各菌株發酵結果如表1所示。

表1，各菌株發酵生產1,3-丙二醇結果

由表1中數據可以看出，失活丙酮酸脫氫酶系活性的突變菌株與出發野生菌株相比較，1,3-丙二醇的生產強度增大了0.26-0.27g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的質量轉化率降低了2.5-3％。失活丙酮酸甲酸裂解酶活性的突變株與出發野生菌株相比較，1,3-丙二醇的生產強度降低了0.14g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的質量轉化率增加了2.3％。同時失活丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性的突變株與出發野生菌株相比較，1,3-丙二醇的生產強度降低了0.09g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的質量轉化率增加了4.6％。

上述僅為本發明的部分優選實施例，本發明并不僅限于實施例的內容。對于本領域中的技術人員來說，在本發明技術方案的構思范圍內可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發明保護范圍之內。

<110> 中國科學院上海高等研究院

<120> 克雷伯氏肺炎桿菌突變菌及其制備方法和應用

<130> 2015

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc 30

<210> 3

<211> 7935

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎桿菌

<400> 3

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg actcatcgct tgagtgcggc tattcacttt 60

aagcttcgcg tagatgtttt tgatgtgcca tttgaccgtc tcggcagaaa tagctaggga 120

gcgggcgatt tctttgttca tctgaccttc agcgatcagc tgtaatatct gaaattctcg 180

ctcgctgagt tccccatgaa tatcggggct tccactattt agcggtgttc tgtctgcagg 240

cgcgcgcttg tctgcccagg gttcatggac tatcccttcc tctgtacaag ccgaagagaa 300

atcattcata ccgataagca aaggttgcaa ggtatcgcca gcgtcaagaa agaggccctt 360

gagatgctgt tgttcagcca gcagcagcac tggttgaaat gtcgtgcgcg cagcggcagt 420

tttgccgctg ttccacaagg ctaatgacca gagcgtacgc agacgcgctg cggttaacct 480

gtccccccgg ctttcctgat cggagaccat ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc 540

ctggcctctg gcgagaagaa gccggctgcg gctaagggat gcagacataa cgatggcgcg 600

ttggcaggga tgttcggcat ccattctgaa gctggcggcc atttgttcaa gctgccgttg 660

cagttgctct gcgccggtga aattgccgcg ctgcaggcgc accctcacct gctcggctaa 720

caacatggcc tggagccgtt gccagccgcg agacaccgca aggcgctgcg catgctccag 780

caatcgctcg gcctcatagg gcatatcgct atctaaggcc tgacgcgcga gataggtata 840

gcaacgactc agcgcgtcgg gtggactgaa ccggtcgatg aattcgagcc ggtcggctaa 900

cagatgctcg ggcgagtcac ccctctgaca ttcataggct atctccgcca gcagcggcgc 960

cagcgtcgcg ccactggtcg actgggtgcc ggtataacat tcagcctggc gcaacgtttt 1020

ctctgcgtac cacccggctt ttcccagatc gccctgacaa agatgacact gggcaatgat 1080

aaacgcgcga tataccgaga caaacagatt atctaaagga ctttccggag agggcatatg 1140

ctgttgaacc tccagcgcgt cgtgatagcg ctggttaaca acatggcaat agctgagaat 1200

attgcatatc agaccatcaa cccaggtgtc gccgcagggc acttcggcca gcaacggctg 1260

aacaatagcc agactctccg ggatgttttc agcaaaggct tcgcaaattg cccgcacaac 1320

gcgcaattta caccaggtgc tgcgggttaa atcatcacgg tgatgaagca ccatctgatc 1380

gaggttatca agcagctgcc tcgactcatc aaagtggaaa taatgcgcca gtgcccaggc 1440

caggttaatt tgcaggtcaa tgcgcgcagg atcggtgctg ggcggtaaat gatgcatcca 1500

tgagatcagg gtatcgatat ccccttcttc cgccagtgac tgagcgcttg cgccgtcctg 1560

cccggggcta tgcaccggct tgcctgcgct gagcgcatgg cgtaccgcct cagaccacag 1620

cttctgttcg acgaaccaat gactggctaa ttcatgtagc tgtttgcgat caatagcgtt 1680

gttctgctgc agcatggtcc gaagattttc ctgcaacaga ggatggtagc ggaaccagta 1740

gccttgttcg tcaagggctg acaaaaaaag gttgtgtcgc tcaatccatg ccagcatcgc 1800

tttactatca tcacgtccag tcactgcatt gcataattcg gcatttaacc gactgaggaa 1860

ggacgttttc accagaaaat caagaacctg ttccggcagc ggatccagta ccacctcttt 1920

cagatagcgg gcaatagacc gtgttcctcc atgcatattg cgcaacagat gctcgggatc 1980

atgctgtaat tctgcggaca atgaagcgat cttcatccct gcaatccagc cctctgtcac 2040

ggactgtagc cgctgtgcat ggtggttgct gaggggtagc gcaaccgtgc ggctaaaata 2100

gtgttttgtt tcttcgagcg tgaattgcag gtctcgatca tagatttcca ccagttggtc 2160

ctgggcctgc agctggctca gcgcaagatt cgggtggaaa cggctgccaa tgatcagatg 2220

caaagcggca ggcgcatgct tgagtaaata ccccagcgct tcatagaccc cacgatcgtt 2280

aatcacgtgg aagtcgtcga tgatcaggta tacgtcatgc gggcaatagt gtagctggtt 2340

aatgagcccg gccagcagtt gctcggagct ggagagcttc tgttcttcca tgtcacgcca 2400

gaaatcggcg tcccagtcag catagagtgg acgcaatgct tgcagcagat aaggaataaa 2460

ctgccatacg tcatcatcat cctcatcgag gctcagccag gcgatacgtt caccctgggc 2520

gaccatctgc tgatgccatt gcgccaacag cgtggttttg ccaaatccag cgccggcgca 2580

gacgacgccc aaccggcact gctgaacggg attgagaagc tgaagaagcc gggggcgctc 2640

cagcaattgt atcgaggagc gaggcgggac gaatttggtc aggattaacg gcaagcctcg 2700

cgtcagccgc aatggcccgg agaccagtga gggtgattgg cgaccttcta aatccaatgg 2760

cttcatccgt ggtgtctact cgctttgttt tttttcaatt gtacgccagc caccgggatg 2820

acatggggca ggcaaacttt atggctacac aaaatttaga aagtttgacc tcaagcatga 2880

aaacccccac ctaccccccc atgaaggtgg cttcgcactc tctctaaccg ctcgtagatt 2940

cattgcatgg gtgtggccag ggttattcgc cctgtctgtt ggccccgcct ggtgaccttt 3000

attgaggaga attaaacgat gctcagcaaa caggcgttat tgcaggctta ccgcaagatg 3060

cgggagatca ggacctttga agagcggttg catcaggaaa ataccagcgg tgatattccc 3120

ggcttcattc acctttatac cggtgaggag gccatcgcgg tgggggtctg cgaaaattta 3180

acgagcgcag attttattgg ttcaacacac cgtggacatg gccactgtat tgctaaaggg 3240

tgcgacattc acggcatgat ggccgaaata ttcggtaagg acagcgggtt atgtcgcggt 3300

aagggtgggt cgatgcacat tgccgatctg tcgaaaggaa tgctgggagc gaacgctatc 3360

gttgggggag cccctcccct ggccatcggc gccgcgctaa cggcaaagac gctaaaaacc 3420

ggcaacgtcg gtgtctcttt tacgggcgat gggggttcta atcagggcct ggtctttgaa 3480

gccatcaata tggccgtcgt gctccagctc ccagcggtct ttattttcga gaacaacggt 3540

tacggcgaag ggaccggtca tgactacgcc gtgggtgggc gtgatatcgc ccgacgcgcc 3600

gctggcttcg gcctgccggc agtgaccgtt gatggcaccg atttctttgc cgtttatgag 3660

gccacttcag aggcggtcaa acgtgcgcga gaaggcggtg gcccaagcgt cattgaggcc 3720

aaagccttcc gctggcacgg tcattttgag ggggatcccg cgctataccg cgcggaaggt 3780

gaagtgcaac gcctgcgtga acaacatgat ccgctgaaga ttttcaccgc taaggtcaaa 3840

cagcatatca ccccggaaga actggcagcg attgacgagg aagtcgaagc ccttgtcaac 3900

gatgcggtat tgaaggcccg cgccgctgcc tatccggctc cggaagacct gctgacagac 3960

gtttatgtct catactgagg gtgataacta tggcgattaa aacctatcgt gaagcggtca 4020

aggaagccct ggctcaggaa atggaacgcg atgaacgcgt ggtgctcatc ggtgaagatt 4080

tgcgtggcgg tcatggcgga aatgcgcccg aagaggcgaa gatagaagcc tttggcggtg 4140

tgctcggcgt cactaaaggg ctgtggacgc agttcggctc cgatcgggtg atcgacacgc 4200

ccattaccga gtcggccatc atcggaatgg cggccggcgc cgcagcgacg ggtctgcggc 4260

cggtcgcgga attgatgttc atggattttt ttggcgtgag tcacgatgcg ctgtacaacc 4320

aggcggctaa gttccgctac atgtttggtg gcaaagccag agccccgctg gtgatgcgag 4380

ggatgatcgg cgcggggttt tccgccgcgg cccagcattc acagtcaccc tataatatct 4440

ttgccaccac gccagggctg aaggtggtgg tgccctcgac gccttatgac gtcaaaggtc 4500

tgttaatcca gtcaattcgc gacgacgacc cggtggtttt ctgcgagcat aaaatgctgt 4560

acgacctcaa gggcgaggta ccggacgaga gctataccct cccgctaggt gtagccaact 4620

atacccgcga aggagaagac gtcaccatca ttgcgttgtc ggcaatggtg cataaagcca 4680

atcaggtggc ggacaaactg gccagagagg ggatctcggt cgaggtggtc gacccgcgga 4740

ccatttcgcc gctggatgag gaagggattc tggaatcggt ggcgtccacg gggcgggtag 4800

tgattgtcga cgaatccgcg gcacgcttcg gttttgcgca tgatgtcgcg gcgctgatcg 4860

cgtcccaggc attccatttc ctcaaagcgc ccgttctgct ggtgacgccg ccacacacgc 4920

cggtcccgtt ctcccctgct ctcgaaaaac tctggatccc tggcgtagaa cgtatcgaag 4980

cagccgtccg tcaagtgctg gaggattaac ctatgagcga aatcaagacg cttgaaatgc 5040

caaagtgggg gctttccatg gaagaaggct tgctcgctcg gtgggcaatc caggagggtg 5100

acagcttcac cccagggcag gaaatctgtg agattgaaac cagtaaaatc gtcaatgtgc 5160

tggaggcccc ctttgccggt acgttacgtc ggatactcgc ccgagagggt gagacgcttc 5220

aggtaggcgc cgtgctggcc ctggcggctg acgcttcggt cagcgatgct gacctggacg 5280

aattcgctgc cactctggct acggcgaaat ccgcagcccc tggcacggag gctgccgcgc 5340

cggacgtagc ggcacaggca ggcgctaagc caccttccgt tgtttcgccg ccatccaaca 5400

gccccgagcc ccccgttggg cagaccgaca tccccgtcag tctgcaaggc gtgaccgatg 5460

tgactcaggt taatgccacg ccccatgcgt tacgactctc tgcccgctgg ggtgtcgacc 5520

tgaaaaaagt ccgcggcagc gggcgcgggg atcgtatctc tgtttctgat ctggaaagcg 5580

cgatccttgc cgccggcggt cgcctggcct ccccgacgcc ccctgttcgt cgcagcaaag 5640

cgccccgctc gcatgccgat gacagccagg tatcggccac cccgctggcg cgccgtctgg 5700

ccggcaagct gggtatcaac ttgcatgact gccgaagcag cggttcacgc ggccgggtga 5760

gtcgcgatga tgtgctggcc gcggcgttgt tactcgacga gcacccgcag accagcccgg 5820

tacaggagag taccccggta ccctatgaaa gcatccccat gtccggtatg cggcgggcta 5880

tcgcctctcg cctgcaaacg tccaagcaac agtctcccca tttccgtttg agcgtcgatc 5940

tcgatctgga acgactgtta gcgctacgtc aggaaattaa ccgcgaagta cccggcgtca 6000

agatttcggt taatgacctg ctggtgaagg cctgcgccct ggcgctggtg gccgtgcctg 6060

acgtcaacat tcagtttgat gaagcgacac aaagtatccg ccgctttgcg gatgccgaca 6120

tttcagtggc cgttgcgctg cctgccgggc taattacccc tattgttcgc tcggcgaacc 6180

ggaaatcaat tagcgacata tcgaacgaaa ttcactcgct ggtgaccagg gccaaagcgg 6240

gcacgctgaa gccggaagag ttccaggggg ggacctttag cgtgtcaaat ctggggatgc 6300

ttggcgtccg gcagtttgac gccatcatca atccaccgca aagtgcaatc ctcgccattg 6360

gcgccggcga aatgcgggcg gtagtacgcg acgggcaaat cgtcgcgcgc cagcaaatga 6420

cggtatcgct atcctgcgat caccgggtta tcgatggcgc ggcaggtgcg gcttttctcc 6480

gggaactcag gcgactggct gaaaccccaa ccttgatgtt tatccaggag acgagctatg 6540

cacgataaat acgatgtgct gatcatcggc ggtggtcctg ggggatatgt ggccgccatc 6600

cgtgccggcc agctagggct tcgtaccgca ttagtggaga aacaacatct gggcggcatc 6660

tgcctgaact ggggatgcat tccaaccaag gcgctgttgc atggcgctga ggtcgcgcac 6720

agtatcaccc atgccagtca gctgggcatc agcgtgggtg aggtgaacat cgatctgcag 6780

aaactggtgc agtttagccg taccgtatcg caacagctca ccggcggggt ggcgtacctg 6840

ttgaagaaaa atggcgtgca ggtcattgat ggcaccgcgc ggctgcgcgg caaggggcaa 6900

ataacggtcg aggatgcccg aggggagacg cgcgattacc gggccgatca cgtgatcctg 6960

gccacgggcg cccgaccacg cgcattacca ggcatcgcgc cagatggcga atatatctgg 7020

acctatttcg aggcgctgcg gcctaagcta ttgcccaggt cgctattaat catcggttca 7080

ggggcgattg gcgtcgagtt cgccagcctt tataacgatc tgggctgtaa agtgacgctg 7140

gtcgagctgg cgtcgcagtt tttgccagtg gaagatgccg aggtgtctgc agcagtgcgt 7200

aagtcattcg aaaaacgcgg tattcaggtc catacccaga ccctggtgac gcaagtaaag 7260

ctcaccggga ccggggtgcg ctgcaccatg aaaaacaccg gcgccgaata ttctcaggac 7320

gtcgaacgtg tgctgctggc ggtcggcgta cagccgaata ttgaagatct ggggctggaa 7380

acgctgggcg tcgagttaga ccgcggtttt atcaagacgg acaccgcttg tcgtactaac 7440

gtattcgggc tgtatgccat cggcgatgta gccggcccgc cgtgcctggc gcacaaggcc 7500

agccacgaag gcgtgctctg cgttgagaca ctggctggtg tcgaaggcgc ccacccgctt 7560

gatcgcgact atgtgcccgg ttgcacgtat gcccggcccc aggttgccag tctgggcctg 7620

acggaatcga cggccctggc caggggacgg cccgtcagga tcggtaagtt ctcctggcag 7680

aataatggta aggcgctggc cagcggcgag acagagggtt ttgtgaagac gattttcgat 7740

gctgaaaccg gcgagttgct gggcgcgcat atggttggcg cacaggtcac ggaactgatc 7800

caggggtttg gcatcgcccg tcacctggag gccacagatg aaagtctcct gtcgatgatc 7860

ttcgcgcatc caacactttc cgaagcgatg catgaatcca tcctcgcggc ctgcgatcaa 7920

ccattgcatc aataa 7935

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgcaggcc caggaccaac tggtggaaat tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaagccat tggatttaga aggtcgccaa 30

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgctcagca aacaggcgtt attgcaggct attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcagtatgag acataaacgt ctgtcagcag tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggcgatacgt tcaccctggg cgaccatctg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgtcgtcg cgaattgact ggattaacag 30

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cattaccgag tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc cattaccgag 60

tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc 100

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

accacctcga ccgagatccc ctctctggcc tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cggtcaaacg tgcgcgagaa ggcggtggcc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgcctacctg aagcgtctca ccctctcggg 30

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtccgcggc agcgggcgcg gggatcgtat attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccttcaccag caggtcatta accgaaatct tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgagcgaaa tcaagacgct tgaaatgcca 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcacatcgta tttatcgtgc atagctcgtc 30

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttgcccaggt cgctattaat catcggttca attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttacttgcgt caccagggtc tgggtatggt gtaggctgga gctgcttc 48

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgcacgata aatacgatgt gctgatcatc 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca 30

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttacatggtc tgagtgaagg tacgggtaat 30

<210> 25

<211> 2283

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎桿菌

<400> 25

atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttgcgaa aggtgactgg 60

cagaatgaag tcaacgtccg tgactttatt cagaaaaact acaccccata tgaaggcgac 120

gaatccttcc tggctggcgc gactgaagcg accaccaagc tgtgggacag cgtaatggaa 180

ggtgtaaaac aggaaaaccg cactcacgcg cctgttgatt ttgacactgc cctggcctcc 240

accatcacct ctcacgacgc aggctatatc gagaaaggtc tggaaaaaat cgttggtctg 300

cagaccgaag cgccgctgaa acgtgcgatc atcccgttcg gtggtattaa aatggttgaa 360

ggttcctgca aagcgtacaa tcgcgagctg gacccgatgc tgaaaaaaat cttcactgag 420

taccgtaaaa ctcacaacca gggcgttttc gacgtctata ctccggacat cctgcgctgc 480

cgtaaatccg gcgtgctgac tggtctgccg gatgcttacg gccgtggtcg tatcatcggt 540

gactaccgtc gcgttgcgct gtacggtatc gacttcctga tgaaagacaa attcgcccag 600

ttcaactctc tgcaagcgaa actggaaagc ggcgaagatc tggaagcgac catccgtctg 660

cgtgaagaaa tcgctgaaca gcaccgcgcg ctgggccaga tcaaagagat ggcggctaaa 720

tatggctacg acatctccgg tccggcgacc accgctcagg aagctatcca gtggacctac 780

ttcggttacc tggctgccgt taaatctcag aacggcgcgg caatgtcctt cggtcgtacc 840

tccagcttcc tggatatcta catcgaacgt gacctgcagg cgggtaaaat caccgagcaa 900

gacgcgcagg aaatggttga ccacctggtc atgaaactgc gtatggttcg cttcctgcgt 960

accccggaat acgatgaact gttctccggt gacccgattt gggcaacaga atccatcggc 1020

ggtatgggcg ttgacggccg tactctggtg accaaaaaca gcttccgctt cctgaacacc 1080

ctgtacacca tggggccgtc tccggagccg aacatcacta tcctgtggtc tgaaaaactg 1140

ccgctgagct tcaagaaatt cgctgctaaa gtgtccatcg atacctcttc actgcagtat 1200

gagaacgatg acctgatgcg tccggacttc aacaacgacg actacgctat cgcatgctgc 1260

gtaagcccga tggttgttgg taagcaaatg cagttcttcg gtgctcgcgc caacctcgca 1320

aaaaccatgc tgtacgctat caacggcggc gtggatgaaa aactgaaaat gcaggtgggt 1380

ccgaaatctg aaccgatcaa aggcgacgtt ctgaacttcg acgaagtgat ggaacgcatg 1440

gatcacttca tggactggct ggctaaacag tacgtcactg cgctgaacat catccactac 1500

atgcacgaca agtacagcta cgaagcctct ctgatggcgc tgcacgaccg tgacgttatc 1560

cgcaccatgg cgtgtggtat cgcgggtctg tccgttgctg ctgactccct gtccgcaatc 1620

aaatatgcga aagttaaacc gattcgtgac gaagacggtc tggctgtcga cttcgaaatc 1680

gaaggcgaat acccgcagtt tggtaacaac gatgctcgcg tcgatgacat ggccgttgac 1740

ctggttgaac gtttcatgaa gaaaattcag aaactgcaca cctaccgcaa cgcgatcccg 1800

actcagtctg ttctgaccat cacctctaac gtggtatatg gtaagaaaac cggtaacacc 1860

ccagacggtc gtcgcgctgg cgcgccgttc ggaccaggtg ctaacccgat gcacggccgt 1920

gaccagaaag gtgctgttgc ctctctgacc tccgtagcga aactgccgtt tgcttacgcg 1980

aaagatggta tctcttacac cttctctatc gtaccgaacg cgctgggtaa agatgatgaa 2040

gttcgtaaga ccaacctggc gggtctgatg gatggttact tccaccacga agcgtccatc 2100

gaaggtggtc agcacctgaa cgtgaacgta atgaaccgcg aaatgctgct cgacgcgatg 2160

gaaaacccgg aaaaatatcc gcagctgacc atccgcgtat ctggctacgc tgtacgtttt 2220

aactccctga ccaaagaaca gcagcaggac gttattaccc gtaccttcac tcagaccatg 2280

taa 2283

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<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ctggtctgcc ggatgcttac ggccgtggtc attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 27

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtgcagtttc tgaattttct tcatgaaacg tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gtgtcgttaa ttatctcgct cattgagagc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctaatgcatc aggtcggcga gcttatagac 30

<210> 30

<211> 2201

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎桿菌

<400> 30

gtgtcgttaa ttatctcgct cattgagagc gcacagggcc actatccatt ggtattactg 60

atggttttcc tgctcacttt cactaaatcc tgcgcgctgg tgtcgctggc gatcccgggc 120

acctccggcc tgctgctgct ggggacattc gcgtccgcca gcctgggtca tttcctgtta 180

atgtggtcca gcgccagcct cggcgccatc ggcggattct ggctctcgtg gtggttaggc 240

gttcgctatc gtcaccgcct cacgcagttg cgctggctga ccgccgagcg gctggcccgc 300

agtcgactct tttttcagcg ccgcgggctg tgggcggtct ttttcagtcg cttcctctct 360

cccctgcgcg ccaccctgcc cctggtcagc ggcgccagcg gcctgccgct gtggtcgttt 420

cagctggcta acgtcacctc cggtctgctg tggccgtttc tgctgctctc ccccggcgct 480

ttaagcctga gtttgtggtg aaaaaacttt gtctttcaaa gagattccgc aaatccgcga 540

tatgctctag aattaggata agcacctgct atttaaacta ttttttaata attgtacgat 600

tattttaaat atgctaccgt gacgttataa tcactggaga aaagtcttat gaaaatcgcg 660

gtttacagta cgaagcagta cgataaaaag tacctgcagc acgttaatga tacttacggc 720

tttgaactgg aattcttcga cttcctgctg acagagaaaa ccgccaaaac cgcccacggt 780

tgcgaagcgg tatgcatctt cgtcaatgac gacggcagcc gtccggtgct ggaggagctg 840

aaggcccacg gcgtgaagta tatcgccctg cgctgcgccg ggtttaacaa cgtcgacctc 900

gaggcggcga aagcgcttgg cctgcgcgtc gtgcgcgtcc cggcctactc gccggaagcg 960

gtcgctgaac atgcgatcgg catgatgatg tcgcttaacc gccgcatcca ccgcgcctac 1020

cagcgtaccc gtgatgccaa tttctccctc gaaggcctca ccggtttcac catgtacggc 1080

aaaaccgccg gggtgatcgg caccgggaaa attggcgtgg cgatgctacg gatccttaaa 1140

ggcttcggca tgcgtctgct ggcttttgac ccgtacccaa gcgccgccgc gctggagctg 1200

ggggtggaat atgttgacct ggccacgctg tacaaggagt cggacgtgat ctccctgcac 1260

tgcccgctca ccgacgaaaa ctaccatctg ctcaatcgcg aggccttcga tcagatgaag 1320

gacggggtga tggtgattaa caccagccgc ggcgcgctga tcgattccca ggcggccatc 1380

gatgccctga agcaccagaa aatcggcgcg ctggggctgg acgtttatga gaacgaacgc 1440

gatctgttct tcgaagacaa atctaacgac gtgatccagg acgacgtctt ccgtcgcctc 1500

tccgcctgcc acaacgtgct gttcaccggc catcaggcgt tcctcaccgc cgaggcgctg 1560

atcagcattt cggagaccac cctgggcaat ctgcagcagg tcgccaacgg tgaaacctgc 1620

ccgaacgcta tcgtctgatt cctttccctt ttgtgctcct ctccccgggg gagcacattc 1680

agataatccc cacagatccc cgctgcgata ccgttacact ggctttgttt tattagtaat 1740

gtgaatgttt tggagtaaaa atgaacaaat ttgcggcatt actggcggca gggttgctgc 1800

tgtccggctg tgtctataac agtaaggtgt ccaccggcgc ggaacagcta cagcatcatc 1860

gtttcgtgtt gaccagcgtc aacggccagg cggtgaacgc gggcgaccgg ccgctggagc 1920

tgagcttcgg cgagaagacg actcttacgg gcaatatgta tgtttcgggc aatatgtgca 1980

acggcttcag cggggaaggt aaggtgtcgg acggcgagct gaaggttaaa tcgctggcga 2040

tgacccggat gctgtgccac gatgcccagc tcaataccct tgacgcgacc attggtaaga 2100

tgctgcgcga gggcgcgcag gtcgatctga cggaaaacca gttgacgctg gcgaccgccg 2160

accagacgct ggtctataag ctcgccgacc tgatgcatta g 2201

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aactttgtct ttcaaagaga ttccgcaaat attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 32

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aatcagacga tagcgttcgg gcaggtttca tgtaggctgg agctgcttc 49