用于哺乳動物中的去免疫化志賀毒素A亞基效應子多肽的制作方法

本發明涉及由天然存在的志賀毒素的A亞基來源的去免疫化志賀毒素效應子多肽。本發明的多肽單獨的或作為分子(例如，治療劑)的成分施用給需要減少相關的免疫應答的哺乳動物是有益的。例如，本發明的多肽可以用作特異性靶向的分子(例如，免疫毒素和配體-毒素融合體)的成分，用于特定細胞類型的靶向殺傷。本發明的蛋白具有，例如，作為治療劑和診斷劑的成分的用途，用于診斷、預后和治療多種疾病、病癥和病況，包括癌癥、腫瘤、免疫病癥和微生物感染。背景已經通過合理改變毒素的結構、特征和生物學活性合成改造志賀毒素以用于醫學應用(例如，參見US7713915，EP1051482，EP1727827，EP1945660；申請：US2009/0156417A1，EP2228383B1，EP2402367A1，US2013/0196928A1，US2014/023198，US2014/023231，US61/951,110；US61/951,121，它們通過引用分別完全結合在本文中)。即使截短或融合到其他蛋白結構域上，志賀毒素A亞基也是穩定的、有酶活性和細胞毒性的(HaddadJ等，JBacteriol175：4970-8(1993)；Al-JaufyA等，InfectImmun62：956-60(1994)；Al-JaufyA等，InfectImmun63：3073-8(1995)；LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005)；DiR等，Toxicon57：535-39(2011))。這些志賀毒素A亞基-來源的多肽可以通過化學綴合或重組蛋白改造連接或融合到免疫球蛋白結構域或受體配體上，以產生靶向細胞的治療分子。所述分子改造的一個目的是設計具有下述雙重功能性的嵌合分子：1)在系統性施用后，將毒素遞送至生物體內的特定細胞類型或位置；和2)利用在真核細胞中有效的強細胞毒性機制實現針對特定細胞的靶向細胞毒性。涉及由非人來源合成改造的蛋白的治療應用的一種主要的限制是免疫原性。當體內施用分子時，由該分子的抗原性表位誘導抗體和/或免疫應答的能力導致抗原性和/或免疫原性。詳細大部分的治療性蛋白誘導一些種類的免疫應答，范圍從產生低水平、低親和性和暫時的抗體樣IgM到高水平的、高親和性的IgG抗體(SchellekensH，ClinTher24：1720-30(2002)；SchellekensH，NatRevDrugDiscov1：457-62(2002))。治療劑產品的不需要的免疫原性可能導致不利的后果，諸如降低的功效、改變的藥物代謝動力學、全身免疫(generalimmune)和超敏性反應、過敏癥(anaphylaxis)和過敏樣反應(anaphylactoidreactions)(ButtelI等，Biologicals39：100-9(2011))。例如，在患者中產生中和抗體或抗藥物抗體可能限制治療劑的反復劑量或長期給藥的長期有效性。由于不需要的免疫應答可能引起治療劑顯著的安全性和/或功效問題，因此，在開發治療性蛋白時，通常需要使抗原性和/或免疫原性最小化。不幸的是，目前，除了廣泛的實驗室和臨床研究之外，不可能在施用給患者之前預測新治療性蛋白的免疫原性程度(DescotesJ，GouraudA，ExpertOpinDrugMetabToxicol4：1537-49(2008))。這在很大部分上是由于目前缺少對脊椎動物的適用性免疫系統產生抗體的機制的了解和所述機制的異質性。例如，除了可能的具有高溶劑可及性表面積的暴露的親水性和大體積氨基酸有更高的可能性之外，抗原-抗體復合物的分析沒有揭示通用表位的決定性的結構特征。盡管有這些困難，目前利用多種策略來降低蛋白的免疫原性潛力(例如，參見OndaM等，ProcNatlAcadSciUSA105：11311-6(2008)；ValleraD等，MolCancerTher9：1872-83(2010))。可以通過去除或破壞可能被適應性免疫系統識別的表位而降低蛋白的免疫原性潛力。例如，表位破壞或去除可以通過截短、缺失或氨基酸置換或人源化實現(NagataS，PastanI，AdvDrugDelivRev61：977-85(2009)；BakerM等，SelfNonself1：314-22(2010))。對于治療性分子的去免疫化，通常優先鑒定并破壞B-淋巴細胞(B細胞)抗原表位，由于親和力成熟，所述表位可能產生高親和性抗體。在抗原激活后，B細胞能夠分化成漿細胞或記憶細胞。激活的B細胞可以進行種類轉換，從而從表達低親和性IgM和IgD抗體變為表達單一Ig同種型，即，IgG，IgE，IgA，或IgD，其識別離散的抗原性表位(KleinU等，NatRevImmunol8：22-33(2008))。激活的表達單一Ig同種型的B細胞可以進行關于產生具有針對特定的抗原性表位的高親和性的抗體的那些B細胞的選擇。因此，當將治療劑施用給受試者后，治療劑中表位的破壞可以防止特異性結合該表位的高親和性抗體的產生以及靶向該表位的長期存在的記憶B細胞的形成。目前，還沒有用于多肽中準確且全面的B細胞表位預測的標準技術(SathishJ等，NatRevDrugDiscov12：306-24(2013))。B細胞表位可以通過多種經驗方法鑒定，利用誘變和抗體、免疫或免疫球蛋白文庫的噬菌體展示篩選的組合進行鑒定。可以使用計算工具預測推定的B細胞表位，所述計算工具掃描給定多肽中的預測的線性的和不連續的表位，然后可以將其破壞，以使其沉默(Larsen等，ImmunomeRes2：2(2006)；El-Manzalawy等，JMolRecognit21：243-55(2008)；SollnerJ等，ImmunomeRes4：1(2008)；BrysonC等，BioDrugs24：1-8(2010)；YaoB等，PLoSOne8：e62249(2013))。這些計算性B細胞表位預測準確度不高，由此必須進行實驗驗證(參見Nagata，AdvDrugDelivRev61：977-85(2009))。通常通過將推定的B細胞表位內的帶電荷和/或芳香族殘基突變為丙氨酸殘基而嘗試進行表位破壞(OndaM等，JImmunol177：8822-34(2006)；LuiW等，ProcNatlAcadSciUSA109：11782-7(2012)；YumuraK等，ProteinSci22：213-21(2012))。此外，所有潛在的表位的準確繪圖和破壞，同時保持生物治療活性，可以是較大的蛋白難以實現的目標(BrauerF等，AntimicrobAgentsChemother57：678-88(2013))。志賀毒素表現出給改造成用于治療和診斷應用的有用產物的希望，但是，它們潛在的免疫原性可能是在醫學應用中使用的障礙。志賀毒素是一種細菌蛋白，其對于人免疫系統是高度外源的。然而，在志賀毒素A亞基內的抗原性和/或免疫原性位點還沒有被系統性地繪圖。獲得具有減少的抗原性和/或免疫原性的改善的志賀毒素A亞基-來源的多肽將是合乎需要的，其保留有效的志賀毒素效應子功能已用于醫學應用，例如，作為多種涉及向特定細胞類型靶向遞送細胞毒性的治療劑的成分。發明概述本發明提供在哺乳動物中具有減少的抗原性和/或免疫原性潛力的(在本文中稱為“去免疫化的”)志賀毒素效應子多肽。另外，本發明提供包含去免疫化志賀毒素效應子多肽的細胞毒性蛋白和診斷蛋白。由志賀毒素A亞基來源的去免疫化的多肽可以連接一種或多種多肽，其通過特異性的細胞外結合相互作用調節細胞靶向，以允許改造用于細胞內化的細胞類型特異性靶向和志賀毒素細胞毒性的改進的治療劑。連接檢測促進劑與去免疫化志賀毒素效應子區多肽允許改造用于檢測特定細胞類型的存在的改進的診斷分子。本發明的多肽和蛋白具有用于靶向的細胞殺傷、將外源物質遞送到特定細胞類型內、獲得診斷信息和作為治療多種疾病、病癥和病況(包含癌癥、免疫病癥和微生物感染)的治療劑的用途。本發明的多肽包含志賀毒素效應子區，其包含來源于志賀毒素家族的至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽，其中通過突變去除或破壞至少一個預測的B細胞表位，所述突變以保留至少一種志賀毒素效應子功能的方式進行。本發明的多肽的特定實施方案包含志賀毒素效應子區，其包含來源于志賀毒素家族的至少一個成員的A亞基的氨基酸序列的多肽，其中通過突變去除或破壞至少一個預測的B細胞表位，所述突變以保留至少一種志賀毒素效應子功能的方式進行；并且其中不通過任意B細胞表位破壞引入異位的(ectopic)、I類MHC限制性的T細胞表位。I類MHC限制性的T細胞表位是已知的，或可以通過技術人員預測。術語異位的是指在所述多肽去免疫化之前(即，在去除和/或破壞一個或多個B細胞表位之前的親本多肽)，不是天然存在于所述多肽中的I類MHC限制性的T細胞表位。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94-115；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的141-153；SEQIDNO：3的140-156；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的179-190；SEQIDNO：3的179-191；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；或SEQIDNO：3的210-218；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現志賀毒素效應子功能。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94-115；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的141-153；SEQIDNO：3的140-156；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的179-190；SEQIDNO：3的179-191；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；或SEQIDNO：3的210-218；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現顯著水平的志賀毒素效應子功能。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94-115；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的141-153；SEQIDNO：3的140-156；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的179-190；SEQIDNO：3的179-191；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；或SEQIDNO：3的210-218；其中所述志賀毒素效應子區能夠具有志賀毒素效應子功能；并且，其中所述破壞不是單一表位區的，并且不是僅由選自由下述組成的組的氨基酸殘基置換組成：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的S96Y；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的Y114S；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R179A；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R179H；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的L185A；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R188A；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R205A；SEQIDNO：1的R179A/R188A；或SEQIDNO：2；或SEQIDNO：3的A188V。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94-115；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的141-153；SEQIDNO：3的140-156；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的179-190；SEQIDNO：3的179-191；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；或SEQIDNO：3的210-218；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現顯著水平的志賀毒素效應子功能；并且，其中所述破壞不是單一表位區的，并且不是僅由選自由下述組成的組的氨基酸殘基置換組成：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的S96Y；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的Y114S；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R179A；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R179H；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的L185A；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R188A；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R205A；SEQIDNO：1的R179A/R188A；或SEQIDNO：2；或SEQIDNO：3的A188V。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1-15；SEQIDNO：3的3-14；SEQIDNO：3的26-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的27-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的39-48；SEQIDNO：3的42-48；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的53-66；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現志賀毒素效應子功能；并且，其中所述志賀毒素效應子區不包含與志賀毒素A亞基的破壞的表位區重疊的氨基端截短，所述氨基端截短來源于志賀毒素A亞基并且與破壞的表位區重疊。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1-15；SEQIDNO：3的3-14；SEQIDNO：3的26-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的27-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的39-48；SEQIDNO：3的42-48；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的53-66；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現顯著水平的志賀毒素效應子功能；并且，其中所述志賀毒素效應子區不包含與志賀毒素A亞基的破壞的表位區重疊的氨基端截短，所述氨基端截短來源于志賀毒素A亞基并且與破壞的表位區重疊。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1-15；SEQIDNO：3的3-14；ofSEQIDNO：3的26-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的27-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的39-48；SEQIDNO：3的42-48；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的53-66；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現志賀毒素效應子功能；其中所述破壞不是單一表位區的，并且不是僅由氨基酸殘基置換SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R63W組成；并且，其中所述志賀毒素效應子區不包含與志賀毒素A亞基的破壞的表位區重疊的氨基端截短，所述氨基端截短來源于志賀毒素A亞基并且與破壞的表位區重疊。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：3的240-260；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的243-257；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的254-268；SEQIDNO：3的262-278；SEQIDNO：3的281-297；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的285-293；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現志賀毒素效應子功能；并且，其中所述志賀毒素效應子區不包含與志賀毒素A亞基的破壞的表位區重疊的羧基端截短，所述氨基端截短來源于志賀毒素A亞基并且與破壞的表位區重疊。本發明的特定實施方案提供包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其包含來源于志賀毒素家族的一個成員的A亞基的氨基酸序列，所述志賀毒素效應子區包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的志賀毒素A亞基氨基酸序列的至少一個表位區的破壞：SEQIDNO：3的240-260；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的243-257；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的254-268；SEQIDNO：3的262-278；SEQIDNO：3的281-297；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的285-293；其中所述志賀毒素效應子區能夠展現志賀毒素效應子功能；其中所述破壞不是單一表位區的，并且不是僅由選自由下述組成的組的氨基酸殘基置換組成：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R248H；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的A250V；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R251H；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的A253G；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的S254T；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的C261A；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R289K；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的R248H和R251H；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的A253G和S254T；SEQIDNO：1的S247-M252的缺失；SEQIDNO：3的S246F；SEQIDNO：3的A282V；SEQIDNO：3的I291V；SEQIDNO：3的S246F/I291V；并且，其中所述志賀毒素效應子區不包含與志賀毒素A亞基的破壞的表位區重疊的羧基端截短，所述羧基端截短來源于志賀毒素A亞基并且與破壞的表位區重疊。在某些其他實施方案中，本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽包含這樣的表位破壞，所述表位破壞包含在本文提供的表位區內的至少一個氨基酸的缺失。在某些其他實施方案中，本發明的多肽包含這樣的表位破壞，所述表位破壞包含在本文提供的表位區內的至少一個氨基酸的插入。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有氨基酸倒置或其他重排的破壞，其中至少一個倒置的氨基酸是在所述提供的表位區之內。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有氨基酸殘基突變的表位破壞，諸如單一氨基酸置換為非標準氨基酸或具有化學修飾的側鏈的氨基酸。在某些實施方案中，去免疫化志賀毒素效應子區包含這樣的表位破壞，所述表位破壞包含在本文提供的表位區內的氨基酸殘基置換。在某些其他實施方案中，所述多肽包含至少一個成為選自由下述組成的組的氨基酸的置換：A，G，V，L，I，P，C，M，F，S，D，N，Q，H和K。在某些其他實施方案中，所述多肽包含選自由下述組成的組的置換：D置換為A，D置換為G，D置換為V，D置換為L，D置換為I，D置換為F，D置換為S，D置換為Q，E置換為A，E置換為G，E置換為V，E置換為L，E置換為I，E置換為F，E置換為S，E置換為Q，E置換為N，E置換為D，E置換為M，E置換為R，G置換為A，H置換為A，H置換為G，H置換為V，H置換為L，H置換為I，H置換為F，H置換為M，K置換為A，K置換為G，K置換為V，K置換為L，K置換為I，K置換為M，K置換為H，L置換為A，L置換為G，N置換為A，N置換為G，N置換為V，N置換為L，N置換為I，N置換為F，P置換為A，P置換為G，P置換為F，R置換為A，R置換為G，R置換為V，R置換為L，R置換為I，R置換為F，R置換為M，R置換為Q，R置換為S，R置換為K，R置換為H，S置換為A，S置換為G，S置換為V，S置換為L，S置換為I，S置換為F，S置換為M，T置換為A，T置換為G，T置換為V，T置換為L，T置換為I，T置換為F，T置換為M，T置換為S，Y置換為A，Y置換為G，Y置換為V，Y置換為L，Y置換為I，Y置換為F，和Y置換為M。在某些實施方案中，所述去免疫化志賀毒素效應子區包含含有在表位區內的氨基酸殘基置換的破壞，其中所述置換在選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的組的天然位置的氨基酸處發生：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的4；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的8；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的9；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的11；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的43；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的45；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的47；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的48；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的49；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的53；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的55；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的58；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的59；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的60；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的61；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的62；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的96；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的109；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的110；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的112；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的SE147；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的179；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的180；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的181；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的183；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的184；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的185；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的186；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的187；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的188；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的189；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的247；SEQIDNO：3的247；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的248；SEQIDNO：3的250；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的251；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的264；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的265；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的286。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有在表位區內的氨基酸殘基置換的表位破壞，其中所述置換是置換為任意不保守的氨基酸，并且所述之后在選自由下述組成的天然位置的氨基酸殘基的組的氨基酸殘基處發生：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的4；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的8；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的9；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的11；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的43；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的45；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的47；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的48；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的49；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的53；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的55；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的58；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的59；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的60；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的61；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的62；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的96；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的109；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的110；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的112；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的SE147；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的179；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的180；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的181；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的183；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的184；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的185；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的186；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的187；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的188；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的189；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的247；SEQIDNO：3的247；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的248；SEQIDNO：3的250；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的251；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的264；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的265；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的286。不保守氨基酸置換是用具有一種或多種顯著不同的生化特性的另一種氨基酸置換一種氨基酸，諸如例如，帶電荷的置換成不帶電荷的，極性的置換成疏水性的，以及大體積的置換成小的。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有在表位區內的氨基酸殘基置換的表位破壞，其中所述置換發生在天然位置的氨基酸殘基處，并且所述置換是置換成選自由下述組成的組的氨基酸：K1置換成A，G，V，L，I，F，M和H；T4置換成A，G，V，L，1，F，M和S；S8置換成A，G，V，I，L，F和M；T9置換成A，G，V，I，L，F，M和S；S9置換成A，G，V，L，I，F和M；K11置換成A，G，V，L，I，F，M和H；S33置換成A，G，V，L，I，F和M；S45置換成A，G，V，L，I，F和M；T45置換成A，G，V，L，I，F和M；D47置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；N48置換成A，G，V，L和M；L49置換成A或G；D53置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；R55置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D58置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；P59置換成A，G和F；E60置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；E61置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；G62置換成A；D94置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S96置換成A，G，V，I，L，F和M；S109置換成A，G，V，I，L，F和M；T109置換成A，G，V，I，L，F，M和S；G110置換成A；S112置換成A，G，V，L，I，F和M；G147置換成A；R179置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；T180置換成A，G，V，L，I，F，M和S；T181置換成A，G，V，L，I，F，M和S；D183置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；D184置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S186置換成A，G，V，I，L，F和M；G187置換成A；R188置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S189置換成A，G，V，I，L，F和M；R204置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R205置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S247置換成A，G，V，I，L，F和M；Y247置換成A，G，V，L，I，F和M；R248置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R250置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R251置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D264置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；G264置換成A；以及T286置換成A，G，V，L，I，F，M和S。對于特定的實施方案，本發明的多肽包含來源于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸75-251的去免疫化志賀毒素效應子區。在某些其他實施方案中，本發明的多肽包含來源于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸1-251；和/或SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸1-261的去免疫化志賀毒素效應子區。在某些實施方案中，本發明的多肽包含來源于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸1-241的去免疫化志賀毒素效應子區。對于特定的實施方案，本發明的多肽包含含有SEQIDNOs：4-52中的任一個或基本上由SEQIDNOs：4-52中的任一個組成的去免疫化志賀毒素效應子區。本發明的特定實施方案提供包含用于細胞靶向的結合區的蛋白，所述結合區與展現一種或多種志賀毒素效應子功能(例如，細胞毒性活性)的去免疫化志賀毒素亞基A來源的區域連接。本發明的蛋白包含含有本發明的多肽的去免疫化志賀毒素效應子區和結合區，所述結合區包含一種或多種能夠特異性結合至少一種細胞外靶標生物分子的多肽。在本發明的蛋白的特定的實施方案中，所述結合區包含選自由下述組成的組的多肽：互補決定區3(CDR3)片段限制的(constrained)FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4)多肽，單結構域抗體片段(sdAb)，納米抗體，從駱駝科動物(camelid)來源的重鏈抗體結構域(VHH片段)，從軟骨魚(cartilaginousfish)來源的重鏈抗體結構域，免疫球蛋白新抗原受體(IgNARs)，VNAR片段，單鏈可變片段(scFv)，抗體可變片段(Fv)，抗原結合片段(Fab)，Fd片段，小模塊免疫藥物(SMIP)結構域，纖連蛋白-來源的第10個纖連蛋白III型結構域(10Fn3)(例如，單抗體(monobody))，生腱蛋白III型結構域(例如，TNfn3)，錨蛋白重復基序結構域(ARD)，低密度脂蛋白受體來源的A-結構域(LDLR的A結構域或LDLR-A)，脂質運載蛋白(anticalin)，Kunitz結構域，蛋白-A-來源的Z結構域，γ-B結晶來源的結構域(Affilin)，泛蛋白-來源的結構域，Sac7d-來源的多肽，Fyn-來源的SH2結構域(affitin)，小蛋白(miniprotein)，C-型凝集素-樣結構域支架，改造的抗體模擬物，以及任何前述物質的保留結合功能性的任何遺傳操作的對應物。在本發明特定的實施方案中，向與細胞毒性蛋白的結合區的細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞施用本發明的去免疫化的細胞毒性蛋白后，所述細胞毒性蛋白能夠引起該細胞死亡。在本發明特定的實施方案中，向相對于細胞外靶標生物分子的存在而不同的兩種細胞類型群體施用本發明的去免疫化的細胞毒性蛋白后，所述細胞毒性蛋白能夠引起與其結合區的細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞類型的細胞死亡，其CD50比針對沒有與所述細胞毒性蛋白的結合區的細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞類型的CD50小至少三倍。在本發明的蛋白的特定的實施方案中，設計或選擇結合區與細胞外靶標生物分子結合的能力，所述細胞外靶標生物分子選自由下述組成的組：CD20，CD22，CD40，CD79，CD25，CD30，HER2/neu/ErbB2，EGFR，EpCAM，EphB2，前列腺特異性的膜抗原，Cripto，CDCP1，內皮因子，成纖維細胞活化的蛋白，Lewis-Y，CD19，CD21，CS1/SLAMF7，CD33，CD52，EpCAM，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，碳酸酐酶IX，葉酸結合蛋白，神經節苷脂GD2，神經節苷脂GD3，神經節苷脂GM2，神經節苷脂Lewis-Y2，VEGFR，αVβ3，α5β1，ErbB1/EGFR，Erb3，c-MET，IGF1R，EphA3，TRAIL-R1，TRAIL-R2，RANKL，FAP，生腱蛋白，CD64，間皮素(mesothelin)，BRCA1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-連環蛋白，MUM-1，胱天蛋白酶-8，KIAA0205，HPVE6，SART-1，PRAME，癌胚抗原，前列腺特異性抗原，前列腺干細胞抗原，人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羥化酶，EphA2，HER3/ErbB-3，MUC1，MART-1/MelanA，gp100，酪氨酸酶相關的抗原，HPV-E7，EB病毒(Epstein-Barrvirus)抗原，Bcr-Abl，甲胎蛋白抗原，17-A1，膀胱腫瘤抗原，CD38，CD15，CD23，CD52，CD53，CD88，CD129，CD183，CD191，CD193，CD244，CD294，CD305，C3AR，FceRIa，半乳凝素-9，mrp-14，siglec-8，siglec-10，CD49d，CD13，CD44，CD54，CD63，CD69，CD123，CD193，TLR4，FceRIa，IgE，CD107a，CD203c，CD14，CD15，CD33，CD64，CD68，CD80，CD86，CD105，CD115，F4/80，ILT-3，半乳凝素-3，CD11a-c，GITRL，MHCII類，CD284-TLR4，CD107-Mac3，CD195-CCR5，HLA-DR，CD16/32，CD282-TLR2，CD11c，CD123，以及前述任一種的任意免疫原性片段。在某些實施方案中，本發明的蛋白包含KDEL家族成員的羧基端內質網保留/回收信號基序(carboxy-terminalendoplasmicreticulumretention/retrievalsignalmotif)。在某些其他實施方案中，本發明的蛋白包含選自由下述組成的組的羧基端內質網保留/回收信號基序：KDEL，HDEF，HDEL，RDEF，RDEL，WDEL，YDEL，HEEF，HEEL，KEEL，REEL，KAEL，KCEL，KFEL，KGEL，KHEL，KLEL，KNEL，KQEL，KREL，KSEL，KVEL，KWEL，KYEL，KEDL，KIEL，DKEL，FDEL，KDEF，KKEL，HADL，HAEL，HIEL，HNEL，HTEL，KTEL，HVEL，NDEL，QDEL，REDL，RNEL，RTDL，RTEL，SDEL，TDEL，和SKEL。對于特定的實施方案，本發明的蛋白包含結合區和去免疫化志賀毒素效應子區，它們在該蛋白內物理定向，以使所述結合區不位于所述志賀毒素效應子區的氨基端附近。對于特定的實施方案，本發明的蛋白包含來源于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸75-251的志賀毒素效應子區。某些其他實施方案提供這樣的蛋白，其中所述志賀毒素效應子區來源于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸1-251；和/或SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸1-261。在某些實施方案中，本發明的蛋白包含來源于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的氨基酸1-241的志賀毒素效應子區。對于特定的實施方案，本發明的蛋白包含含有SEQIDNOs：4-52中的任一種或基本上由SEQIDNOs：4-52中的任一種組成的去免疫化志賀毒素效應子區。對于特定的實施方案，本發明的蛋白包含下述或基本上由下述組成：SEQIDNO：53，SEQIDNO：54，SEQIDNO：55，SEQIDNO：56，SEQIDNO：57，SEQIDNO：58，或SEQIDNO：59。在某些實施方案中，本發明的蛋白包含去免疫化志賀毒素效應子區，相對于志賀毒素一個成員的天然存在的A亞基，其進一步包含改變志賀毒素效應子區的酶活性的突變，所述突變選自至少一個氨基酸殘基缺失或置換，諸如，例如，SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3中的A231E，R75A，Y77S，Y114S，E167D，R170A，R176K和/或W203A。在某些其他實施方案中，本發明的蛋白包含減少或消除催化活性但保留至少一種其他志賀毒素效應子功能的突變。本發明還提供了藥物組合物，其包含本發明的多肽和/或本發明的蛋白和至少一種藥學上可接受的賦形劑或載體；和這樣的蛋白或包含所述蛋白的組合物在如本文中進一步描述的本發明的方法中的用途。除了本發明的多肽、蛋白和組合物以外，能夠編碼包含去免疫化志賀毒素效應子區的多肽或包含本發明的去免疫化志賀毒素效應子區的本發明的蛋白的多核苷酸也在本發明范圍內，以及包含本發明的多核苷酸的表達載體和包含本發明的表達載體的宿主細胞。包含表達載體的宿主細胞可以用在例如通過重組表達生產本發明的多肽和/或蛋白、或其多肽組分或片段的方法中。另外，本發明提供了選擇性地殺傷細胞的方法，所述方法包括下述步驟：使細胞與本發明的蛋白或包含本發明的這類蛋白的藥物組合物接觸。在某些實施方案中，所述接觸細胞的步驟在體外發生。在某些其它實施方案中，所述接觸細胞的步驟在體內發生。本發明還提供了治療有此需要的患者中的疾病、病癥和/或病況的方法，所述方法包括下述步驟：給有此需要的患者施用治療有效量的包含本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽的組合物、包含前述多肽的多肽和/或蛋白、或包含前述任一種的組合物(例如，藥物組合物)。在某些實施方案中，要使用本發明的這一方法治療的疾病、病癥或病況選自：癌癥、腫瘤、免疫病癥或微生物感染。在該方法的某些實施方案中，要治療的癌癥選自由下述組成的組：骨癌、乳腺癌、中樞/周圍神經系統癌癥、胃腸癌、生殖細胞癌、腺癌、頭頸癌、血液學癌癥、腎-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮膚癌和子宮癌。在該方法的某些實施方案中，要治療的免疫病癥是與選自由以下組成的組的疾病有關的免疫病癥：淀粉樣變性(amyloidosis)、強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、哮喘、克羅恩病(Crohn’sdisease)、糖尿病、移植物排斥(graftrejection)、移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、溶血性尿毒癥綜合征(hemolyticuremicsyndrome)、HIV相關的疾病、紅斑狼瘡(lupuserythematosus)、多發性硬化(multiplesclerosis)、多動脈炎(polyarteritis)、銀屑病(psoriasis)、銀屑病關節炎(psoriaticarthritis)、類風濕性關節炎(rheumatoidarthritis)、硬皮病(scleroderma)、膿毒性休克(septicshock)、舍格倫綜合征(Sjorgren’ssyndrome)、潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis)和血管炎(vasculitis)。在本發明的某些實施方案中是用于治療或預防癌癥、腫瘤、免疫病癥或微生物感染的包含本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽的組合物、包含它的多肽和/或蛋白、或包含前述任一種的組合物。在本發明的某些實施方案中是本發明的主題組合物在藥物制備中的用途，所述藥物用于治療或預防癌癥、腫瘤、免疫病癥或微生物感染。本發明的蛋白的某些實施方案可以用于將一種或多種另外的外源物質遞送進與本發明的蛋白的細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞中。另外，本發明提供了一種用于將外源物質遞送至細胞內部的方法，所述方法包括使體外或體內細胞與本發明的蛋白、藥物組合物和/或診斷組合物接觸。本發明還提供了一種用于將外源物質遞送至有此需要的患者中的細胞內部的方法，所述方法包括下述步驟：給所述患者施用本發明的蛋白，其中所述靶細胞與本發明的蛋白的細胞外靶標生物分子物理偶聯。在本發明的某些實施方案中是本發明的化合物(例如多肽或蛋白)和/或本發明的組合物(例如藥物組合物或診斷組合物)在疾病、病癥或病況的診斷、預后或表征中的用途。在本發明的某些實施方案中是診斷組合物，其包含本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽、包含前述多肽的多肽和/或蛋白、或包含前述任一種的組合物和檢測促進劑，所述檢測促進劑用于收集信息，諸如診斷上有用的關于細胞類型、組織、器官、疾病、病癥、狀況或患者的信息。在本發明的某些實施方案中是使用本發明的蛋白和/或診斷組合物檢測細胞的方法，所述方法包括下述步驟：使細胞與所述蛋白和/或診斷組合物接觸，并且檢測所述蛋白和/或診斷組合物的存在。在某些實施方案中，所述接觸細胞的步驟發生在體外。在某些實施方案中，所述接觸細胞的步驟發生在體內。在某些實施方案中，所述檢測細胞的步驟發生在體外。在某些實施方案中，所述檢測細胞的步驟發生在體內。例如，本發明的診斷組合物可以用于如下檢測體內細胞：給哺乳動物受試者施用包含本發明的蛋白的組合物，所述組合物包含檢測促進劑，并然后在體外或在體內檢測本發明的蛋白的存在。收集的信息可以關于與本發明的蛋白的結合區的細胞外靶標物理偶聯的細胞的存在，且可以用在疾病、病癥或病況的診斷、預后、表征和/或治療中。本發明的某些化合物(例如多肽和蛋白)、本發明的組合物(例如藥物組合物和診斷組合物)和本發明的方法可以用于確定患者是否屬于對本發明的藥物組合物做出應答的組。本發明的多肽的某些實施方案可以用作免疫原或用作免疫原的組分用于哺乳動物的免疫接種和/或疫苗接種。在本發明的某些實施方案中是試劑盒，其包含本發明的主題組合物和任選的使用說明書、另外的試劑和/或藥物遞送裝置。參考以下描述、所附權利要求和附圖，會更好地理解本發明的這些和其它特征、方面和優點。本發明的前述要素可以單個地組合或自由地除去以便形成本發明的其它實施方案，在下文中沒有反對這樣的組合或除去的任何陳述。附圖簡要說明圖1顯示了示例性的去免疫化多肽和細胞毒性蛋白的總布置。圖2顯示去免疫化志賀毒素效應子區中的D58A置換有效地破壞了在變性條件下由pAb2識別的表位，并且降低了包含志賀毒素效應子區的多肽的抗原性。圖3顯示在去免疫化志賀毒素效應子區的多表位區破壞變體的情形中，D58A置換有效地破壞在變性條件下由pAb2識別的表位，并且降低了志賀毒素效應子區的多肽的抗原性。圖4顯示去免疫化志賀毒素效應子區的多表位區破壞變體破壞在變性條件下由pAb2和mAb1識別的表位。與包含親本、野生型志賀毒素效應子區的多肽相比，這些多表位區破壞變體具有降低的抗原性。圖5顯示去免疫化志賀毒素效應子區的多表位區破壞有效地破壞在變性條件下由pAb2和/或mAb1識別的表位。與包含親本、野生型志賀毒素效應子區的多肽相比，這些多表位區破壞變體具有降低的抗原性。圖6顯示包含多個表位區破壞的去免疫化志賀毒素效應子區產生對在天然蛋白折疊條件下由mAb1識別的表位的非常有效的破壞。與包含親本、野生型志賀毒素效應子區的多肽相比，該多表位區破壞變體具有降低的抗原性。圖7顯示包含多個表位區破壞的去免疫化志賀毒素效應子區引起哺乳動物免疫系統減少的體內抗體應答。與包含親本、野生型志賀毒素效應子區的多肽相比，該多表位區破壞變體具有降低的抗原性。詳述在下文中使用示例性的、非限制性的實施方案和參照附圖更充分地描述本發明。但是，本發明可以以許多不同的形式實施，并且不應被理解為限于下面闡述的實施方案。相反，提供這些實施方案使得本公開內容更透徹并且將本發明的范圍傳遞給本領域技術人員。為了可以更容易地理解本發明，在下面定義某些術語。在發明詳述內可以發現另外的定義。如在說明書和所附權利要求書中使用的，除非上下文另外清楚地指明，術語“一個”、“一種”和“所述”包括單數和復數指示物。如在說明書和所附權利要求書中使用的，當提及兩種物質A和B時，術語“和/或”是指A和B中的至少一種。如在說明書和所附權利要求書中使用的，當提及超過兩種物質諸如A、B和C時，術語“和/或”是指A、B、或C中的至少一種，或A、B、或C的任何組合中的至少一種(每種物質以單個或多個可能性存在)。貫穿本說明書，詞語“包含”或變體諸如“包括”或“含有”應理解為暗示包括所述的整數(或組分)或整數(或組分)的組，但是不排除任何其它整數(或組分)或整數(或組分)的組。貫穿本說明書，術語“包括”用于指“包括、但不限于”。“包括”和“包括、但不限于”互換使用。術語“氨基酸殘基”或“氨基酸”包括對結合到蛋白、多肽或肽中的氨基酸的提及。術語“多肽”包括氨基酸或氨基酸殘基的任何聚合物。術語“多肽序列”表示在物理上構成多肽的一系列氨基酸或氨基酸殘基。“蛋白”是包含一個或多個多肽“鏈”的大分子。“肽”是尺寸小于總計15-20個氨基酸殘基的小多肽。術語“氨基酸序列”表示在物理上構成肽或多肽的一系列氨基酸或氨基酸殘基，取決于長度。除非另有說明，本文中公開的多肽和蛋白序列從左至右書寫，代表它們從氨基端至羧基端的次序。術語“氨基酸”、“氨基酸殘基”、“氨基酸序列”或“多肽序列”包括天然存在的氨基酸，且除非另有限制，也包括可以以與天然存在的氨基酸類似方式起作用的天然氨基酸的已知類似物，諸如硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、羥脯氨酸羥丁賴氨酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。用如下表A中的簡寫名稱描述在本文中提及的氨基酸：表A.氨基酸命名法關于多肽的短語“保守置換”表示多肽的氨基酸組成的變化，所述變化不會實質上改變整體多肽的功能和結構(參見Creighton，Proteins：StructuresandMolecularProperties(W.H.FreemanandCompany，NewYork(第2版，1992))。本文中使用的術語“表達”(“expressed，”“expressing，”或“expresses，”)及其語法變體表示多核苷酸或核酸翻譯成多肽或蛋白。表達的多肽或蛋白可以保留在細胞內，變成細胞表面膜的組分，或者被分泌進細胞外空間中。本文中使用的符號“α”是能夠與該符號后的生物分子結合的免疫球蛋白型結合區的簡寫。符號“α”用于表示免疫球蛋白型結合區的功能特性，這基于它與該符號后的生物分子結合的能力。符號“：：”是指在它前面和后面的多肽區域物理地連接在一起以形成連續多肽。當用在本說明書中時，符號“/”在位于兩個氨基酸殘基置換之間時意指在“/”任一側的氨基酸殘基置換或包含在相同的分子內。就本發明的目的而言，短語“來源于”是指，所述多肽區域包含最初在蛋白中發現的氨基酸序列，且其現在可能包含由原始序列的添加、缺失、截短或其它改變，使得總功能和結構是基本上保守的。就本發明的目的而言，術語“效應子”是指提供生物活性，諸如細胞毒性、生物信號傳導、酶促催化、亞細胞按路線發送(subcellularrouting)、和/或導致一種或多種因子的募集的分子間結合、和/或變構效應。就本發明的目的而言，志賀毒素效應子功能是由來源于志賀毒素A亞基的多肽區賦予的生物活性。志賀毒素效應子功能的非限制性實例包括細胞內化、亞細胞按路線發送、催化活性和細胞毒性。志賀毒素催化活性的非限制性實例包括核糖體失活、蛋白合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸：腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性和DNA酶活性。RIPs可以使核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和polyA)和病毒核酸去嘌呤化(depurinate)(BarbieriL等，BiochemJ286：1-4(1992)；BarbieriL等，Nature372：624(1994)；LingJ等，FEBSLett345：143-6(1994)；BarbieriL等，BiochemJ319：507-13(1996)；RoncuzziL，Gasperi-CampaniA，FEBSLett392：16-20(1996)；StirpeF等，FEBSLett382：309-12(1996)；BarbieriL等，NucleicAcidsRes25：518-22(1997)；WangP，TumerN，NucleicAcidsRes27：1900-5(1999)；BarbieriL等，BiochimBiophysActa1480：258-66(2000)；BarbieriL等，JBiochem128：883-9(2000)；BaggaS等，JBiolChem278：4813-20(2003)；PicardD等，JBiolChem280：20069-75(2005))。一些RIPs表現出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(EriceA等，AntimicrobAgentsChemother37：835-8(1993)；AuT等，FEBSLett471：169-72(2000)；ParikhB，TumerN，MiniRevMedChem4：523-43(2004)；SharmaN等，PlantPhysiol134：171-81(2004))。已經在體外和在體內觀察到志賀毒素催化活性。用于志賀毒素效應子活性的測定可以測量多種活性，諸如，例如，蛋白合成抑制活性、去嘌呤活性、細胞生長抑制、細胞毒性、超螺旋結構DNA松弛活性和/或核酸酶活性。關于細胞毒性蛋白的細胞毒性活性的術語“選擇性細胞毒性”是指在靶向細胞群體和非靶向局外細胞群體之間的細胞毒性的相對水平，其可以表示為針對靶向細胞類型的半最大細胞毒性濃度(CD50)與針對非靶向細胞類型的CD50的比例，以顯示對靶向細胞類型的細胞殺傷的優先性。本文中使用的志賀毒素效應子功能的保留表示，如通過具有再現性的適當定量測定所測量的，與野生型志賀毒素效應子多肽對照相當的志賀毒素功能活性水平。對于核糖體抑制，保留的志賀毒素效應子功能是展現10,000pM以下的IC50。對于在靶標陽性細胞殺傷測定中的細胞毒性，取決于細胞類型和其適當的細胞外靶標生物分子的表達，保留的志賀毒素效應子功能是展現1,000nM以下的IC50。用于本文時，“去免疫化”意指在施用給哺乳動物后減少的抗原性和/或免疫原性潛力。這包括降低的整體抗原性和/或免疫原性潛力，而不管一個或多個新表位的引入。引言本發明提供來源于志賀毒素家族成員的A亞基的具有減少的免疫原性潛力的改進的多肽。這些改進的志賀毒素效應子多肽可以用在多種組合物中，例如，細胞毒性治療劑、治療遞送劑、診斷分子、和免疫物質中。盡管使用志賀毒素作為治療劑的組分具有吸引性，但是細菌毒素傾向于對哺乳動物是免疫原性的。蛋白治療劑中不需要的免疫原性已經導致降低的功效、不可預測的藥物代謝動力學和不需要的免疫應答，這限制劑量和反復給藥。盡管需要包含具有降低的免疫原性潛力的去免疫化志賀毒素來源的多肽的分子來輔助避免不需要的免疫應答，但是，還沒有成功鑒定并去除內部B細胞表位同時保留志賀毒素效應子功能的可預測的方法。盡管一些抗原性和/或免疫原性表位可以通過截短去除，但是，主要的挑戰是使志賀毒素多肽的效應子結構域(例如，其酶結構域)內的表位沉默，同時保留需要的志賀毒素效應子功能，例如，有效的核糖體抑制和指導亞細胞按路線發送。盡管這些內部表位可以通過突變和/或化學修飾減少或消除，但是，挑戰是這樣做的同時要保留志賀毒素效應子功能。在蛋白中通過氨基酸置換破壞抗原性位點同時保持蛋白功能是一個顯著的挑戰，原因在于必須保留功能上限制的殘基和結構，并且某些位置不耐受某些氨基酸置換，不影響蛋白結構、穩定性和/或功能(參見CantorJ等，MethodsinEnzymology502：Ch.12pp.291-301(2012))。進行了廣泛的關于志賀毒素來源的多肽區的經驗性實驗，得到了本發明。如在實施例中更詳細描述的，在預測的B細胞表位內產生氨基酸置換，并且檢測所得到的多肽是否保留需要的志賀毒素效應子功能。預測每個表位的抗原性和/或免疫原性被所提供的氨基酸置換減少或消除，其又降低了包含至少一個所提供的表位破壞的任意主題組合物的整體抗原性和/或免疫原性。盡管對相關性較遠的細菌蛋白毒素，諸如假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素A進行了去免疫化的嘗試，鑒定具有降低的免疫原性潛力同時保留志賀毒素功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽是不能想當然地預測的。包含本發明的去免疫化志賀毒素效應子區的多肽可以用作重組免疫毒素和配體-毒素融合體的組分，用于特定細胞類型的靶向性殺傷和多種疾病的治療，所述疾病包括癌癥、免疫病癥和微生物感染。另外，本發明的多肽可以用作細胞類型特異性的內在化分子的組分，用于外源物質的精確遞送，所述外源物質諸如用于診斷信息收集的檢測促進劑。此外，本發明的多肽，獨立的或作為志賀全毒素的組分，可以用在設計避免針對特定表位的抗體產生同時引發針對志賀毒素的免疫應答的免疫物質中。I.志賀毒素效應子多肽和本發明的蛋白的一般結構本發明提供多種包含具有降低的免疫原性潛力的但是保留志賀毒素效應子功能性(諸如細胞內化、亞細胞按路線發送、催化活性和細胞毒性)的志賀毒素效應子區的多肽。本發明的多肽包含含有本文所述的至少一個表位區的破壞的志賀毒素效應子區。本發明的蛋白包含去免疫化志賀毒素效應子區和結合區，所述結合區包含一種或多種能夠特異性結合至少一種細胞外靶標生物分子的多肽。蛋白毒素志賀毒素家族由多種天然存在的毒素構成，它們在結構和功能上是相關的，例如，志賀毒素，志賀樣毒素1，和志賀樣毒素2(JohannesL，W，NatRevMicrobiol8：105-16(2010))。志賀毒素家族的成員共有相同的整體結構和作用機制(Engedal，N等，MicrobialBiotech4：32-46(2011))。例如，Stx、SLT-1和SLT-2在不含細胞的系統中表現出不可區分的酶活性(HeadS等，JBiolChem266：3617-21(1991)；TeshV等，InfectImmun61：3392-402(1993)；BrigottiM等，Toxicon35：1431-1437(1997))。A.去免疫化志賀毒素效應子區多肽就本發明的目的而言，短語“志賀毒素效應子區”是指來源于志賀毒素家族的成員的志賀毒素A亞基的多肽區域，其能夠展現至少一種志賀毒素功能。志賀毒素功能包括，例如，細胞進入、脂質膜變形、指導亞細胞按路線發送、避免降解、催化滅活核糖體、實施細胞毒性和實施細胞生長抑制作用。用于本文時，保留“顯著的”志賀毒素效應子功能是指，通過具有再現性的適當的定量測定測量的，與野生型志賀毒素效應子多肽對照相當的志賀毒素功能活性水平。對于體外核糖體抑制，顯著的志賀毒素效應子功能是展現300pM以下的IC50，這取決于核糖體的來源(例如，細菌、古細菌(archaea)或真核生物(藻類，真菌，植物或動物))。與催化失活的SLT-1A1-251雙重突變體(Y77S，E167D)的約100,000pM的IC50相比，這是顯著更大的抑制作用。對于在實驗室細胞培養物中的靶標陽性細胞殺傷測定中的細胞毒性，顯著的志賀毒素效應子功能是展現100、50或30nM以下的CD50，這取決于細胞系和其對適當的細胞外靶標生物分子的表達。與單獨的沒有靶向細胞的結合區的SLT-1A(其具有100-10,000nM的CD50)相比，這是對適當的靶細胞系顯著更高的細胞毒性，其取決于細胞系。對于一些樣品，由于不能收集必要的數據點進行準確的曲線擬合，IC50或CD50的準確值可能是不能獲得的。當確定顯著的志賀毒素效應子功能活性時，不應該考慮不準確的IC50和/或CD50值。在示例性的志賀毒素效應子功能測定(諸如，例如，在實施例中所述的測定)的數據分析中描述為不足以準確擬合曲線的數據不應該被認為代表實際的志賀毒素效應子功能。例如，如果在給定樣品的濃度系列中分別不發生大于50％的核糖體抑制或細胞死亡，則理論上不可能確定IC50和CD50。不能檢測志賀毒素效應子功能的活性可能是由于不適當的表達、多肽折疊、和/或多肽穩定性，而不是缺少細胞進入、亞細胞按路線發送和/或酶活性。志賀毒素效應子功能的測定可能不需要很多本發明的多肽來測量顯著量的志賀毒素效應子功能活性。在憑經驗確定低或沒有效應子功能的潛在的原因與蛋白表達或穩定性相關的程度上，本領域技術人員可以能夠利用本領域已知的蛋白化學和分子改造技術抵消這些因素，以使志賀毒素功能性效應子活性可以被恢復并測量。例如，基于不適當的細胞的表達可以通過使用不同的表達控制序列進行抵消；不適當的多肽折疊和/或穩定性可以受益于穩定末端序列、或穩定蛋白三維結構的非效應子區中的補償性突變等。當關于個體志賀毒素功能的新測定可用時，可以分析去免疫化志賀毒素效應子多肽的任意水平的這些志賀毒素效應子功能，諸如是野生型志賀毒素效應子多肽的活性的1000-倍或100-倍以下，或與功能性敲除的志賀毒素效應子多肽相比，展現3-倍至30-倍或更高的活性。某些志賀毒素效應子功能是不容易測量的，例如，亞細胞按路線發送功能。目前沒有途徑、定量測定區分去免疫化志賀毒素效應子多肽不是細胞毒性的是否是由于不正確的亞細胞按路線發送，但是，在測試可用的時候，可以與適當的野生型志賀毒素效應子區相比，分析去免疫化志賀毒素效應子多肽任意顯著水平的亞細胞按路線發送。應該注意，即使志賀毒素效應子多肽的細胞毒性相對于野生型減少了，在實踐中，使用減毒的去免疫化志賀毒素效應子多肽的應用可以與使用野生型志賀毒素效應子多肽一樣有效或更有效，原因在于，減少的抗原性和/或免疫原性可能補償減少的細胞毒性，諸如，例如，通過允許更高的劑量或更反復的給藥補償。野生型志賀毒素效應子多肽是非常有效的，能夠僅以到達細胞質的一個分子或內在化的大約40個分子進行殺傷。與野生型志賀毒素效應子多肽相比，具有甚至相當減少的志賀毒素效應子功能(諸如，例如，亞細胞按路線發送或細胞毒性)的去免疫化志賀毒素效應子多肽，對于涉及靶向的細胞殺傷和/或特定的細胞檢測的實際應用，可能仍然是足夠有效的。志賀毒素家族包括從痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)血清型1分離的真正志賀毒素(Stx)、從腸出血性大腸桿菌(E.coli)的血清型分離的志賀樣毒素1變體(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)以及從腸出血性大腸桿菌的血清型分離的志賀樣毒素2變體(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1與Stx僅有一個殘基不同，并且二者被稱為維羅細胞毒素(Verocytotoxins)或維羅毒素(Verotoxins)(VTs)(O’Brien，CurrTopMicrobiolImmunol180：65-94(1992))。盡管SLT1和SLT2變體彼此在氨基酸序列水平上僅約53-60％相似，但是它們共有志賀毒素家族成員所共有的酶活性和細胞毒性機制(Johannes，NatRevMicrobiol8：105-16(2010))。已經描述了超過39種不同的志賀毒素，諸如限定的亞型Stx1a、Stx1c、Stx1d和Stx2a-g(ScheutzF等，JClinMicrobiol50：2951-63(2012))。由于志賀毒素編碼基因能夠通過水平基因轉移在細菌物種之間傳播(StrauchE等，InfectImmun69：7588-95(2001)；ZhaxybayevaO，DoolittleW，CurrBiol21：R242-6(2011))，因此，志賀毒素家族的成員不天然限于任意細菌物種。作為物種之間轉移的實例，在從患者分離的溶血不動桿菌(A.haemolyticus)菌株中發現志賀毒素(GrotiuzG等，JClinMicrobiol44：3838-41(2006))。當編碼志賀毒素的多核苷酸進入新的亞種或物種時，推測志賀毒素氨基酸序列由于基因漂變和/或選擇壓力能夠發展少量序列變化，同時仍然保留志賀毒素家族成員共有的細胞毒性機制(參見Scheutz，JClinMicrobiol50：2951-63(2012))。本發明的多肽包含來源于志賀毒素家族成員的A亞基的志賀毒素效應子區，其具有至少一個推定的破壞的表位區，從而在施用給哺乳動物后降低所述多肽的抗原性和/或免疫原性潛力。術語“破壞的”或“破壞”與表位區相關用在本文時，是指表位區中至少一個氨基酸的缺失，兩個以上氨基酸的倒置，其中至少一個倒置的氨基酸是在表位區，在表位區插入至少一個氨基酸，和表位區至少一個氨基酸的突變。通過突變進行的表位區破壞包括用非標準氨基酸和/或非天然氨基酸進行的氨基酸置換。表位區可以備選地通過突變破壞，所述突變包括通過加入掩蔽表位區的至少一個氨基酸的共價連接的化學結構修飾氨基酸，例如，參見聚乙二醇化(參見ZhangC等，BioDrugs26：209-15(2012)和小分子輔助物(FlowerD，ExpertOpinDrugDiscov7：807-17(2012))。在本文中參照序列表中提供的天然志賀毒素A亞基的特定氨基酸位置顯示特定的表位區和破壞，注意，天然存在的志賀毒素A亞基可以包含在其氨基端含有約22個氨基酸的信號序列的前體形式，信號序列被去除，產生成熟的志賀毒素A亞基，并且可被熟練的工作人員識別。此外，在本文中，參照在天然志賀毒素A亞基內的特定位置天然存在的特定氨基酸(例如，S表示絲氨酸殘基)(例如，S33表示在氨基端位置33的絲氨酸殘基)，在該氨基酸后是所討論的以特定的突變置換的殘基(例如，S33I表示在氨基端氨基酸殘基33的絲氨酸置換為異亮氨酸的氨基酸置換)，來表示特定的表位區破壞。本發明的某些實施方案提供包含含有來源于志賀毒素家族成員的A亞基的氨基酸序列的志賀毒素效應子區的多肽，所述志賀毒素效應子區包含本文提供的至少一個表位區的破壞(例如，見表1、2和3)。在某些實施方案中，本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽可以包含下述或基本上由下述組成：包含選自由下述組成的天然位置的氨基酸的組的至少一個氨基酸序列的破壞的全長志賀毒素A亞基(例如，SLT-1A(SEQIDNO：1)，StxA(SEQIDNO：2)，或SLT-2A(SEQIDNO：3))：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1-15；SEQIDNO：3的3-14；SEQIDNO：3的26-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的27-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的39-48；SEQIDNO：3的42-48；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的53-66；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94-115；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的141-153；SEQIDNO：3的140-156；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的179-190；SEQIDNO：3的179-191；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：3的210-218；SEQIDNO：3的240-258；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的243-257；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的254-268；SEQIDNO：3的262-278；ofSEQIDNO：3的281-297；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的285-293，或在保守的志賀毒素效應子多肽和/或非天然志賀毒素效應子多肽序列中的等價位置。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽可以包含截短的志賀毒素A亞基或基本上由截短的志賀毒素A亞基組成。志賀毒素A亞基的截短可能導致整個表位區的缺失，但不影響毒素效應子催化活性和細胞毒性。展現顯著的酶活性的最小的志賀毒素A亞基片段是由StxA的殘基75-247組成的多肽(Al-Jaufy，InfectImmun62：956-60(1994))。截短SLT-1A、StxA或SLT-2A的羧基端成為氨基酸1-251去除兩個預測的B細胞表位區、兩個預測的CD4陽性的(CD4+)T細胞表位和一個預測的不連續的B細胞表位。截短SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端至75-293去除至少三個預測的B細胞表位區和三個預測的CD4+T細胞表位。截短SLT-1A、StxA或SLT-2A的氨基端和羧基端二者至75-251刪除至少五個預測的B細胞表位區、四個推定的CD4+T細胞表位和一個預測的不連續的B細胞表位。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽可以包含下述或基本上由下述組成：在提供的表位區具有至少一個突變(例如，缺失、插入、倒置或置換)的全長或截短的志賀毒素A亞基。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有表位區內至少一個氨基酸的缺失的破壞。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有在表位區內至少一個氨基酸的插入的破壞。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有氨基酸倒置的破壞，其中至少一個倒置的氨基酸位于表位區內。在某些其他實施方案中，所述多肽包含含有突變的破壞，所述突變諸如置換為非標準氨基酸或具有化學修飾的側鏈的氨基酸的氨基酸置換。實施例中提供了單個氨基酸置換的多個實例。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽可以包含下述或基本上由下述組成：與天然序列相比，具有一個或多個突變的全長或截短的志賀毒素A亞基，其包含選自由下述組成的組的至少一個氨基酸置換：A，G，V，L，I，P，C，M，F，S，D，N，Q，H，和K。在某些其他實施方案中，所述肽可以包含下述或基本上由下述組成：與天然序列相比，具有單個突變的全長或截短的志賀毒素A亞基，其中置換選自由下述組成的組：D置換成A，D置換成G，D置換成V，D置換成L，D置換成I，D置換成F，D置換成S，D置換成Q，E置換成A，E置換成G，E置換成V，E置換成L，E置換成I，E置換成F，E置換成S，E置換成Q，E置換成N，E置換成D，E置換成M，E置換成R，G置換成A，H置換成A，H置換成G，H置換成V，H置換成L，H置換成I，H置換成F，H置換成M，K置換成A，K置換成G，K置換成V，K置換成L，K置換成I，K置換成M，K置換成H，L置換成A，L置換成G，N置換成A，N置換成G，N置換成V，N置換成L，N置換成I，N置換成F，P置換成A，P置換成G，P置換成F，R置換成A，R置換成G，R置換成V，R置換成L，R置換成I，R置換成F，R置換成M，R置換成Q，R置換成S，R置換成K，R置換成H，S置換成A，S置換成G，S置換成V，S置換成L，S置換成I，S置換成F，S置換成M，T置換成A，T置換成G，T置換成V，T置換成L，T置換成I，T置換成F，T置換成M，T置換成S，Y置換成A，Y置換成G，Y置換成V，Y置換成L，Y置換成I，Y置換成F，以及Y置換成M。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽包含下述或基本上由下述組成：與天然氨基酸殘基序列相比，具有一個或多個突變的全長或截短的志賀毒素A亞基，其包含表位區內的至少一個氨基酸置換，其中至少一個置換發生在選自由下述組成的組的天然位置的氨基酸組：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的4；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的8；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的9；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的11；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的43；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的45；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的47；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的48；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的49；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的53；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的55；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的58；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的59；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的60；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的61；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的62；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的96；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的109；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的110；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的112；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的SE147；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的179；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的180；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的181；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的183；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的184；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的185；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的186；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的187；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的188；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的189；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的247；SEQIDNO：3的247；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的248；SEQIDNO：3的250；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的251；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的264；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的265；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的286。在某些其他實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽包含下述或基本上由下述組成：具有表位區內的至少一個置換的全長或截短的志賀毒素A亞基，其中至少一個氨基酸置換是相對于下述天然位置中之一的位置上天然存在的氨基酸置換為非保守氨基酸(例如，參見，表B，同前)：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的4；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的8；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的9；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的11；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的43；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的45；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的47；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的48；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的49；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的53；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的55；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的58；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的59；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的60；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的61；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的62；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的96；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的109；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的110；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的112；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的SE147；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的179；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的180；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的181；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的183；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的184；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的185；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的186；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的187；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的188；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的189；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的247；SEQIDNO：3的247；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的248；SEQIDNO：3的250；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的251；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的264；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的265；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的286。在某些其他實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽包含下述或基本上由下述組成：具有選自由下述組成的組的至少一個氨基酸置換的全長或截短的志賀毒素A亞基：K1置換成A，G，V，L，I，F，M和H；T4置換成A，G，V，L，I，F，M和S；S8置換成A，G，V，I，L，F和M；T9置換成A，G，V，I，L，F，M和S；S9置換成A，G，V，L，I，F和M；K11置換成A，G，V，L，I，F，M和H；S33置換成A，G，V，L，I，F和M；S45置換成A，G，V，L，I，F和M；T45置換成A，G，V，L，I，F和M；D47置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；N48置換成A，G，V，L和M；L49置換成A或G；D53置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；R55置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D58置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；P59置換成A，G和F；E60置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；E61置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；G62置換成A；D94置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S96置換成A，G，V，I，L，F和M；S109置換成A，G，V，I，L，F和M；T109置換成A，G，V，I，L，F，M和S；G110置換成A；S112置換成A，G，V，L，I，F和M；G147置換成A；R179置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；T180置換成A，G，V，L，I，F，M和S；T181置換成A，G，V，L，I，F，M和S；D183置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；D184置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S186置換成A，G，V，I，L，F和M；G187置換成A；R188置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S189置換成A，G，V，I，L，F和M；R204置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R205置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S247置換成A，G，V，I，L，F和M；Y247置換成A，G，V，L，I，F和M；R248置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R250置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R251置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D264置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；G264置換成A；和T286置換成A，G，V，L，I，F，M和S。在某些其他實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽包含下述或基本上由下述組成：具有至少一個下述氨基酸置換的全長或截短的志賀毒素A亞基：K1M，T4I，S8I，T8V，T9I，S9I，K11A，K11H，S33I，S45I，T45I，D47G，N48V，N48F，L49A，D53A，D53G，D53N，R55A，R55V，R55L，D58A，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，D94A，S96I，S109V，T109V，G110A，S112V，G147A，R179A，T180G，T181I，D183A，D183G，D184A，D184F，L185V，S186A，S186F，G187A，R188A，R188L，S189A，R204A，R205A，S247I，Y247A，R248A，R250A，R251A，D264A，G264A，T286A和/或T286I。這些表位破壞性置換可以組合，以形成每個表位區具有多個置換和/或具有多個破壞的表位區同時仍然保留志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽。例如，在可能的情形中，在天然位置排列的殘基K1，T4，S8，T8，T9，S9，K11，K11，S33，S45，T45，D47，N48，L49，D53，R55，D58，P59，E60，E61，G62，D94，S96I，S109，T109，G110，S112，G147，R179，T180，T181I，D183，D184，L185，S186，S186，G187，R188，S189，R204A，R205，S247，Y247，R248，R250，R251，D264，G264，T286和/或T286處的置換可以與在天然位置排列的殘基K1，T4，S8，T8，T9，S9，K11，K11，S33，S45，T45，D47，N48，L49，D53，R55，D58，P59，E60，E61，G62，D94，S96I，S109，T109，G110，S112，G147，R179，T180，T181I，D183，D184，L185，S186，S186，G187，R188，S189，R204A，R205，S247，Y247，R248，R250，R251，D264，G264，T286和/或T286處的置換組合，以產生本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽。在其他實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽包含短于全長志賀毒素A亞基的截短的志賀毒素A亞基或基本上由短于全長志賀毒素A亞基的截短的志賀毒素A亞基組成，其中在實施例中提供的天然位置排列的表位區中的至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。志賀樣毒素1A亞基截短是有催化活性的，能夠在體外使核糖體酶促失活，并且在細胞內表達時有細胞毒性(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。展現完全的酶活性的最小的志賀毒素A亞基片段是由Slt1A的殘基1-239組成的多肽(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。盡管報道保留實質性催化活性的志賀毒素A亞基的最小片段是StxA的殘基75-247(Al-Jaufy，InfectImmun62：956-60(1994))，但是在真核細胞內從頭表達StxA截短物僅需要至殘基240以到達細胞質并且發揮核糖的催化滅活作用(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。盡管本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽可能普遍小于全長A亞基，但是優選所述去免疫化志賀毒素效應子區保留氨基酸位置77-239的多肽區(SLT-1A(SEQIDNO：1)或StxA(SEQIDNO：2))或志賀毒素家族成員的其他A亞基中的等價部分(例如，(SEQIDNO：3)的77-238)。例如，在本發明的特定實施方案中，來源于SLT-1A的志賀毒素效應子區多肽可以包含下述或基本上由下述組成：SEQIDNO：1的氨基酸75-251，SEQIDNO：1的1-241，SEQIDNO：1的1-251，或SEQIDNO：1的氨基酸1-261，其中，在實施例中提供的天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。類似地，來源于StxA的去免疫化志賀毒素效應子區可以包含下述或基本上由下述組成：SEQIDNO：2的氨基酸75-251、SEQIDNO：2的1-241、SEQIDNO：2的1-251或SEQIDNO：2的氨基酸1-261，其中，在實施例中提供的至少一個天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。另外，來源于SLT-2的志賀毒素效應子區可以包含下述或基本上由下述組成：SEQIDNO：3的氨基酸75-251、SEQIDNO：3的1-241、SEQIDNO：3的1-251或SEQIDNO：3的氨基酸1-261，其中，在實施例中提供的至少一個天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。本發明還提供本發明的多肽的變體，其中所述志賀毒素效應子區與天然存在的志賀毒素A亞基的不同僅為或多至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40個或更多個氨基酸殘基(但是不多于使其保留至少85％，90％，95％，99％或更多的氨基酸序列同一性的數目)。因此，本發明的來源于志賀毒素家族成員的A亞基的志賀毒素效應子區多肽，與原始序列相比，可以包含添加、缺失、截短或其他的變化，只要保留與天然存在的志賀毒素A亞基有至少85％，90％，95％，99％或更多的氨基酸序列同一性，并且在實施例中提供的至少一個天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。因此，在某些實施方案中，所述志賀毒素效應子區多肽包含與天然存在的志賀毒素A亞基(諸如SLT-1A(SEQIDNO：1)，StxA(SEQIDNO：2)，和/或SLT-2A(SEQIDNO：3))具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％的總序列同一性的氨基酸序列或基本上由其組成，其中，在實施例中提供的至少一個天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。任選地，志賀毒素A亞基的全長或截短的版本可以包含一個或多個突變(例如，置換、缺失、插入或倒置)，只要在實施例中提供的至少一個天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。在本發明的特定實施方案中，優選所述去免疫化志賀毒素效應子區多肽與天然存在的志賀毒素A亞基具有充分的序列同一性，以足以在進入細胞后保留細胞毒性，進入細胞通過宿主細胞轉化、轉染、感染或誘導的公知方法，或通過由與志賀毒素效應子區多肽連接的靶向細胞的結合區介導的內在化進行。志賀毒素A亞基中對酶活性和/或細胞毒性而言最關鍵的殘基已經繪圖定位到下述殘基位置：特別是天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170和精氨酸-176(Di，Toxicon57：535-39(2011))。在本發明的任一個實施方案中，去免疫化志賀毒素效應子區多肽可以優選地但不是必須地保留在下述位置的一個或多個保守氨基酸：諸如在StxA、SLT-1A的位置77、167、170和176處的保守氨基酸，或在志賀毒素家族其他成員中典型地是細胞毒性活性所需要的等價保守位置。本發明的細胞毒性蛋白引起細胞死亡的能力，例如，其細胞毒性，可以使用本領域公知的多種測定中的任一種或多種進行測量。B.包含去免疫化志賀毒素效應子區的蛋白本發明的蛋白包含與細胞外靶標生物分子特異性結合區連接的含有本發明的多肽的去免疫化志賀毒素效應子區。本發明的蛋白的結合區包含一個或多個能夠選擇性和特異性結合細胞外靶標生物分子的多肽。結合區可以包含一個或多個不同的多肽結構部分，諸如配體(不管是合成的或天然存在的配體)及其衍生物、免疫球蛋白來源的結構域、合成地改造的支架(作為免疫球蛋白結構域的替代物)等。存在眾多本領域已知的可用于通過它們的結合特征將多肽靶向特定細胞類型的結合區域，諸如配體、單克隆抗體、改造的抗體衍生物和改造的抗體替代物。根據一個具體的、但是非限制性的方面，本發明的蛋白的結合區包含保留對細胞外靶標生物分子(通常是細胞表面受體)的結合功能性的天然存在的配體或其衍生物。例如，本領域已知的多種細胞因子、生長因子和激素可以用于將細胞毒性蛋白靶向至表達相應細胞因子受體、生長因子受體或激素受體的特定細胞類型的細胞表面。配體的某些非限制性例子包括(在括弧中顯示別稱)：B-細胞活化因子(BAFFs、APRIL)、集落刺激因子(CSFs)、表皮生長因子(EGFs)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血管內皮生長因子(VEGFs)、胰島素樣生長因子(IGFs)、干擾素、白介素(諸如IL-2、IL-6和IL-23)、神經生長因子(NGFs)、血小板來源的生長因子、轉化生長因子(TGFs)和腫瘤壞死因子(TNFs)。根據某些其它實施方案，所述結合區包含能夠結合細胞外靶標生物分子的合成配體。一種非限制性例子是針對細胞毒性的T-淋巴細胞抗原4(CTLA-4)的拮抗劑。根據一個具體的、但是非限制性的方面，所述結合區可以包含免疫球蛋白型結合區。本文中使用的術語“免疫球蛋白型結合區”表示能夠結合一個或多個靶標生物分子(諸如抗原或表位)的多肽區域。結合區可以在功能上由它們的結合靶分子的能力來限定。免疫球蛋白型結合區通常來源于抗體或抗體樣結構；但是，預見到來自其它來源的替代支架在該術語的范圍內。免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被稱為Ig結構域的結構域。Ig結構域的長度范圍為約70-110個氨基酸殘基并且擁有特征性Ig折疊，其中典型地7-9個反向平行的β鏈排列為兩個形成夾心樣結構的β片層。Ig折疊通過夾心的內表面上的疏水氨基酸相互作用和鏈中半胱氨酸殘基之間的高度保守的二硫鍵來穩定。Ig結構域可以是可變的(IgV或V-組)、恒定的(IgC或C-組)或中間的(IgI或I-組)。一些Ig結構域可能與互補決定區(CDR)有關，所述互補決定區(CDR)對于抗體與它們的表位的結合的特異性而言是重要的。Ig-樣結構域也存在于非免疫球蛋白的蛋白中，并且基于此被分類為Ig蛋白超家族的成員。HUGO基因命名委員會(HUGOGeneNomenclatureCommittee，HGNC)提供了含有Ig-樣結構域的家族的成員的清單。免疫球蛋白型結合區可以是抗體或其抗原結合片段的多肽序列，其中例如通過分子工程改造或通過文庫篩選進行選擇，所述氨基酸序列已經與天然抗體或非免疫球蛋白蛋白的Ig-樣結構域的氨基酸序列有所不同。因為重組DNA技術和體外文庫篩選在免疫球蛋白型結合區的產生中的關聯性，可以重新設計抗體以獲得期望的特征，諸如較小的尺寸、細胞進入(cellentry)、或其它治療改善。可能的變化有很多，并且范圍可以為從僅一個氨基酸的改變到例如可變區的完全重新設計。典型地，將做出可變區的改變以便改善抗原結合特征、改善可變區穩定性、或降低免疫原性應答的潛力。存在眾多預見到作為本發明的組分的免疫球蛋白型結合區。在某些實施方案中，免疫球蛋白型結合區來源于免疫球蛋白結合區域，諸如能夠結合細胞外靶標生物分子的抗體互補位。在某些其它實施方案中，免疫球蛋白型結合區包含經工程改造的多肽，所述經工程改造的多肽并非來源于任何免疫球蛋白結構域，而是通過提供對細胞外靶標生物分子的高親和力結合而像免疫球蛋白結合區域一樣發揮作用。這種經工程改造的多肽可以任選地包括包含來自如本文中所述的免疫球蛋白的互補決定區或者基本上由所述互補決定區組成的多肽支架。還存在眾多現有技術中的結合區域，其可用于通過它們的高親和力結合特性將多肽靶向特定細胞類型。在某些實施方案中，本發明蛋白的結合區選自包括下述的組：單結構域抗體結構域(sdAbs)、納米抗體、從駱駝科動物來源的重鏈抗體結構域(VHH片段)、二價納米抗體、從軟骨魚來源的重鏈抗體結構域、免疫球蛋白新抗原受體(IgNARs)、VNAR片段、單鏈可變(scFv)片段、多聚化scFv片段(雙抗體、三抗體、四抗體)、雙特異性的串聯的scFv片段、二硫鍵穩定化的抗體可變(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH1結構域組成的二硫鍵穩定化的抗原結合(Fab)片段、二價F(ab’)2片段、由重鏈和CH1結構域組成的Fd片段、單鏈Fv-CH3微抗體、雙特異性微抗體、二聚CH2結構域片段(CH2D)、Fc抗原結合結構域(Fcabs)、分離的互補決定區3(CDR3)片段、受約束的構架區3、CDR3、構架區4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模塊免疫藥物(SMIP)結構域、以及保留它的互補位和結合功能的前述物質的任何遺傳操作的對應物(參見SaerensD等，Curr.Opin.Pharmacol8：600-8(2008)；DimitrovD，MAbs1：26-8(2009)；WeinerL，Cell148：1081-4(2012)；AhmadZ等，ClinDevImmunol2012：980250(2012))。根據某些其它實施方案，所述結合區包括免疫球蛋白結構域的經工程改造的替代支架，其表現出類似的功能特征，諸如對靶標生物分子的高親和力和特異性結合，并且能夠工程改造改善的特征，諸如更大穩定性或降低的免疫原性。對于本發明的蛋白的某些實施方案，所述結合區選自包括下述的組：經工程改造的、纖維連接蛋白來源的、第10個纖連蛋白III型(10Fn3)結構域(單抗體、AdNectinsTM或AdNexinsTM)；經工程改造的、生腱蛋白來源的、生腱蛋白III型結構域(CentrynsTM)；經工程改造的、含有錨蛋白重復基序的多肽(DARPinsTM)；經工程改造的、低密度-脂蛋白-受體來源的、A結構域(LDLR-A)(AvimersTM)；脂質運載蛋白(anticalins)；經工程改造的、蛋白酶抑制劑來源的、Kunitz結構域；經工程改造的、蛋白-A來源的、Z結構域(AffibodiesTM)；經工程改造的、γ-B結晶來源的支架或經工程改造的、泛蛋白來源的支架(Affilins)；Sac7d來源的多肽(或affitins)；經工程改造的、Fyn來源的、SH2結構域小蛋白；C-型凝集素-樣結構域支架；經工程改造的抗體模擬物；以及保留它的結合功能性的前述物質的任何遺傳操作的對應物(A，PlückthunA，JMolBiol305：989-1010(2001)；XuL等，ChemBiol9：933-42(2002)；WikmanM等，ProteinEngDesSel17：455-62(2004)；BinzH等，NatBiotechnol23：1257-68(2005)；HeyT等，TrendsBiotechnol23：514-522(2005)；HolligerP，HudsonP，NatBiotechnol23：1126-36(2005)；GillD，DamleN，CurrOpinBiotech17：653-8(2006)；KoideA，KoideS，MethodsMolBiol352：95-109(2007)；BylaP等，JBiolChem285：12096(2010)；ZollerF等，Molecules16：2467-85(2011))。任何以上結合區可以用作本發明的組分，只要所述結合區組分對細胞外靶標生物分子具有10-5至10-12摩爾/升、優選地小于200納摩爾(nM)的解離常數即可。細胞外靶標生物分子本發明的蛋白的結合區包含這樣的多肽區域：其能夠特異性地結合細胞外靶標生物分子，優選地其物理偶聯至目標細胞類型(諸如癌細胞、腫瘤細胞、漿細胞、被感染的細胞或攜帶細胞內病原體的宿主細胞)的表面。術語“靶標生物分子”表示這樣的生物分子，通常是蛋白或通過翻譯后修飾(諸如糖基化)而修飾的蛋白：其能夠被結合區結合以使蛋白靶向生物體內的特定細胞類型或位置。細胞外靶標生物分子可以包括多個表位，包括未修飾的多肽、通過添加生化官能團而修飾的多肽、和糖脂(參見例如美國專利5,091,178；EP2431743)。合乎需要的是，細胞外靶標生物分子在與本發明的蛋白相互作用以后被內源性地內化或容易地被迫內化。就本發明的目的而言，關于修飾靶標生物分子，術語“細胞外的”表示這樣的生物分子：它的結構的至少一部分暴露于細胞外環境。細胞外靶標生物分子包括細胞膜組分、跨膜蛋白、細胞膜錨定的生物分子、細胞表面結合的生物分子和分泌的生物分子。關于本發明，當用于描述靶標生物分子時，短語“物理偶聯”是指將靶標生物分子或其部分與細胞外部關聯的共價和/或非共價分子間相互作用，諸如靶標生物分子和細胞之間的多個非共價相互作用，其中每個單獨相互作用的能量是在約1-5千卡的量級(例如靜電鍵、氫鍵、范德華相互作用、疏水力等)。可以發現所有嵌膜蛋白與細胞膜、以及周圍膜蛋白物理偶聯。例如，細胞外靶標生物分子可能包含跨膜區域、脂質錨、糖脂錨和/或與包含前述任一種的因子非共價地結合(例如通過非特異性疏水相互作用和/或結合脂質的相互作用)。可以基于眾多標準(諸如它們的靶標生物分子的細胞類型特異性的表達和/或它們的靶標生物分子關于特定細胞類型的物理定位)來設計或選擇本發明的蛋白的結合區。例如，本發明的某些蛋白包含這樣的結合結構域：其能夠使由僅一種細胞類型排他地表達的細胞表面靶標結合至細胞表面。這允許相對于不表達該細胞外靶標生物分子的“旁觀”細胞類型以高優先性(至少3-倍的細胞毒性作用)進行特定細胞類型的靶向性細胞殺傷。備選地，如果細胞外靶標生物分子以足夠低的量表達和/或以低量與不被靶向的細胞類型物理偶聯，則結合區的靶標生物分子的表達可以不專屬于一種細胞類型。這還允許相對于不表達顯著量的細胞外靶標生物分子或不與顯著量的細胞外靶標生物分子物理偶聯的“旁觀”細胞類型以高優先性(至少3-倍的細胞毒性作用)進行特定細胞類型的靶向性細胞殺傷。可以在不同細胞條件下，諸如離體、體外培養的或在體內——包括在多細胞生物體內在它們天然位置的原位的細胞，用本發明的細胞毒性蛋白殺傷被靶向的細胞。本發明的蛋白的結合區的細胞外靶標生物分子可以包括過比例地或排他地存在于癌細胞、免疫細胞和被細胞內病原體(諸如病毒、細菌、真菌、朊病毒或原生動物)感染的細胞中的生物標志物。去免疫化志賀毒素效應子區在本發明的蛋白的某些實施方案中，可以突變、插入或缺失一個或多個氨基酸殘基，以便增加去免疫化志賀毒素效應子區的酶活性。例如，將Stx1A中的殘基-位置丙氨酸-231突變成谷氨酸會增加它的體外酶活性(SuhanM，HovdeC，InfectImmun66：5252-9(1998))。在本發明的蛋白的某些實施方案中，可以將一個或多個氨基酸殘基突變或缺失以便降低或消除去免疫化志賀菌毒素效應子區的催化和/或細胞毒性活性。可以通過突變或截短來降低或消除志賀菌毒素家族成員的A亞基的催化和/或細胞毒性，只要在實施例中提供的至少一個天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。已經顯示標記為酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114和色氨酸-203的位置對于Stx、Stx1和Stx2的催化活性是重要的(HovdeC等，ProcNatlAcadSciUSA85：2568-72(1988)；DeresiewiczR等，Biochemistry31：3272-80(1992)；DeresiewiczR等，MolGenGenet241：467-73(1993)；OhmuraM等，MicrobPathog15：169-76(1993)；CaoC等，MicrobiolImmunol38：441-7(1994)；Suhan，InfectImmun66：5252-9(1998))。在無細胞核糖體失活測定中，將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變消除了Slt-IA1的酶活性(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。在利用內質網中SLt-IA1的從頭表達的另一種方法中，將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變或將Slt-IA1截短為殘基1-239在所述表達水平上消除了Slt-IA1片段細胞毒性(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。本發明的蛋白分別包含去免疫化志賀毒素效應子區多肽，其保留至少一種志賀毒素效應子功能，但是其可以通過突變一個或多個對酶活性重要的殘基由細胞毒性的親本分子改造成具有降低的或消除的細胞毒性的蛋白，以用于非細胞毒性功能，例如，完成白細胞淤積(cytostasis)、外源物質的遞送和/或細胞類型的檢測。該整體結構是模塊式的，原因在于，本發明的多肽可以連接到任意數量的多樣性主題組合物上，諸如結合區和/或檢測促進劑，以用于本文所述的多種應用。可以通過觀察施用給活生物體(諸如脊索動物)后針對分子的任何免疫應答(抗體和/或免疫細胞-介導的)來評估分子的免疫原性(誘導抗體和/或細胞介導的免疫應答的能力)。可以隨時間測量特定的免疫應答，諸如特異性靶向施用的分子的抗體的量和形成。特異性結合所施用的分子的抗體的存在表示：1)預先存在一種或多種識別所施用的分子的抗體，和/或2)誘導一種或多種識別所施用的分子的抗體的從頭形成。可以通過研究施用之前的血清是否存在抗-分子抗體來確定預先形成的抗-分子抗體的存在。從頭抗-“施用的分子”抗體形成的誘導可以通過監測施用后血清中隨時間產生的抗-分子抗體的量來確定。在施用分子(例如，志賀毒素效應子區多肽)后在脊索動物中誘導的抗體的量可以通過比較施用前抗-分子抗體的量與施用后抗-分子抗體的量進行測量。施用后在脊索動物中誘導的抗-“施用的分子”抗體的量指示所述分子的一般免疫原性和所述分子在不同脊索動物中誘導不同免疫應答的能力，諸如在施用后，誘導增加的和多樣性的抗-分子抗體產生，免疫細胞介導的免疫應答。分子中和活性，超敏性反應，過敏性反應，過敏樣反應和其他免疫應答。沒有參比點，諸如另一種更加免疫原性的分子，可能難以定量弱免疫原性分子的免疫原性。兩種分子(例如，野生型志賀毒素效應子區多肽與去免疫化志賀毒素效應子多肽)的相對免疫原性可以通過觀察在向不同的生物體單獨施用每種分子后針對每種分子分別闡述的抗-分子抗體的相對差異而進行評估。從頭抗-“施用的分子”抗體形成的相對誘導可以通過測量施用后血清中分別針對每種分子的隨時間產生的抗-分子抗體的量的相對差異而確定。在用不同分子(例如，野生型志賀毒素效應子區多肽和去免疫化志賀毒素效應子多肽)處理的脊索動物(如小鼠)中誘導的抗體的量可以用基于標準ELISA的測定進行測量，并用于比較不同分子的相對免疫原性。KDEL家族成員的內質網保留/回收信號基序就本發明的目的而言，短語“內質網保留/回收信號基序”、KDEL-型信號基序或信號基序表示能夠在真核細胞內起作用以促進蛋白通過KDEL受體向內質網的亞細胞定位的KDEL家族的任何成員。羧基端賴氨酸-天冬酰胺-谷氨酸-亮氨酸(KDEL)序列是真核細胞中的可溶性蛋白的一種規范的、內質網停留和取回信號基序，且被KDEL受體識別(關于綜述，參見CapitaniM，SalleseM，FEBSLett583：3863-71(2009))。KDEL信號基序家族包括許多KDEL-樣基序，諸如HDEL，RDEL，WDEL，YDEL，HEEL，KEEL，REEL，KFEL，KIEL，DKEL，KKEL，HNEL，HTEL，KTEL，和HVEL，它們都存在于蛋白的羧基端，所述羧基端已知是遍布于多個系統發生界的內質網的腔的停留者(MunroS，PelhamH，Cell48：899-907(1987)；RaykhelI等，JCellBiol179：1193-204(2007))。KDEL信號基序家族包括至少46個使用合成構建體證實的多肽變體(Raykhel，JCellBiol179：1193-204(2007))。另外的KDEL信號基序包括ALEDEL，HAEDEL，HLEDEL，KLEDEL，IRSDEL，ERSTEL和RPSTEL(AlanenH等，JMolBiol409：291-7(2011))。一種代表大多數KDEL信號基序的普遍化共有基序已經描述為[KRHQSA]-[DENQ]-E-L(HuloN等，NucleicAcidsRes34：D227-30(2006))。含有KDEL家族信號基序的蛋白被遍布于高爾基復合體的KDEL受體結合并通過微管依賴性機制運輸至內質網用于釋放進內質網的腔中(GriffithsG等，JCellBiol127：1557-74(1994)；G，RothmanJ，JCellBiol129：309-19(1995))。KDEL受體在高爾基復合體和內質網之間動態地循環(JacksonM等，EMBOJ.9：3153-62(1990)；SchutzeM等，EMBOJ.13：1696-1705(1994))。就本發明的目的而言，KDEL家族的成員包括合成的信號基序，其能夠在真核細胞內起作用以促進蛋白通過KDEL受體向內質網的亞細胞定位。換而言之，KDEL家族的有些成員可能不存在于自然界中，或尚未在自然界中觀察到，但是已經或可以使用本領域已知的方法構建和根據經驗進行驗證；例如，參見RaykhelI等，JCellBiol179：1193-204(2007)。作為本發明的蛋白的某些實施方案的組分，KDEL-型信號基序在蛋白內物理地定位、朝向或排列，使得它是在羧基端。為了本發明的目的，志賀毒素效應子區和結合區相對于彼此或整個蛋白的N-端和C-端的具體順序或取向不是固定的(例如，參見圖1)。在本發明的蛋白中，結合區和志賀毒素效應子區可以彼此直接連接和/或適當地通過一個或多個插入多肽序列(諸如使用一個或多個本領域公知的接頭)彼此連接。任選地，本發明的蛋白可以進一步包含羧基端內質保留/回收信號基序，諸如KDEL。本發明的蛋白的一般結構是模塊的，因此多種不同的結合區可以與同一種去免疫化志賀毒素效應子區一起使用以提供多種細胞外靶標生物分子的多樣性靶向，從而提供細胞毒性的靶向、白細胞淤積和/或外源物質向多種不同細胞類型的遞送。由于不適當的亞細胞按路線發送而不具有細胞毒性的去免疫化志賀毒素效應子區仍然可以用于將外源物質遞送進細胞中。II.連接本發明的多肽組分和/或它們的亞組分的連接鍵本發明的各個多肽和/或蛋白組分，例如結合區和志賀毒素效應子區(其可以是有細胞毒性的和/或攜帶一個或多個改變、降低或消除催化活性和/或細胞毒性的突變)，可以通過本領域眾所周知的和/或本文描述的一個或多個接頭適當地彼此連接。結合區的各個多肽亞組分，例如重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)、CDR和/或ABR區，可以通過本領域眾所周知的和/或本文描述的一個或多個接頭適當地彼此連接(例如，參見WeisserN，HallJ，BiotechnolAdv27：502-20(2009)；ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。本發明的蛋白組分，例如，多鏈結合區域，可以通過本領域眾所周知的一個或多個接頭適當地彼此連接或連接至本發明的其它多肽組分。本發明的肽組分，例如，KDEL家族內質網保留/回收信號基序，可以通過本領域眾所周知的一個或多個接頭(諸如蛋白性接頭)適當地連接至本發明的另一個組分。合適的接頭通常是允許本發明的每個多肽組分以這樣的三維結構折疊的那些接頭，所述三維結構非常類似于在沒有任何接頭或其它組分的情況下單獨產生的多肽組分。合適的接頭包括單個氨基酸、肽、多肽和缺乏前述任一種的接頭，諸如例如各種非蛋白性的碳鏈，無論是分支的還是環狀的(例如，參見ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。合適的接頭可以是蛋白性的，且包含一個或多個氨基酸、肽和/或多肽。蛋白性的接頭適合用于重組融合蛋白和化學連接的綴合物。蛋白性的接頭典型地具有約2至約50個氨基酸殘基，諸如，例如，約5至約30個或約6至約25個氨基酸殘基。選擇的接頭的長度取決于多種因素，諸如，例如，選擇所述接頭所期望的一種或多種性質(例如，參見ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。合適的接頭可以是非蛋白性的，例如，化學接頭(例如，參見DosioF等，Toxins3：848-83(2011)；FeldJ等，Oncotarget4：397-412(2013))。本領域已知的各種非蛋白性的接頭可以用于連接結合區和志賀毒素效應子區，諸如常用于將免疫球蛋白來源的多肽綴合至異源多肽的接頭。例如，使用它們的氨基酸殘基的功能側鏈和碳水化合物結構部分(諸如，例如，羧基、胺、巰基、羧酸、羰基、羥基和/或環狀環基)，可以連接多肽區域。例如，二硫鍵和硫醚鍵可以用于連接兩個或更多個多肽(參見例如FitzgeraldD等，BioconjugateChem1：264-8(1990)；PasqualucciL等，Haematologica80：546-56(1995))。另外，非天然的氨基酸殘基可以與其它功能側鏈諸如酮基一起使用(參見例如SunS等，ChembiochemJul18(2014)；TianF等，ProcNatlAcadSciUSA111：1766-71(2014))。非蛋白性化學接頭的例子包括、但不限于：N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，S-(N-琥珀酰亞胺基)硫代乙酸酯(SATA)，N-琥珀酰亞胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP)，琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷甲酸酯(SMCC或MCC)，磺基琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，4-琥珀酰亞胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯，磺基琥珀酰亞胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基)己酸酯，N-琥珀酰亞胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，磺基琥珀酰亞胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯，馬來酰亞胺基己酰基(MC)，馬來酰亞胺基己酰基-纈氨酸-瓜氨酸-p-氨基芐氧基羰基(MC-vc-PAB)，3-馬來酰亞胺基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)，α-烷基衍生物，磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀酰亞胺基N-[3-(乙酰基硫基)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])，磺基二氯苯酚，2-亞氨基硫雜環戊烷(2-iminothiolane)，3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰基酰肼，Ellman氏試劑，二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸(參見例如ThorpeP等，EurJBiochem147：197-206(1985)；ThorpeP等，CancerRes47：5924-31(1987)；ThorpeP等，CancerRes48：6396-403(1988)；GrossbardM等，Blood79：576-85(1992)；LuiC等，ProcNatlAcadSciUSA93：8618-23(1996)；DoroninaS等，NatBiotechnol21：778-84(2003)；FeldJ等，Oncotarget4：397-412(2013))。合適的接頭(無論是蛋白性的還是非蛋白性的)可以包括，例如，蛋白酶敏感的、環境氧化還原電位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或熱敏感的接頭(參見例如DosioF等，Toxins3：848-83(2011)；ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013)；FeldJ等，Oncotarget4：397-412(2013))。可以選擇蛋白性的接頭用于摻入本發明的重組融合蛋白中。對于本發明的重組融合蛋白，接頭典型地包含約2-50個氨基酸殘基，優選約5-30個氨基酸殘基(ArgosP，JMolBiol211：943-58(1990)；WilliamsonM，BiochemJ297：240-60(1994)；GeorgeR，HeringaJ，ProteinEng15：871-9(2002)；KreitmanR，AAPSJ8：E532-51(2006))。通常，蛋白性的接頭包含大多數具有極性的、不帶電荷的和/或帶電荷的殘基的氨基酸殘基，諸如，例如，蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸(參見例如HustonJ等ProcNatlAcadSciU.S.A.85：5879-83(1988)；PastanI等，AnnuRevMed58：221-37(2007)；LiJ等，CellImmunol118：85-99(1989)；CumberA等BioconjChem3：397-401(1992)；FriedmanP等，CancerRes53：334-9(1993)；WhitlowM等，ProteinEngineering6：989-95(1993)；SiegallC等，JImmunol152：2377-84(1994)；Newton等Biochemistry35：545-53(1996)；Ladurner等JMolBiol273：330-7(1997)；KreitmanR等，LeukLymphoma52：82-6(2011)；U.S.4,894,443)。蛋白性的接頭的非限制性例子包括丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE)、纈氨酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G2-4S)xAM，其中G是甘氨酸，S是絲氨酸，且x是1-10的整數。可以基于期望的性能選擇蛋白性的接頭。技術人員可以記住特定特征來選擇蛋白性的接頭，諸如以優化融合分子的折疊、穩定性、表達、溶解度、藥代動力學性能、藥效動力學性能和/或在融合構建體的背景下融合的結構域的活性(相對于相同結構域自身的活性)中的一種或多種。例如，可以基于柔性、剛度和/或切割性選擇蛋白性的接頭(參見例如ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。技術人員在選擇接頭時可以使用數據庫和接頭設計軟件工具。可以選擇某些接頭以優化表達(參見例如TurnerD等，JImmunlMethods205：43-54(1997))。可以選擇某些接頭以促進相同多肽或蛋白之間(以形成同型多聚體)或不同多肽或蛋白之間(以形成異型多聚體)的分子間相互作用。例如，可以選擇蛋白性的接頭，其允許本發明的蛋白的多肽組分之間的期望的非共價相互作用，諸如，例如，與二聚體和其它更高級多聚體的形成有關的相互作用(參見例如U.S.4,946,778)。柔性的蛋白性的接頭經常具有大于12個氨基酸殘基的長度，且富含小的、非極性的氨基酸殘基、極性的氨基酸殘基和/或親水的氨基酸殘基，諸如，例如，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸(參見例如BirdR等，Science242：423-6(1988)；FriedmanP等，CancerRes53：334-9(1993)；SiegallC等，JImmunol152：2377-84(1994))。可以選擇柔性的蛋白性的接頭以增加組分之間的空間分離和/或允許組分之間的分子內相互作用。例如，多種“GS”接頭是技術人員已知的，且由多個甘氨酸和/或一個或多個絲氨酸組成，有時在重復單元中，例如，(GxS)n、(SxG)n、(GGGGS)n和(G)n，其中x是1-6，且n是1-30(參見例如WO96/06641)。柔性的蛋白性的接頭的非限制性例子包括GKSSGSGSESKS，GSTSGSGKSSEGKG，GSTSGSGKSSEGSGSTKG，GSTSGSGKSSEGKG，GSTSGSGKPGSGEGSTKG，EGKSSGSGSESKEF，SRSSG和SGSSC。剛性的蛋白性的接頭經常是堅硬的α-螺旋結構且富含脯氨酸殘基和/或一個或多個在戰略上放置的脯氨酸(參見ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。可以選擇剛性的接頭以防止連接的組分之間的分子內相互作用。可以選擇合適的接頭以允許組分的體內分離，例如，由于切割和/或環境特異性的不穩定性(參見DosioF等，Toxins3：848-83(2011)；ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。體內可切割的蛋白性的接頭能夠通過蛋白水解加工和/或還原環境(經常在生物體內的特定部位或在特定細胞類型內)而解連(參見例如DoroninaS等，BioconjugChem17：144-24(2006)；EricksonH等，CancerRes66：4426-33(2006))。體內可切割的蛋白性的接頭經常包含蛋白酶敏感的基序和/或由一個或多個半胱氨酸對形成的二硫鍵(參見例如PieterszG等，CancerRes48：4469-76(1998)；TheJ等，JImmunolMethods110：101-9(1998)；參見ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。可以將體內可切割的蛋白性的接頭設計成對僅存在于生物體中的某些位置、細胞內的隔室的蛋白酶敏感，和/或僅在某些生理學或病理學狀況下變得有活性(例如，具有異常高水平的蛋白酶，在某些疾病部位過表達的蛋白酶，和由病原性微生物特異性地表達的蛋白酶)。例如，存在本領域已知的蛋白性的接頭，其被僅存在于細胞內的蛋白酶、僅存在于特定細胞類型內的蛋白酶和僅在病理學狀況(如癌癥或炎癥)下存在的蛋白酶切割，例如，R-x-x-R基序和AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM。在本發明的蛋白的某些實施方案中，可以使用這樣的接頭：其包含一個或多個蛋白酶敏感的位點以提供存在于靶細胞內的蛋白酶的切割。在本發明的蛋白的某些實施方案中，可以使用不可切割的接頭以在施用給脊椎動物生物體以后降低不希望的毒性。合適的接頭可以包括，例如，蛋白酶敏感的、環境氧化還原電位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或熱敏感的接頭，無論是蛋白性的還是非蛋白性的(參見ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013))。合適的可切割的接頭可以包括含有本領域已知的可切割基團的接頭，諸如，例如，ZarlingD等，JImmunol124：913-20(1980)；JungS，MoroiM，BiochemBiophysActa761：152-62(1983)；BouizarZ等，EurJBiochem155：141-7(1986)；ParkL等，JBiolChem261：205-10(1986)；BrowningJ，RiboliniA，JImmunol143：1859-67(1989)；JoshiS，BurrowsR，JBiolChem265：14518-25(1990))。合適的接頭可以包括pH敏感的接頭。例如，可以由于它們在較低pH環境中的不穩定性而選擇某些合適的接頭以提供在靶細胞的亞細胞隔室內的解離。例如，包含一個或多個三苯甲基、衍生化的三苯甲基、雙馬來酰亞胺othoxy丙烷基團(bismaleimideothoxypropanegroups)、己二酸二酰肼基和/或酸不穩定的轉鐵蛋白基團的接頭可以提供本發明的蛋白的組分(例如多肽組分)在具有特定pH范圍的環境中的釋放(參見例如H等，JBiolChem266：4309-14(1991)；FattomA等，InfectImmun60：584-9(1992))。可以選擇在特定pH范圍被切割的某些接頭，所述特定pH范圍對應于組織之間的生理pH差異，諸如，例如，腫瘤組織的pH低于健康組織中的pH(參見例如US5,612,474)。光可切割的接頭是在暴露于某些波長范圍的電磁輻射(諸如可見范圍內的光)后被切割的接頭(參見例如GoldmacherV等，BioconjChem3：104-7(1992))。光可切割的接頭可以用于在暴露于某些波長的光以后釋放本發明的蛋白的組分(例如多肽組分)。光可切割的接頭的非限制性例子包括硝基芐基(作為半胱氨酸的光可切割的保護基)、硝基芐氧基碳酰氯交聯劑、羥丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、熒光素共聚物和甲基羅丹明共聚物(HazumE等，PeptProcEurPeptSymp，第16版，BrunfeldtK，編，105-110(1981)；Senter等，PhotochemPhotobiol42：231-7(1985)；Yen等，MakromolChem190：69-82(1989)；GoldmacherV等，BioconjChem3：104-7(1992))。光可切割的接頭可以在連接組分以形成本發明的蛋白(其被設計成用于治療可以使用纖維光學暴露于光的疾病、病癥和病況)中具有特定用途。在本發明的蛋白的某些實施方案中，使用任意數目的技術人員已知的方式，包括共價鍵和非共價鍵，將結合區域連接至志賀毒素效應子區(參見例如ChenX等，AdvDrugDelivRev65：1357-69(2013)；BehrensC，LiuB，MAbs6：46-53(2014)。在本發明的蛋白的某些實施方案中，所述蛋白包含結合區域，所述結合區域是具有連接重鏈可變(VH)結構域和輕鏈可變(VL)結構域的接頭的scFv。存在眾多本領域已知的適合用于此目的的接頭，諸如，例如，15-殘基(Gly4Ser)3肽。可以用于形成非共價多價結構的合適的scFv接頭包括GGS，GGGS，GGGGS，GGGGSGGG，GGSGGGG，GSTSGGGSGGGSGGGGSS和GSTSGSGKPGSSEGSTKG(PlückthunA，PackP，Immunotechnology3：83-105(1997)；AtwellJ等，ProteinEng12：597-604(1999)；WuA等，ProteinEng14：1025-33(2001)；YazakiP等，JImmunolMethods253：195-208(2001)；CarmichaelJ等，JMolBiol326：341-51(2003)；ArndtM等，FEBSLett578：257-61(2004)；BieC等，WorldJHepatol2：185-91(2010))。用于連接本發明的蛋白的組分的合適方法可以是通過目前本領域已知的用于實現該目的的任意方法，只要所述連接不會實質上阻礙結合區的結合能力、蛋白的細胞內在化和/或當通過適當測定(包括本文描述的測定)測量的志賀毒素效應子區的期望的毒素效應子功能即可。關于本發明的目的，志賀毒素效應子區和靶向細胞的結合區相對于彼此或整個蛋白的具體順序或取向沒有固定(參見例如圖1)。本發明的多肽和蛋白的組分可以以任意順序排列，前提條件是，期望的結合區和志賀毒素效應子區的活性沒有消除。在本發明的多肽和蛋白的某些實施方案中，結合區、志賀毒素效應子區(其可以是細胞毒性的/或攜帶一個或多個減少或消除催貨活性和/或細胞毒性的突變)和內質網保留/回收信號基序可以直接地彼此連接和/或適當地通過一個或多個插入多肽序列(諸如用本領域眾所周知的和/或本文描述的一個或多個接頭)彼此連接。III.去免疫化志賀毒素效應子區多肽和蛋白的特異性結構變化的實例為了產生去免疫化志賀毒素效應子多肽，原則上，可以通過多種方式破壞所提供的表位區中的任意氨基酸，諸如例如，通過缺失、插入、倒置、重排、置換側鏈的化學修飾破壞。然而，利用特定的破壞來破壞特定的氨基酸和多肽區更可能成功地降低抗原性和/或免疫原性，同時保留志賀毒素效應子功能。例如，優選末端截短和內部氨基酸置換，原因在于它們保留志賀毒素效應子區的整體氨基酸間距，由此更可能保持志賀毒素效應子功能。在本發明的某些實施方案中，所述多肽包含含有SLT-1A(SEQIDNO：1)、StxA(SEQIDNO：2)和/或SLT-2A(SEQIDNO：3)的氨基酸75-251或基本上由其組成的去免疫化志賀毒素效應子區，其中，在實施例提供的天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。在某些其他實施方案中，是包含來源于SLT-1A(SEQIDNO：1)、StxA(SEQIDNO：2)和/或SLT-2A(SEQIDNO：3)的氨基酸1-241的去免疫化志賀毒素效應子的多肽，其中，在實施例提供的天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。其他實施方案是包含來源于SLT-1A(SEQIDNO：1)、StxA(SEQIDNO：2)和/或SLT-2A(SEQIDNO：3)的氨基酸1-251的去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其中，在實施例提供的天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。其他實施方案是包含來源于SLT-1A(SEQIDNO：1)，、StxA(SEQIDNO：2)和/或SLT-2A(SEQIDNO：3)的氨基酸1-261的去免疫化志賀毒素效應子區的多肽，其中，在實施例提供的天然位置排列的表位區中至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。存在多種多樣性的可以用于產生本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽的內部氨基酸置換。在用于表位區內的可能的置換氨基酸中，預測下述置換氨基酸殘基最可能降低表位的抗原性和/或免疫原性-G，D，E，S，T，R，K，和H。除了甘氨酸之外，這些殘基全都表示極性和/或帶電荷的殘基。在用來置換的可能的氨基酸中，預測下述氨基酸A，G，V，L，I，P，C，M，F，S，D，N，Q，H和K更可能降低抗原性和/或免疫原性，同時保留顯著的志賀毒素效應子功能，這取決于所要置換的氨基酸。通常，置換應該講極性和/或帶電荷的氨基酸殘基改變為非極性且不帶電荷的殘基。另外，減小整體氨基酸殘基R基團功能性側鏈的尺寸和/或長度可能是對表位破壞有益的。例如，丙氨酸他海滄是可接受的對任意氨基酸殘基的置換，并且，對于甘氨酸殘基，丙氨酸是優選的選擇。絲氨酸通常僅是用于丙氨酸殘基的可接受的置換。天冬氨酸通常僅是用于谷氨酸殘基的可接受的置換。賴氨酸通常僅是用于精氨酸殘基的可接受的置換。谷氨酰胺通常僅是用于谷氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基的可接受的置換。組氨酸通常僅是用于賴氨酸和精氨酸殘基的可接受的置換。然而，盡管這些置換的一般性更可能賦予表位破壞，但是，由于目的是保留顯著的志賀毒素效應子功能，因此，如果其與要被置換的氨基酸相似(諸如，例如，用較小尺寸的非極性和/或不帶電荷的殘基置換極性和/或帶電荷的殘基)，置換氨基酸可能更可能保留志賀毒素效應子功能。基于實施例長的經驗性證據，預測志賀毒素A亞基中的某些氨基酸位置耐受表位破壞，同時仍然保留顯著的志賀毒素效應子功能。例如，下述天然存在的位置耐受氨基酸置換(單獨的或組合的)，同時保留志賀毒素效應子功能(諸如細胞毒性)-SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的4；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的8；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的9；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的11；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的43；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的45；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的47；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的48；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的49；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的53；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的55；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的58；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的59；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的60；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的61；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的62；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的96；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的109；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的110；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的112；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的SE147；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的179；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的180；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的181；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的183；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的184；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的185；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的186；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的187；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的188；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的189；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的247；SEQIDNO：3的247；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的248；SEQIDNO：3的250；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的251；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的264；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的265；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的286。實施例中的經驗數據指出能夠降低抗原性和/或免疫原性同時保留顯著的志賀毒素效應子功能的其他表位破壞性置換和表位破壞性置換的組合，諸如，例如，前述截短耐受置換的位置以及在相關志賀毒素中相同的位置或保守位置的新置換的新組合。可以預測針對保守官能團的氨基酸殘基的其他氨基酸置換可以減低抗原性和/或免疫原性同時保留顯著的志賀毒素效應子功能。例如，技術人員已知與下述任一種相似的其他置換可以破壞表位，同時保留至少一種志賀毒素效應子功能：K1M，T4I，S8I，T8V，T9I，S9I，K11A，K11H，S33I，S45I，T45I，D47G，N48V，N48F，L49A，D53A，D53G，D53N，R55A，R55V，R55L，D58A，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，D94A，S96I，S109V，T109V，G110A，S112V，G147A，R179A，T180G，T181I，D183A，D183G，D184A，D184F，L185V，S186A，S186F，G187A，R188A，R188L，S189A，R204A，R205A，S247I，Y247A，R248A，R250A，R251A，D264A，G264A，T286A和/或T286I。具體地，與下述相似的針對保守氨基酸殘基的氨基酸置換可以具有相同或相似的作用：K1M，T4I，S8I，T8V，T9I，S9I，K11A，K11H，S33I，S45I，T45I，D47G，N48V，N48F，L49A，D53A，D53G，D53N，R55A，R55V，R55L，D58A，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，D94A，S96I，S109V，T109V，G110A，S112V，G147A，R179A，T180G，T181I，D183A，D183G，D184A，D184F，L185V，S186A，S186F，G187A，R188A，R188L，S189A，R204A，R205A，S247I，Y247A，R248A，R250A，R251A，D264A，G264A，T286A和/或T286I。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽可以包含相似的保守氨基酸置換，諸如，例如，K1置換成A，G，V，L，I，F，M和H；T4置換成A，G，V，L，I，F，M和S；S8置換成A，G，V，I，L，F和M；T9置換成A，G，V，I，L，F，M和S；S9置換成A，G，V，L，I，F和M；K11置換成A，G，V，L，I，F，M和H；S33置換成A，G，V，L，I，F和M；S45置換成A，G，V，L，I，F和M；T45置換成A，G，V，L，I，F和M；D47置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；N48置換成A，G，V，L和M；L49置換成A或G；D53置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；R55置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D58置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；P59置換成A，G和F；E60置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；E61置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；G62置換成A；D94置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S96置換成A，G，V，I，L，F和M；S109置換成A，G，V，I，L，F和M；T109置換成A，G，V，I，L，F，M和S；G110置換成A；S112置換成A，G，V，L，I，F和M；G147置換成A；R179置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；T180置換成A，G，V，L，I，F，M和S；T181置換成A，G，V，L，I，F，M和S；D183置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；D184置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S186置換成A，G，V，I，L，F和M；G187置換成A；R188置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S189置換成A，G，V，I，L，F，和M；R204置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R205置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S247置換成A，G，V，I，L，F和M；Y247置換成A，G，V，L，I，F和M；R248置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R250置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R251置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D264置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；G264置換成A；和T286置換成A，G，V，L，I，F，M和S。類似地，去除電荷、極性和/或減少側鏈長度的氨基酸置換可以破壞表位同時保留至少一種志賀毒素效應子功能。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽可以包含一個或多個通過置換破壞的表位，使得側鏈電荷被去除，極性被去除，和/或側鏈長度減小，諸如，例如，用選自下組的適當的氨基酸：A，G，V，L，I，P，C，M，F，S，D，N，Q，H或K，來置換在下述位置的氨基酸殘基：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的4；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的8；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的9；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的11；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的43；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的45；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的47；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的48；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的49；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的53；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的55；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的58；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的59；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的60；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的61；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的62；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的96；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的109；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的110；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的112；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的SE147；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的179；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的180；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的181；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的183；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的184；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的185；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的186；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的187；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的188；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的189；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的247；SEQIDNO：3的247；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的248；SEQIDNO：3的250；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的251；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的264；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的265；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的286。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽可以包含一個或多個下述氨基酸置換：K1置換成A，G，V，L，I，F，M和H；T4置換成A，G，V，L，I，F，M和S；S8置換成A，G，V，I，L，F和M；T9置換成A，G，V，I，L，F，M和S；S9置換成A，G，V，L，I，F和M；K11置換成A，G，V，L，I，F，M和H；S33置換成A，G，V，L，I，F和M；S45置換成A，G，V，L，I，F和M；T45置換成A，G，V，L，I，F和M；D47置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；N48置換成A，G，V，L和M；L49置換成A或G；D53置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；R55置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D58置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；P59置換成A，G和F；E60置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；E61置換成A，G，V，L，I，F，S，Q，N，D，M和R；G62置換成A；D94置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S96置換成A，G，V，I，L，F和M；S109置換成A，G，V，I，L，F和M；T109置換成A，G，V，I，L，F，M和S；G110置換成A；S112置換成A，G，V，L，I，F和M；G147置換成A；R179置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；T180置換成A，G，V，L，I，F，M和S；T181置換成A，G，V，L，I，F，M和S；D183置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；D184置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；S186置換成A，G，V，I，L，F和M；G187置換成A；R188置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S189置換成A，G，V，I，L，F和M；R204置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R205置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S247置換成A，G，V，I，L，F和M；Y247置換成A，G，V，L，I，F和M；R248置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R250置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R251置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；D264置換成A，G，V，L，I，F，S和Q；G264置換成A；和T286置換成A，G，V，L，I，F，M和S。另外，在志賀毒素效應子多肽的一個表位區中破壞表位同時保留顯著的志賀毒素效應子功能的氨基酸置換可以與在相同或不同表位區中任意其他破壞表位同時保留顯著的志賀毒素效應子功能的氨基酸置換組合，以形成具有多個被破壞的表位區同時仍然保留顯著水平的志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽。在某些實施方案中，本發明的志賀毒素效應子區多肽可以包含下個或多個下述組合：K1M可以與S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；S8I可以與K1M，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；T9I可以與K1M，S8I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；S9I可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；K11A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；S33I可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；S45V或S45I可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；T45I可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；D53A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；R55AK1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I可以與；D58A或D58F可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，G110A，D94A，S96I，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；R55A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；P59A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；E60R可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；E60I或E60A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；E61A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；G62A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；D94A可以與K1M，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；S96I可以與K1M，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；G110A可以與K1M，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；G147A可以與K1M，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；T180G可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；T181I可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；D183A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；D184A或D184F可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；R204A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R205A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；R205A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S33I，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，S247I，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；S247I可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，D264A，G264A，G265A，和/或T286I組合；D264A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，G264A，G265A，和/或T286I組合；G264A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G265A，和/或T286I組合；G265A可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，和/或T286I組合；和/或T286I可以與K1M，S8I，T9I，K11A，S45I，T45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，T180G，T181I，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，R204A，R205A，S247I，D264A，G264A，和/或G265A組合。基于實施例中的經驗證據，預測志賀毒素A亞基中的某些氨基酸耐受表位破壞，同時仍保留顯著的志賀毒素效應子功能。例如，天然位置在1-15、53-66、55-66、94-115和180-190的表位區耐受多個氨基酸置換組合，同時不喪失志賀毒素酶活性，并且通常不喪失細胞毒性(見實施例)。靶向細胞的結合區與去免疫化志賀毒素效應子區多肽連接允許當施用給哺乳動物(例如，人受試者)時有效的志賀毒素細胞毒性的細胞類型特異性的靶向的改造，具有較少的由抗原性和/或免疫原性導致的潛在的副作用。本發明的蛋白包含來源于志賀毒素家族成員A亞基的去免疫化志賀毒素效應子區，所述去免疫化志賀毒素效應子區與能夠特異性結合至少一種與細胞物理關聯的細胞外靶標生物分子，諸如表達在細胞表面上的靶標生物分子。由于任何數量的多樣性靶向細胞的結合區可以與本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽連接，因此，該通用結構是模塊式的。在本發明的某些實施方案中，蛋白包含來源于免疫球蛋白型多肽的結合區，針對與癌細胞的細胞表面上的表面抗原的特異性和高親和力結合選擇所述結合區，其中所述抗原在癌細胞中的表達是受限的(參見GloklerJ等，Molecules15：2478-90(2010)；LiuY等，LabChip9：1033-6(2009))。按照其他實施方案，所述結合區針對與癌細胞的細胞表面上的表面抗原的特異性和高親和力結合進行選擇，其中所述抗原較非癌癥細胞由癌細胞過表達或優先表達。一些代表性的靶標生物分子包括，但不限于，下文列舉的與癌癥和/或特異性免疫細胞型相關的靶標。現有技術中存在許多種識別與癌細胞相關的表位的免疫球蛋白型結合區，諸如靶向下述的結合區：膜聯蛋白AI，B3黑素瘤抗原，B4黑素瘤抗原，CD2，CD3，CD4，CD20(B-淋巴細胞抗原蛋白CD20)，CD22，CD25(白介素-2受體IL2R)，CD30(TNFRSF8)，CD38(環形ADP核糖水解酶)，CD40，CD44(透明質酸受體)，ITGAV(CD51)，CD66，CD71(轉鐵蛋白受體)，CD73，CD74(HLA-DR抗原-相關的不變鏈)，CD79，CD98，內皮因子(END，CD105)，CD106(VCAM-1)，4型趨化因子受體(CDCR-4，融合素，CD184)，CD200，胰島素樣生長因子1受體(CD221)，粘蛋白1(MUC1，CD227)，基細胞粘附分子(B-CAM，CD239)，CD248(內皮唾液酸蛋白，TEM1)，腫瘤壞死因子受體10b(TNFRSF10B，CD262)，腫瘤壞死因子受體13B(TNFRSF13B，TACI，CD276)，血管內皮生長因子受體2(KDR，CD309)，上皮細胞粘附分子(EpCAM，CD326)，人表皮生長因子受體2(HER2，Neu，ErbB2，CD340)，癌癥抗原15-3(CA15-3)，癌癥抗原19-9(CA19-9)，癌癥抗原125(CA125，MUC16)，CA242，癌胚抗原-相關的細胞粘附分子(例如，CEACAM3(CD66d)和CEACAM5)，癌胚抗原蛋白(CEA)，硫酸軟骨素蛋白聚糖4(CSP4，MCSP，NG2)，CTLA4，DLL4，表皮生長因子受體(EGFR，ErbB1)，葉酸受體(FOLR)，G-28，神經節苷脂GD2，神經節苷脂GD3，HLA-Dr10，HLA-DRB，人表皮生長因子受體1(HER1)，Ephrin型-B受體2(EphB2)，上皮細胞粘附分子(EpCAM)，成纖維細胞激活蛋白(FAP/seprase)，胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)，白介素2受體(IL-2R)，白介素6受體(IL-6R)，整聯蛋白α-Vβ-3(αVβ3)，整聯蛋白α-Vβ-5(αvβ5)，整聯蛋白α-5β-1(α5β1)，L6，MPG，黑素瘤-相關的抗原1蛋白(MAGE-1)，黑素瘤-相關的抗原3(MAGE-3)，mesothelin(MSLN)，MPG，MS4A，p21，p97，脊髓灰質炎病毒受體-樣4(PVRL4)，蛋白酶-活化的-受體(諸如PARl)，前列腺-特異性膜抗原蛋白(PSMA)，營養細胞糖蛋白(TPGB)，和腫瘤-相關的鈣信號轉導蛋白(TACSTDs)(參見，例如，LuiB等，CancerRes64：704-10(2004)；NovellinoL等，CancerImmunolImmunother54：187-207(2005)；BagleyR等，IntJOncol34：619-27(2009)；GerberH等，mAbs1：247-53(2009)；BeckA等，NatRevImmunol10：345-52(2010)；AndersenJ等，JBiolChem287：22927-37(2012)；Nolan-StevauxO等，PLoSOne7：e50920(2012)；RustS等，MolCancer12：11(2013))。該靶標生物分子的列表旨在是非限制性的。技術人員應該理解，可以使用任何與癌細胞或其他需要的細胞類型相關的靶標生物分子來設計或選擇與志賀毒素效應子區偶聯的結合區，從而產生本發明的蛋白。與癌細胞強烈相關的并且具有已知與癌細胞結合的免疫球蛋白型結合區的其他靶標生物分子的實例包括BAGE蛋白(B黑素瘤抗原)，基細胞粘附分子(BCAMs或Lutheran血型糖蛋白)，膀胱腫瘤抗原(BTA)，睪丸癌抗原NY-ESO-1，睪丸癌抗原LAGE蛋白，CD19(B-淋巴細胞抗原蛋白CD19)，CD21(補體受體-2或補體3d受體)，CD26(二肽基肽酶-4，DPP4，或腺苷脫氨酶復合蛋白2)，CD33(唾液酸-結合免疫球蛋白-型凝集素-3)，CD52(CAMPATH-1抗原)，CD56，CS1(SLAM家族7號或SLAMF7)，細胞表面A33抗原蛋白(gpA33)，EB病毒抗原蛋白，GAGE/PAGE蛋白(黑素瘤相關的癌癥/睪丸抗原)，肝細胞生長因子受體(HGFR或c-Met)，MAGE蛋白，由T細胞1蛋白識別的黑素瘤抗原(MART-1/MelanA，MARTI)，粘蛋白，優先表達的黑素瘤抗原(PRAME)蛋白，前列腺特異性的抗原蛋白(PSA)，前列腺干細胞抗原蛋白(PSCA)，晚期糖基化終產物受體(ReceptorforAdvancedGlycationEndroducts(RAGE))，腫瘤相關的糖蛋白72(TAG-72)，血管內皮生長因子受體(VEGFRs)，和腎母細胞瘤(Wilms’tumor)抗原。其他與癌細胞強烈相關的靶標生物分子的實例是碳酸酐酶IX(CA9/CAIX)，Claudin蛋白(CLDN3，CLDN4)，蝶素(ephrin)型-A受體3(EphA3)，葉酸結合蛋白(FBP)，神經節苷脂GM2，胰島素樣生長因子受體，整聯蛋白(諸如CDlla-c)，核因子κB的受體激活劑(RANK)，受體酪氨酸-蛋白激酶erB-3，腫瘤壞死因子受體10A(TRAIL-R1/DR4)，腫瘤壞死因子受體10B(TRAIL-R2)，生腱蛋白C，和CD64(FcγRI)(參見HoughC等，CancerRes60：6281-7(2000)；ThepenT等，NatBiotechnol18：48-51(2000)；PastanI等，NatRevCancer6：559-65(2006)；Pastan，AnnuRevMed58：221-37(2007)；FitzgeraldD等，CancerRes71：6300-9(2011)；ScottA等，CancerImmun12：14-22(2012))。該靶標生物分子的列表旨在是非限制性的。另外，存在所考慮的靶標生物分子的多種其他的實例，諸如ADAM金屬蛋白酶(例如，ADAM-9，ADAM-10，ADAM-12，ADAM-15，ADAM-17)，ADP-核糖基轉移酶(ART1，ART4)，抗原F4/80，骨髓間質抗原(BST1，BST2)，斷點簇區-c-ab1癌基因(breakpointclusterregion-c-abloncogene(BCR-ABL))蛋白，C3aR(補體成分3a受體)，CD7，CD13，CD14，CD15(LewisX或階段特異胚抗原1)，CD23(FCεRII)，CD49d，CD53，CD54(細胞內粘附分子1)，CD63(四跨膜蛋白(tetraspanin))，CD69，CD80，CD86，CD88(補體成分5a受體1)，CD115(集落刺激因子1受體)，CD123(白介素-3受體)，CD129(白介素9受體)，CD183(趨化因子受體CXCR3)，CD191(CCR1)，CD193(CCR3)，CD195(趨化因子受體CCR5)，CD203c，CD225(干擾素-誘導的跨膜蛋白1)，CD244(天然殺傷細胞受體2B4)，CD282(toll-樣受體2)，CD284(Toll-樣受體4)，CD294(GPR44)，CD305(白細胞-相關的免疫球蛋白-樣受體1)，蝶素型-A受體2(EphA2)，FceRIa，半乳凝素-9，甲胎蛋白抗原17-A1蛋白，人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羥化酶(HAAH)，免疫球蛋白-樣轉錄物ILT-3，溶血磷脂酰甘油酰基轉移酶1(LPGAT1/IAA0205)，溶酶體-相關的膜蛋白(LAMPs，諸如CD107)，黑素細胞蛋白PMEL(gp100)，骨髓-相關的蛋白-14(mrp-14)，受體酪氨酸-蛋白激酶erbB-3，SART蛋白，清道夫受體(諸如CD64和CD68)，Siglecs(唾液酸-結合免疫球蛋白-型凝集素)，多配體聚糖(諸如SDC1或CD138)，酪氨酸酶，酪氨酸酶-相關的蛋白1(TRP-1)，酪氨酸酶-相關的蛋白2(TRP-2)，酪氨酸酶相關的抗原(TAA)，APO-3，BCMA，CD2，CD3，CD4，CD8，CD18，CD27，CD28，CD29，CD41，CD49，CD90，CD95(Fas)，CD103，CD104，CD134(OX40)，CD137(4-1BB)，CD152(CTLA-4)，趨化因子受體，補體蛋白，細胞因子受體，組織相容性蛋白，ICOS，白介素-α，白介素-β，c-myc，骨保護素，PD-1，RANK，TACI，TNF受體超家族成員(TNF-R1，TNFR-2)，Apo2/TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRAIL-R3，和TRAIL-R4(參見ScottA等，CancerImmunity12：14(2012)；CheeverM等，ClinCancerRes15：5323-37(2009))，關于靶標生物分子，并且注意本文所述的靶標分子是非限制性的實例)。技術人員應該理解，可以使用任何需要的靶標生物分子來設計或選擇要與去免疫化志賀毒素效應子區偶聯的結合區，以產生本發明的蛋白。在某些實施方案中，所述結合區包含針對與免疫系統細胞類型的細胞表面的特異性和高親和力結合選擇的免疫球蛋白型多肽或基本上由其組成。例如，已知結合下述的免疫球蛋白型結合結構域：CD1，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD9，CD10，CD11，CD12，CD13，CD14，CD15，CD16，CD17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD40，CD41，CD56，CD61，CD62，CD66，CD95，CD117，CD123，CD235，CD146，CD326，白介素-2受體(IL-2R)，核因子κB的受體激活劑(RANKL)，SLAM-相關的蛋白(SAP)，和TNFSF18(腫瘤壞死因子配體18或GITRL)。對于特定的實施方案，去免疫化細胞毒性蛋白包含下述氨基酸或基本上由下述氨基酸組成：SEQIDNO：53，SEQIDNO：54，SEQIDNO：55，或SEQIDNO：56。這些去免疫化的CD20-結合性細胞毒性蛋白實施方案可以用于治療和/或診斷骨癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、淀粉樣變性(amyloidosis)、強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、哮喘、克羅恩病(Crohn’sdisease)、糖尿病、移植物排斥、移植物對抗宿主病(graft-versus-hostdisease)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)、溶血性尿毒癥綜合征(hemolyticuremicsyndrome)、HIV-相關的疾病、紅斑狼瘡、多發性硬化(multiplesclerosis)、多動脈炎(polyarteritis)、銀屑病(psoriasis)、牛皮癬關節炎(psoriaticarthritis)、類風濕性關節炎(rheumatoidarthritis)、硬皮病(scleroderma)、感染性休克(septicshock)、舍格倫綜合征(Sjorgren’ssyndrome)、潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis)和/或脈管炎(vasculitis)。對于特定的實施方案，去免疫化細胞毒性蛋白包含SEQIDNO：57、SEQIDNO：58或SEQIDNO：59的氨基酸或基本上由其組成。這些去免疫化的HER-2-結合性細胞毒性蛋白實施方案可以用于治療和/或診斷乳腺癌、宮頸癌(cervicalcancer)、頭頸癌(例如，口咽癌(oropharynx))、胃腸癌(例如，食道癌和結直腸癌)、腎-尿道癌(例如，膀胱癌)、肺/胸膜癌和卵巢癌。在某些實施方案中，所述結合區包含針對靶向細胞外受體選擇的配體或基本上由所述配體組成。一些代表性的配體包括，但不限于，下述骨形態生成蛋白和激活蛋白膜結合的抑制劑BAMBI(也稱為TGFBR)，CD137L(也稱為4-1BB)，誘餌受體3DcR3(也稱為TR6和TNFRSF6B)，和腫瘤壞死因子TWEAK(也稱為TNFSF12和APO3L)。關于更多非限制性的示例性配體，見實施例中的表12。在表位破壞后變為非毒性的去免疫化志賀毒素效應子區，例如，包含R179A的志賀毒素效應子區，仍然可以用于將外源物質遞送到細胞內。僅保留顯著水平的志賀毒素催化活性功能的去免疫化志賀毒素效應子區仍然可以用作酶活性的去免疫化的分子成分。使用本發明的多肽和蛋白的片段、變體和/或衍生物也在本發明的范圍內，其包含功能性細胞外靶標生物分子結合位點，并且甚至更優選地能夠以高親和力結合所述靶標生物分子(例如，由KD所示)。例如，任何包含以10-5至10-12摩爾/升、優選小于200nM的解離常數結合靶標生物分子(優選表達在細胞表面上)的多肽的結合區可以替代用于制備本發明的分子(例如，去免疫化志賀毒素效應子多肽和細胞毒性蛋白)和用于本發明的方法。IV.去免疫化志賀毒素效應子區多肽和蛋白的一般功能由于在哺乳動物中產生不需要的免疫應答的可能性降低，本發明的多肽和蛋白具有改進的應用，用于施用給哺乳動物物種作為治療劑和/或診斷劑。重要的是，在本發明的多肽中，在B細胞表位破壞后，原始志賀毒素效應子區的需要的生物學功能得以保留。另外，B細胞表位通常與成熟CD4+T細胞的表位相同或重疊，由此破壞B細胞表位通常同時破壞了CD4+T細胞表位。在施用給多種哺乳動物時，本發明的多種去免疫化志賀毒素效應子多肽可能區別在于它們的抗原性模式，但是預測具有降低的抗原性和/或免疫原性。為了改善其在涉及施用給哺乳動物的醫學應用中的用途，不需要完全消除志賀毒素來源的多肽的所有免疫原性(參見Nagata，AdvDrugDelivRev61：977-85(2009))。治療性蛋白中僅一些主導性氨基酸的修飾可以極大地降低其抗原性和/或免疫原性，而不干擾蛋白的整體穩定性、結構和功能。然而，當理想地避免了不需要的B細胞和/或CD4+T細胞免疫應答時，預測在更加免疫原性的B細胞表位中具有破壞的志賀毒素效應子多肽對于施用給哺乳動物是更有利的。本發明提供多種去免疫化志賀毒素效應子多肽，其可以用作多種主題組合物的組分，諸如靶向細胞的細胞毒性蛋白和診斷組合物。特別地，所述去免疫化志賀毒素效應子多肽具有作為多種蛋白治療劑(諸如，例如，免疫毒素和配體-毒素融合體)的組分的用途，用于特定細胞類型的靶向性殺傷，以用于治療多種疾病，包括癌癥、免疫病癥和微生物感染。本發明還提供多種細胞毒性蛋白，其包含與結合區功能性締合的去免疫化志賀毒素效應子區，從而實現細胞靶向，使得所述細胞毒性蛋白選擇性殺傷、抑制特定細胞類型、向特定細胞類型遞送外源物質和/或檢測特定細胞類型。本發明的蛋白的結合區能夠特異性結合與細胞物理關聯的至少一種細胞外靶標生物分子，諸如在細胞的表面上表達的靶標生物分子。靶向細胞的結合區與去免疫化志賀毒素效應子區多肽的結合允許有效的志賀毒素細胞毒性和/或白細胞淤積的細胞型特異性靶向的改造。在某些實施方案中，本發明的蛋白能夠結合與特定細胞性的細胞表面締合的細胞外靶標生物分子并且進入這些分子。一旦在靶向的細胞型中內在化，本發明的蛋白的某些實施方案能夠提供路線運送酶活性的、細胞毒性的志賀毒素效應子多肽片段進入靶細胞的細胞質中。一旦進入靶向的細胞型的細胞質中，本發明的細胞毒性蛋白的某些實施方案能夠使核糖體酶促失活，并且最終殺傷所述細胞。備選地，本發明的蛋白的無毒變體可以用于將另外的外源物質遞送到靶細胞中，諸如，肽、多肽、蛋白、多核苷酸和檢測促進劑。由于任意數量的多樣性結合區可以用于使該有效的細胞毒性靶向多種、多樣性的細胞性，該系統是模塊式的。A.通過靶向的志賀毒素細胞毒性的細胞殺傷由于志賀毒素家族的成員適合殺傷真核細胞，因此，使用去免疫化志賀毒素效應子區設計的細胞毒性蛋白可以表現出有效的細胞殺傷活性。志賀毒素家族的成員的A亞基包含能夠在進入細胞的細胞質中后殺傷真核細胞的酶結構域。B細胞表位的破壞沒有顯著改變本發明的特定志賀毒素效應子區的細胞毒性機制。因此，本發明的去免疫化細胞毒性蛋白保持有效的細胞毒性，同時降低了在施用給哺乳動物時某些免疫應答的可能性。在本發明的去免疫化細胞毒性蛋白的特定實施方案中，當與本發明細胞毒性蛋白的結合區的細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞接觸時(靶標+細胞)，所述細胞毒性蛋白能夠引起該細胞的死亡。在不同的靶細胞條件下，諸如離體操作的靶細胞、體外培養的靶細胞、在體外培養的組織樣品內的靶細胞或體內靶細胞，使用本發明的細胞毒性蛋白可以實現細胞殺傷。B.在多種細胞型之間的選擇性細胞毒性通過利用高親和性結合區使酶活性、去免疫化的志賀毒素區的遞送靶向特定細胞類型，該有效的細胞殺傷活性可以限制為優先殺傷所選擇的細胞型。在某些實施方案中，在將本發明的蛋白施用給細胞型的混合物后，所述蛋白能夠相對于沒有與細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞類型選擇性地殺傷與細胞外靶標生物分子物理偶聯的那些細胞。因為志賀毒素家族的多個成員適合用于殺傷真核細胞，使用志賀毒素效應子區設計的細胞毒性蛋白可以顯示出有效的細胞毒性活性。通過使用高親和力結合區域將酶活性的志賀毒素區域的遞送靶向特定細胞類型，該有效的細胞殺傷活性可以限于僅殺傷希望通過它們與選擇的結合區的靶標生物分子的物理結合而靶向的那些細胞型。在某些實施方案中，本發明的細胞毒性蛋白能夠選擇性地或優先地造成兩個或更多個不同細胞型的混合物內的特定細胞型的死亡。這能夠實現與不表達靶標生物分子的“旁觀”細胞類型相比高優先的對特定細胞類型的靶向細胞毒性活性，諸如3倍細胞毒性效應。備選地，如果靶標生物分子以足夠低的量表達和/或以低量與不靶向的細胞型物理偶聯，則結合區的靶標生物分子的表達可以不專屬于一種細胞類型。這允許相對于不表達顯著量的靶標生物分子或不與顯著量的靶標生物分子物理偶聯的“旁觀”細胞類型以高優先性(諸如3-倍的細胞毒性作用)進行特定細胞類型的靶向性細胞殺傷。在某些其它實施方案中，在將細胞毒性蛋白施用給兩個不同的細胞型群體后，細胞毒性蛋白能夠造成細胞死亡，如通過關于靶細胞群體(其成員表達細胞毒性蛋白的結合區的細胞外靶標生物分子)的半數最大細胞毒性濃度(CD50)所確定的，其劑量比相同細胞毒性蛋白對于其成員不表達細胞毒性蛋白的結合區的細胞外靶標生物分子的細胞群體的CD50劑量低至少3倍。在某些實施方案中，對與細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞型的群體的細胞毒性活性比對沒有與結合區的任何細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞型群體的細胞毒性活性至少3倍高。根據本發明，可以以下述比率(a/b)的方式定量選擇性的細胞毒性：(a)對與結合區的靶標生物分子物理偶聯的特定細胞型的細胞群體的細胞毒性：(b)對沒有與結合區的靶標生物分子物理偶聯的細胞型的細胞群體的細胞毒性。在某些實施方案中，所述細胞毒性比率指示，相對于沒有與結合區的靶標生物分子物理偶聯的細胞群體或細胞型，對與結合區的靶標生物分子物理偶聯的細胞群體或細胞型的選擇性的細胞毒性至少3倍高、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍。該優先細胞殺傷功能允許本發明的某些細胞毒性蛋白在不同條件下和在有非靶向的旁觀細胞(諸如離體操作的細胞型的混合物、體外培養的含有細胞型混合物的組織)存在下、或在體內在有多個細胞型存在下(例如原位或在其多細胞生物體內的天然位置)殺傷被靶向的細胞。C.另外的外源物質向被靶向的細胞的內部的遞送除了細胞毒性和細胞生長抑制應用以外，本發明的蛋白任選地可以用于信息收集和診斷功能。此外，本發明的細胞毒性蛋白的無毒變體或任選的有毒變體可以用于將另外的外源物質遞送至與細胞毒性蛋白的細胞外靶標生物分子物理偶聯的細胞內部和/或標記所述細胞內部。本發明的用于接收外源物質的蛋白可以靶向表達所述靶標生物分子到至少一個細胞表面的不同類型的細胞和/或細胞群體。本發明的功能組分是模塊化的，因為不同的志賀毒素效應子區和另外的外源物質可以連接至不同的結合區以提供不同的應用，諸如腫瘤細胞的非侵入性體內成像。因為本發明的蛋白(包括其無毒形式)能夠進入與細胞外靶標生物分子(被其結合區識別)物理偶聯的細胞中，本發明的蛋白的某些實施方案可以用于將另外的外源物質遞送進被靶向的細胞型的內部。在一個意義上，本發明的整個蛋白是進入細胞的外源物質；因而，“另外的”外源物質是與核心細胞毒性蛋白本身連接、但是除此以外的異源物質。在表位破壞后變成無毒性的去免疫化志賀毒素效應子區仍然可以用于將外源物質遞送到細胞內(例如，R179A)。本文中使用的“另外的外源物質”表示一個或多個分子，其經常是通常不存在于天然靶細胞內，其中本發明的蛋白可以用于特異性地將這樣的物質運輸至細胞內部。另外的外源物質的非限制性例子是肽、多肽、蛋白、多核苷酸、小分子化學治療劑和檢測促進劑。在某些實施方案中，所述另外的外源物質包含含有酶的蛋白或多肽。在某些其它實施方案中，所述另外的外源物質是核酸，例如，作為小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些實施方案中，所述另外的外源物質是抗原，諸如從細菌蛋白、病毒蛋白、在癌癥中突變的蛋白、在癌癥中異常表達的蛋白、或T-細胞互補決定區來源的抗原。例如，外源物質包括抗原，諸如被細菌感染的抗原呈遞細胞特有的那些抗原，和能夠作為外源抗原起作用的T-細胞互補決定區。外源物質的其它例子包括比抗原肽更大的多肽和蛋白，諸如酶。包含多肽或蛋白的外源物質可以任選地包含一個或多個抗原，無論是技術人員已知的還是未知的。D.用于診斷功能的信息收集本發明的某些蛋白用在特定細胞、細胞型和/或細胞群體的體外和/或體內檢測中。在某些實施方案中，本文描述的蛋白用于診斷和治療二者，或僅用于診斷。當相同細胞毒性蛋白用于診斷和治療二者時，通過一個或多個氨基酸置換(包括本文描述的示例性置換)對志賀毒素效應子區的催化滅活，可以使包含用于診斷的檢測促進劑的細胞毒性蛋白變體無毒。與檢測促進劑綴合的、本發明的細胞毒性蛋白的無毒形式任選地可以用于診斷功能，諸如用于與包含相同或相關結合區域的治療方案聯合使用的伴侶診斷。將本領域已知的檢測促進劑與本發明的各種蛋白綴合的能力會提供用于檢測癌癥、腫瘤、免疫和被感染的細胞的有用組合物。通過本領域已知的各種成像技術和測定，本發明的蛋白的這些診斷實施方案可以用于信息收集。例如，通過患者或活組織檢查樣品中各個癌細胞、免疫細胞或受感染的細胞的細胞內細胞器(例如內吞隔室、高爾基隔室、內質網隔室和細胞溶質隔室)的成像，本發明的蛋白的診斷實施方案可以用于信息收集。使用本發明的蛋白的診斷實施方案可以收集不同類型的信息，無論用于診斷用途還是其它用途。該信息可用于，例如，診斷贅生性細胞類型，確定患者的疾病的治療敏感性，測定抗腫瘤治療隨時間的進展，測定免疫調節治療隨時間的進展，測定抗微生物治療隨時間的進展，評價受感染的細胞在移植物中的存在，評價不希望的細胞類型在移植物中的存在，和/或評價腫瘤塊的外科手術切除以后殘余腫瘤細胞的存在。例如，使用用本發明的蛋白的診斷變體收集的信息，可能確定患者亞群，然后可以基于使用那些診斷實施方案揭示的他們的獨特特征將各個患者分類成亞群。例如，特定藥物或治療的有效性可能是用于定義患者亞群的一類判據。例如，可以使用本發明的特定細胞毒性蛋白的無毒診斷變體區分哪些患者屬于預期對本發明的相同蛋白的細胞毒性變體做出陽性應答的患者的類別或亞群。因此，使用本發明的去免疫化的蛋白(包括本發明的細胞毒性蛋白的無毒變體)進行患者鑒別、患者分級和診斷的有關方法被認為是在本發明范圍內。E.免疫/接種物質和抗毒素本發明的多肽具有作為偏向性免疫(biasedimmunization)和/或接種材料用于在存在本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽的條件下驅動針對特異性表位的免疫應答的引發。產生志賀毒素的微生物的感染負責發病率和死亡率(Johannes，NatRevMicrobiol8：105-16(2010))。產生志賀毒素的細菌是溶血性尿毒癥綜合征(hemolyticuremicsyndrome)(HUS)和志賀氏菌病(Shigellosis)以及相關的病況(諸如出血性結腸炎和痢疾)的主要原因(參見KarmaliM，MolBiotechnol26：117-22(2004))。另外，美國疾病控制和預防中心(U.S.CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC)將志賀毒素依據它們用作生物武器的潛力將它們分類為B類生物威脅劑。在針對志賀全毒素或志賀毒素亞基的免疫應答過程中引發的哺乳動物抗體可以是中和性的或非中和性的(取決于表位)。此外，識別志賀毒素的抗體可能具有不同的中和作用，這取決于哪個志賀毒素亞基包含抗體的表位(Krautz-PetersonG等，InfectImmun76：1931-9(2008))。本發明的某些多肽因此用于人工驅動與某些表位區無關的哺乳動物免疫應答(諸如例如，其引發不需要的非中和抗體)和針對其他表位的哺乳動物免疫應答(諸如，例如，其引發需要的中和和/或保護性抗體)的方法，。本發明的某些多肽具有作為偏向性免疫和/或接種材料的應用，用在用于降低和/或消除特定表位的抗原性和/或免疫原性同時允許引發針對沒有破壞的天然表位的免疫應答的方法中。可以使用用于哺乳動物的免疫技術來產生偏離志賀毒素A亞基的選定表位區的抗志賀毒素抗體。另外，本發明的某些多肽可以用于多種篩選方法，諸如，例如，蛋白展示篩選和體外選擇，用于產生、鑒定和親和力成熟多種結合結構域(諸如，例如，免疫球蛋白型結構域)，其結合志賀毒素，以使篩選選擇偏離志賀毒素A亞基選定的表位區(參見GloklerJ等，Molecules15：2478-90(2010)；BradburyA等，NatBiotechnol29：245-54(2011)；ChenT，KeatingA，ProteinSci21：949-63(2012)；GeyerC等，MethodsMolBiol901：11-32(2012))。這些方法特別用于靶向不連續的表位，所述不連續的表位在不存在其他未被靶向的表位的條件下不能被靶向。這些方法用于產生新型中和抗體和抑制志賀毒素毒性的非免疫球蛋白型結構域(參見PereraL等，JClinMicrobiol26：2127-31(1988)；MukherjeeJ等，InfectImmun70：5896-9(2002)；SmithM等，InfectImmun77：2730-40(2009)；RochaL等，Toxins4：729-47(2012)；TremblayJ等，InfectImmun81：4592-603(2013)；SkinnerC等，PLoSOne9：e99854(2014))。本發明的某些多肽可以用作免疫材料用在產生和/或制備偏向性抗志賀毒素抗體或抗毒素的方法中。可以使用用于免疫動物的免疫技術來產生偏離志賀毒素A亞基選定的表位區的抗志賀毒素抗體。例如，本發明的某些多肽可以用作免疫材料以產生偏離志賀毒素A亞基選定的表位區的抗志賀毒素A亞基抗體。另外，通過將本發明的去免疫化志賀毒素A亞基與志賀毒素B亞基組合，可以使用免疫技術來產生偏向針對存在于天然志賀毒素B亞基和/或全毒素中存在的各個志賀毒素亞基之間的界面上的表位的抗志賀毒素抗體。這些抗志賀毒素抗體具有在涉及免疫檢測測定且用于產生志賀毒素中和抗體或抗毒素的方法中的應用(參見MukherjeeJ等，InfectImmun70：5896-9(2002)；SheoranA等，InfectImmun71：3125-30(2003)；ChengL等，Toxins5：1845-58(2013)；HeX等，JImmunolMethods389：18-28(2013)；TremblayJ等，InfectImmun81：4592-603(2013))。因此，本發明的某些多肽可以用于更好地產生志賀毒素中和抗體，然后，該可以可以作為保護劑、治療劑施用，或者被改造成保護劑和/或治療劑用于治療由產生志賀毒素的微生物或對志賀毒素的其他暴露引起的感染(參見Fujiij等，MicrobPathog25：139-46(1998)；MukherjeeJ等，InfectImmun70：5896-9(2002)；SheoranA等，InfectImmun71：3125-30(2003)；GaoX等，Vaccine29：6656-63(2011)；ChengL等，Toxins5：1845-58(2013)；HeX等，JImmunolMethods389：18-28(2013)；TremblayJ等，InfectImmun81：4592-603(2013)；VanceD等，JBiolChem288：36538-47(2013))。本發明的某些多肽可以用作接種材料用在用于產生和/或制備偏向性抗志賀毒素抗體的方法中。可以與包含本發明的某些多肽的組合物一起使用接種技術，以賦予哺乳動物針對由產生志賀毒素的微生物或其他暴露于志賀毒素引起的將來的感染的主動免疫性(參見BosworthB等，InfectImmun64：55-60(1996)；RabinovitzB等，JDairySci95：3318-26(2012))。疫苗設計可以考慮引發中和抗體相對于非中和抗體的表位之間的差異(存在非中和抗體干擾受試者中國的保護性中和抗體的可能性)。例如，在五種針對志賀全毒素的抗體的研究中，僅有一種表現出中和活性，并且這種抗體結合A和B亞基二者(HeX等，JImmunolMethods389：18-28(2013))。類似地，對于AB毒素蓖麻毒蛋白，中和抗體識別A與B亞基之間的界面，并且防止A亞基片段的釋放(O’HaraJ，MantisN，JImmunolMethods395：71-8(2013))。為了接種目的，使疫苗材料偏向引發主要針對外部表位和/或跨越全毒素結構中A亞基與B亞基的交界面的表位的抗體應答可能是更有利的(O’HaraJ，MantisN，JImmunolMethods395：71-8(2013)；O’HaraJ等，CurrTopMicrobiolImmunol357：209-41(2012))。例如，針對蓖麻毒蛋白的接種已經得益于儀引發非保護性的非中和抗體的天然免疫原性區域的消除(OlsnesS，Tbxicon44：361-70(2004))。類似地，去除蓖麻毒蛋白的免疫顯性區域可能具有偏離產生針對某些表位的非中和抗體的偏向性抗體反應(O’HaraJ等，Vaccine28：7035-46(2010))或甚至偏離產生毒素增強抗體的偏向性抗體反應(MaddaloniM等，JImmunol172：6221-8(2004))。為了該目的，消除分離的志賀毒素A區域內的某些表位可能去除不需要的表位，并且驅動更需要的表位的抗體產生，諸如跨越志賀毒素亞基界面的表位。本發明用作偏向性免疫和/或接種材料的多肽可能得益于志賀毒素效應子功能(諸如酶活性和/或細胞毒性)的減少和/或消除，諸如酶活性和/或細胞毒性(HeX等，JImmunolMethods389：18-28(2013)；SkinnerC等，PLoSOne9：e99854(2014))。志賀毒素效應子功能的減少或消除可以使用公知的方法通過使用技術人員已知的或由技術人員發現的一個或多個截短和/或氨基酸置換來實現。另外，志賀毒素效應子功能的減少或消除可以通過使用實施例中所述的置換來實現，所述置換在志賀毒素效應子測定中表現出減弱的、嚴重降低的活性和/或活性喪失，諸如，例如，核糖體抑制和靶向性細胞毒性。V.去免疫化志賀毒素效應子區多肽和蛋白的多肽序列中的變異技術人員會認識到，可以對本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和蛋白以及編碼前述任一種的多核苷酸做出變化，而不減少它們的生物活性，例如，通過維持毒素效應子區的整體結構和功能聯合一個或多個降低抗原性和/或免疫原性潛力的表位破壞。例如，有些修飾可以促進表達、純化和/或藥代動力學性能和/或免疫原性。這樣的修飾是技術人員眾所周知的，且包括，例如，將甲硫氨酸添加在氨基端以提供起始位點，將另外的氨基酸放置在任一端上以產生方便地定位的限制位點或終止密碼子，和使生化親和標簽與任一端融合以提供方便的檢測和/或純化。在本文中還預見到在氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸殘基，諸如表位標簽或其它結構部分的序列。所述另外的氨基酸殘基可以用于多種目的，包括，例如，促進克隆，促進表達、翻譯后修飾，促進合成、純化，促進檢測和施用。表位標簽和結構部分的非限制性例子是：殼多糖(chitin)結合蛋白結構域、腸肽酶切割位點、因子Xa切割位點、FIAsH標簽、FLAG標簽、綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-轉移酶結構部分、HA標簽、麥芽糖結合蛋白結構域、myc標簽、聚組氨酸標簽、ReAsH標簽、strep-標簽、strep-標簽II、TEV蛋白酶位點、硫氧還蛋白結構域、凝血酶切割位點和V5表位標簽。在某些以上實施方案中，本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白的多肽序列不同在于多肽區中的一個或多個保守氨基酸置換，條件是在本文提供的至少一個天然位置的表位區中至少一個氨基酸被破壞。本文中使用的術語“保守置換”表示一個或多個氨基酸被另一個生物學上相似的氨基酸殘基替換。例子包括具有相似特征的氨基酸殘基(例如小氨基酸、酸性氨基酸、極性氨基酸、堿性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的置換(例如，參見下表B)。使用通常不存在于內源哺乳動物肽和蛋白中的殘基的保守置換的一個例子是利用例如鳥氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一種堿性氨基酸對精氨酸或賴氨酸殘基的保守置換。關于與肽和蛋白中表型上沉默的置換相關的其它信息，參見，例如，BowieJ等，Science247：1306-10(1990)。表B.保守氨基酸置換的實例在表B的保守置換方案中，示例性的保守氨基酸置換根據物理化學性質進行分組——I：中性的、親水的；II：酸和酰胺；III：堿性的；IV：疏水的；V：芳族的、龐大氨基酸，VI親水的、不帶電荷的，VII脂族不帶電荷的，VIII非極性的不帶電荷的，IX環烯基相關的、X疏水的，XI極性的，XII小的，XIII允許旋轉的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置換包括下述：1)S可以置換C；2)M或L可以置換F；3)Y可以置換M；4)Q或E可以置換K；5)N或Q可以置換H；和6)H可以置換N。另外的保守氨基酸置換包括下述：1)S可以置換C；2)M或L可以置換F；3)Y可以置換M；4)Q或E可以置換K；5)N或Q可以置換H；和6)H可以置換N。在某些實施方案中，本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白可以包含本發明的多肽區域的功能片段或變體，與本文引用的多肽序列相比，所述功能片段或變體最多具有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸置換，條件是，其保留在實施例中提供的在天然位置的表位區中的至少一個氨基酸的破壞(表1，2，3，4，和/或5)，并且其單獨地或作為本發明的治療和/或診斷組合物的組分時表現出顯著水平的志賀毒素效應子功能。作為通過下述改變本發明的蛋白的多肽的結果，本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白的變體是在本發明范圍內：改變一個或多個氨基酸或刪除或插入一個或多個氨基酸(諸如在結合區或志賀毒素效應子區內)，以便實現期望的性能，諸如改變的細胞毒性、改變的細胞生長抑制作用、改變的免疫原性和/或改變的血清半衰期。去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或本發明的蛋白的多肽還可以具有或沒有信號序列。在某些實施方案中，本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白與本文引用的蛋白的氨基酸序列中的任一個具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，只要其保留在實施例中提供的在天然位置的表位區中的至少一個氨基酸的破壞(表1，2，3，4，和/或5)，并且保持可測量的生物活性如細胞毒性、細胞外靶標生物分子結合、酶催化、亞細胞按路線發送或催化失活核糖體。在某些實施方案中，可以改變本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白，以改變志賀毒素效應子區的酶活性和/或細胞毒性，只要在實施例中提供的在天然位置的表位區中的至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)。這種改變可以或可以不引起改變的志賀毒素效應子區是其中的組分的志賀毒素效應子區多肽或細胞毒性蛋白的細胞毒性的改變。可能的改變包括志賀毒素效應子區多肽的選自由下列各項組成的組的突變：截短、缺失、倒置、插入和置換，只要在實施例中提供的在天然位置的表位區中的至少一個氨基酸被破壞(表1，2，3，4，和/或5)即可。可以通過突變或截短來減少或消除志賀毒素家族成員的A亞基的細胞毒性。已經證明標記為酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置對于Stx、Stx1、和Stx2的催化活性是重要的(HovdeC等，ProcNatlAcadSciUSA85：2568-72(1988)；DeresiewiczR等，Biochemistry31：3272-80(1992)；DeresiewiczR等，MolGenGenet241：467-73(1993)；OhmuraM等，MicrobPathog15：169-76(1993)；CaoC等，MicrobiolImmunol38：441-7(1994)；SuhanM，HovdeC，InfectImmun66：5252-9(1998))。在無細胞核糖體失活測定中將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變消除了Slt-IA1的酶活性(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。在利用內質網中Slt-IA1的從頭表達的另一種方法中，將谷氨酸-167和精氨酸-170二者突變在所述表達水平上消除了Slt-IA1片段細胞毒性(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。截短分析表明，殘基75至268的StxA的片段在體外仍然保持明顯的酶活性(Haddad，JBacteriol175：4970-8(1993))。通過細胞質中的從頭表達，含有殘基1-239的Slt-IA1的截短片段顯示出明顯的體外酶活性和細胞毒性(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。截短至殘基1-239的Slt-IA1片段在內質網中的表達不是細胞毒性的，因為其不能逆移位到細胞質中(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。志賀毒素A亞基中對酶活性和/或細胞毒性最重要的殘基被繪圖定位至以下殘基位置：特別是天冬酰胺-75、酪氨酸-77、酪氨酸-114、谷氨酸-167、精氨酸-170、精氨酸-176和色氨酸-203(Di，Toxicon57：535-39(2011))。尤其是，含有谷氨酸-E167到賴氨酸和精氨酸-176到賴氨酸突變的Stx2A的雙突變構建體完全失活；而Stx1和Stx2中的許多單一突變顯示出細胞毒性的10倍降低。此外，截短Stx1A至1-239或1-240降低了其細胞毒性，并且類似地，截短Stx2A至保守疏水殘基降低了其細胞毒性。志賀毒素A亞基中對結合真核核糖體和/或真核核糖體抑制最重要的殘基被繪圖定位至以下殘基位置：特別是精氨酸-172、精氨酸-176、精氨酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、纈氨酸-191和亮氨酸-233(McCluskeyA等，PLoSOne7：e31191(2012)。志賀樣毒素1A亞基截短是具有催化活性的，能夠在體外使核糖體酶促失活，并且當在細胞內表達時是具有細胞毒性的(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。展現出完全酶活性的最小志賀毒素A亞基片段是由Slt1A的殘基1-239組成的多肽(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。盡管報道的保持基本催化活性的志賀毒素A亞基的最小片段是StxA的殘基75-247(A1-Jaufy，InfectImmun62：956-60(1994))，在真核細胞內從頭表達的StxA截短僅需要至多殘基240以到達細胞質并且進行核糖體的催化失活(LaPointe，JBiolChem280：23310-18(2005))。在來源于SLT-1A(SEQIDNO：1)或StxA(SEQIDNO：2)的本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白的某些實施方案中，這些改變包括位置75處的天冬酰胺、位置77處的酪氨酸、位置114處的酪氨酸、位置167處的天冬氨酸、位置170處的精氨酸、位置176處的精氨酸的置換，和/或位置203處的色氨酸的置換。對于技術人員來說，基于現有技術，這種置換的實例將會是已知的，如位置75處的天冬酰胺變為丙氨酸、位置77處的酪氨酸變為絲氨酸、位置114處的酪氨酸變為絲氨酸的置換、位置167處的谷氨酰胺變為天冬氨酸的置換、位置170處的精氨酸變為丙氨酸的置換、位置176處的精氨酸變為賴氨酸的置換、和/或位置203處的色氨酸變為丙氨酸的置換。增強或減少志賀毒素的酶活性和/或細胞毒性的其他突變在本發明的范圍內，并且可以使用公知的技術和本文公開的測定來確定。本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白可以任選地與可以包括本領域中已知的治療劑和/或診斷劑(包括本文所述的此類試劑)的一種或多種另外的藥劑綴合。VI.去免疫化志賀毒素效應子區多肽或蛋白的產生、制備和純化本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和蛋白可以使用對本領域技術人員來說公知的生物化學工程技術生產。例如，本發明的志賀毒素效應子區多肽和蛋白可以通過標準合成方法、利用重組表達系統生產，或者通過任何其他適合的方法生產。因此，本發明的志賀毒素效應子區多肽和蛋白可以以多種方式合成，包括，例如包括下列各項的方法：(1)使用標準固相或液相方法、分步地或通過片段組裝來合成蛋白的多肽或多肽組分，并且將最終的肽化合物產物分離并純化；(2)在宿主細胞中表達編碼本發明的蛋白的多肽或多肽組分的多核苷酸并且從宿主細胞或宿主細胞培養物中回收表達產物；或(3)進行編碼本發明的蛋白的多肽或多肽組分的多核苷酸的無細胞體外表達，并且回收表達產物；或者通過方法(1)、(2)或(3)的任意組合以獲得肽組分的片段，隨后將片段結合(例如連接(ligating))以獲得肽組分，并且回收肽組分。可以優選通過固相或液相肽合成來合成去免疫化志賀毒素效應子區多肽或本發明的蛋白的多肽或多肽組分。本發明的志賀毒素效應子區多肽和蛋白可以適合地通過標準合成方法生產。因此，可以通過例如這樣的方法來合成肽，所述方法包括通過標準固相或液相方法、分步地或通過片段組裝來合成肽，并且將最終的肽產物分離并純化。在該情形中，可以參考WO1998/11125，或尤其是FieldsG等，PrinciplesandPracticeofSolid-PhasePeptideSynthesis(SyntheticPeptides，GrantG，ed.，OxfordUniversityPress，U.K.，第2版，2002)以及其中的合成實例。本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和蛋白可以使用在本領域內公知的重組技術制備(生產和純化)。通常，通過培養轉化或轉染有包含編碼多核苷酸的載體的宿主細胞并且從細胞培養物中回收多肽來制備多肽的方法被描述于，例如SambrookJ等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY，U.S.，1989)；DieffenbachC等，PCRPrimer：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，N.Y，U.S.，1995)。任何適合的宿主細胞均可以用于生產本發明的志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白。宿主細胞可以是用一種或多種驅動本發明的多肽表達的表達載體穩定或瞬時轉染、轉化、轉導或感染的細胞。此外，可以通過修飾編碼本發明的多肽或蛋白的多核苷酸來生產本發明的志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白，這導致改變一個或多個氨基酸或者缺失或插入一個或多個氨基酸，以便實現所需性質，如改變的細胞毒性、改變的細胞生長抑制作用、改變的免疫原性和/或改變的血清半衰期。存在寬泛種類的可以選擇用于生產本發明的蛋白的表達系統。例如，用于表達本發明的蛋白的宿主生物體包括原核生物，諸如大腸桿菌和芽胞枯草桿菌(B.subtilis)，真核細胞，諸如酵母和絲狀真菌(如釀酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(P.pastorts)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克魯維酵母(K.lactis))，藻類(如衣藻(C.reinhardtii))，昆蟲細胞系，哺乳動物細胞(如CHO細胞)，植物細胞系，和真核生物體，如轉基因植物(如擬南芥(A.thaliana)和本生煙草(N.benthamiana))。因此，本發明還提供用于根據以上所述方法并且使用下述來生產本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白的方法：編碼本發明的多肽或本發明的蛋白的多肽組分的部分或全部的多核苷酸，包含當被引入到適當的宿主細胞中時能夠編碼本發明的多肽的部分或全部的本發明的至少一種多核苷酸的表達載體，和/或包含本發明的多核苷酸或表達載體的宿主細胞。當使用重組技術在宿主細胞或無細胞系統中表達多肽或蛋白時，有利的是從其他組分如宿主細胞因子中分離(或純化)所需的多肽或蛋白，從而獲得高純度的或基本均質的制劑。純化可以通過在本領域內公知的方法完成，如離心技術，提取技術，層析和分餾技術(例如，通過凝膠過濾的尺寸分離、通過離子交換柱的電荷分離、疏水相互作用層析法、反相層析法、在二氧化硅或陽離子交換樹脂如DEAE等上的層析法、層析聚焦、和蛋白A瓊脂糖層析法，以用于去除污染物)，以及沉淀技術(例如乙醇沉淀或硫酸銨沉淀。任何數量的生物化學純化技術均可以用于增加本發明的志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白的純度。在某些實施方案中，本發明的多肽和蛋白可以任選地以同型多聚體形式(即，兩個以上相同的本發明的多肽或蛋白的蛋白復合物)純化。在以下實施例中的是對用于生產本發明的蛋白的方法的非限制性實例的描述，以及對本發明的示例性蛋白的制備的具體但非限制性的方面。VII.包含本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽或蛋白的藥物和診斷組合物本發明提供這樣的多肽和蛋白，其用于單獨地或在藥物組合物中與一種或多種另外的治療劑組合地用于治療或預防以下更詳細描述的病況、疾病、病癥、或癥狀(例如癌癥、惡性腫瘤、非惡性腫瘤、生長異常、免疫病癥和微生物感染)。本發明還提供藥物組合物，其包含本發明的多肽或蛋白或其根據本發明的藥用鹽或溶劑化物，以及至少一種藥用載體、賦形劑、或載體。在某些實施方案中，本發明的藥物組合物可以包含本發明的多肽或蛋白的同型多聚體和/或異型多聚體形式。所述藥物組合物將可用于治療、改善、或預防以下更詳細描述的疾病、病況、病癥、或癥狀的方法。預期各個這樣的疾病、病況、病癥、或癥狀均為就本發明所述的藥物組合物的用途而言的單獨的實施方案。本發明還提供用于至少一種如以下更詳細描述的本發明所述的治療方法的藥物組合物。如在本文中所使用的，術語“患者”和“受試者”可互換使用，以指代任何生物，通常是脊椎動物如人和動物，其表現出至少一種疾病、病癥、或病況的癥狀、征兆、和/或指征。這些術語包括哺乳動物如靈長類動物、家畜動物(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、寵物(例如貓、狗等)以及實驗動物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性實例。如在本文中所使用的，“治療(treat)”、“治療(treating)”、或“治療(treatment)”以及它們的語法變體是指用于獲得有益或所需的臨床結果的方法。該術語可以指延緩病況、病癥或疾病的發病或發展速度，減輕或緩解與其有關的癥狀，產生病況的全部或部分消退，或者以上任何的一些組合。對于本發明的目的來說，有益或所需的臨床結果包括，但不限于，無論是否是可檢測的或不可檢測的，癥狀的減輕或緩解、疾病程度降低、疾病狀態的穩定(例如不惡化)、疾病發展的推遲或延緩、疾病狀態的改善或緩和、以及康復(無論是部分的或全部的)。“治療(treat)”、“治療(treating)”、或“治療(treatment)”還可以意指相對于在不接受治療的情況下的預期存活時間延長存活。需要治療的受試者(例如人)因此可以是已經遭受所討論的疾病或病癥折磨的受試者。術語“治療(treat)”、“治療(treating)”、或“治療(treatment)”包括相對于不存在治療的情況抑制或減輕病理狀態或癥狀的嚴重性的增加，并且并非必須意指暗示相關疾病、病癥、或病況完全停止。關于腫瘤和/或癌癥，治療包括整體腫瘤負擔和/或個體腫瘤尺寸的減小。如在本文中所使用的，術語“防止(prevent)”、“預防(preventing)”、“預防(prevention)”以及它們的語法變體是指用于預防病患、疾病、或病癥的發展或者改變病患、疾病、或病癥的病理學的方法。因此，“預防”可以指預防或防止的措施。對于本發明的目的來說，有益或所需的臨床結果包括，但不限于，無論是否是可檢測的或不可檢測的，預防或延緩疾病的癥狀、進展或發展。需要預防的受試者(例如人)因此可以是尚未遭受所討論的疾病或病癥折磨的受試者。術語“預防”包括相對于不存在治療的情況延緩疾病的發病，并且并非必須意指暗示相關疾病、病癥、或病患的永久性預防。因此在某些情形中病患的“預防(preventing)”或“預防(prevention)”可以是指降低發展病患的風險，或者預防或推遲與該病患有關的癥狀的發展。如在本文中所使用的，“有效量”或“治療有效量”是在受試者中產生至少一種所需治療效果的組合物(例如治療組合物或藥劑)的量或劑量，如預防或治療目標病患或有益地緩解與該病患有關的癥狀。最合乎需要的治療有效量是將會產生由本領域技術人員為需要其的給定受試者選擇的具體治療的所需功效的量。這種量將會根據各種技術人員理解的因素變化，包括但不限于，治療性化合物的特性(包括活性、藥物動力學、藥效學、和生物利用度)，受試者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型、疾病階段、總體身體狀況、對給定劑量的響應性、和藥物的類型)，藥用載體或制劑中載體的性質，以及給藥途徑。臨床和藥理學技術的人員將能夠通過常規實驗確定治療有效量，即通過監測受試者對施用化合物的響應并且相應地調節劑量(參見，例如，Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(GennaroA，編，MackPublishingCo.，Easton，PA，U.S.，第19版，1995))。本發明的診斷組合物包含本發明的多肽或蛋白和一個或多個檢測促進劑。各種檢測促進劑是本領域已知的，諸如同位素、染料、比色測量劑、反差增強劑、熒光劑、生物發光劑和磁性劑。這些試劑可以在任何位置摻入本發明的多肽或蛋白中。所述試劑的摻入可以是通過所述細胞毒性蛋白的氨基酸殘基或通過本領域已知的一些連接類型，包括通過接頭和/或螯合劑。所述試劑的摻入是以這樣的方式：能夠在篩選、測定、診斷操作和/或成像技術中檢測診斷組合物的存在。當生產或制備本發明的診斷組合物時，本發明的蛋白可以直接地或間接地連接至一個或多個檢測促進劑。存在技術人員已知的眾多檢測促進劑，它們可以可操作地連接至本發明的多肽或蛋白用于信息收集方法，諸如用于針對生物體的疾病、病癥或病患的診斷和/或預后應用(參見例如CaiW等，JNuclMed48：304-10(2007)；NayakT，BrechbielM，BioconjugChem20：825-41(2009)；PaudyalP等，OncolRep22：115-9(2009)；QiaoJ等，PLoSONE6：e18103(2011)；SanoK等，BreastCancerRes14：R61(2012))。例如，檢測促進劑包括增強圖像的造影劑，諸如熒光染料(例如Alexa680、吲哚菁綠和Cy5.5)、同位素和放射性核素，諸如11C、13N、15O、18F、32P、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re和223R；順磁離子，諸如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)或鉺(III)；金屬，諸如鑭(III)、金(III)、鉛(II)和鉍(III)；超聲-反差增強劑，諸如脂質體；不透射線的試劑，諸如鋇、鎵和鉈化合物。通過使用中間官能團，諸如螯合劑如2-芐基DTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA、其類似物和前述任一種的功能等同物(參見LeytonJ等，ClinCancerRes14：7488-96(2008))，可以直接地或間接地摻入檢測促進劑。存在技術人員已知的用于將各種檢測促進劑摻入、附著和/或綴合至蛋白、特別是免疫球蛋白和免疫球蛋白來源的結構域的眾多標準技術(WuA，Methods65：139-47(2014))。類似地，存在技術人員已知的眾多成像方案，諸如在醫學領域中常用的非侵入性體內成像技術，例如：計算機體層攝影術成像(CT掃描)、光學成像(包括直接的、熒光的和生物發光的成像)、磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射計算機體層攝影術(SPECT)、超聲和x-射線計算機體層攝影術成像(關于綜述，參見KaurS等，CancerLett315：97-111(2012))。生產或制備包含本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽或蛋白的藥物和/或診斷組合物任何本發明的多肽和蛋白的藥用鹽或溶劑化物同樣也在本發明的范圍內。本發明情形中的術語“溶劑化物”是指在溶質(在本情況下，為根據本發明的多肽化合物或其藥用鹽)和溶劑之間形成的限定的化學計量的復合物。相關的溶劑可以是，例如，水、乙醇或另一種藥用的、通常為小分子有機物種，如，但不限于，乙酸或乳酸。當所討論的溶劑是水時，這種溶劑化物通常被稱為水合物。本發明的多肽和蛋白或其鹽可以被配制為為儲存或施用而制備的藥物組合物，所述藥物組合物通常包含在藥用載體中的治療有效量的本發明的化合物或其鹽。術語“藥用載體”包括任何標準藥物載體。用于治療用途的藥用載體是制藥領域中公知的，并且描述于例如Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.(A.Gennaro，編，1985)。如在本文中所使用的，“藥用載體”包括任何和所有生理學上可接受的，即相容的，溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑、等滲劑、和吸收延緩劑等。藥用載體或稀釋劑包括在適用于口服、直腸、鼻或腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內、皮內、和經皮)施用的制劑中使用的那些。示例性的藥用載體包括無菌水溶液或分散液和用于無菌可注射溶液或分散液的即時制備的無菌粉末。可以在本發明的藥物組合物中采用的適合的水性和非水載體的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它們的適合的混合物，植物油如橄欖油，以及可注射有機酯如油酸乙酯。例如，通過使用包衣材料如卵磷脂，通過維持分散液情況下所需的粒度，以及通過使用表面活性劑，可以維持適當的流動性。在某些實施方案中，載體適用于靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如通過注射或輸注)。根據所選擇的給藥途徑，可以將所述細胞毒性蛋白或其他藥物組分包衣在用于保護化合物免受當通過特定給藥途徑施用于患者時所述活性細胞毒性蛋白可能會遇到的低pH和其他天然失活條件的作用影響的物質中。本發明的藥物組合物的制劑可以以單位劑型方便地提供并且可以通過任何在藥學領域內公知的方法制備。以這種形式，將組合物分為含有適合量的活性組分的單位劑量。單位劑型可以是包裝的制劑，包裝含有離散量的制劑，例如，小包片劑、膠囊、和小藥瓶或安瓿瓶中的粉劑。單位劑型還可以是膠囊、扁膠囊(cachet)、或片劑本身，或者其可以是適合數量的這些包裝形式中的任何一種。其可以以單劑量可注射形式，例如以筆(pen)的形式提供。可以將組合物配制為用于任何適合的施用途徑和方式。皮下或經皮施用方式可以特別適用于在本文中所描述的治療性蛋白。本發明的藥物組合物還可以含有輔助劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過滅菌操作，以及通過包含多種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以確保防止存在微生物。組合物中的等滲劑，如糖類、氯化鈉等，也可以是合乎需要的。此外，通過包含延緩吸收的藥劑如單硬脂酸鋁和明膠，可以產生可注射藥物形式的延長的吸收。本發明的藥物組合物還任選地包含藥用抗氧化劑。示例性的藥用抗氧化劑是：水溶性抗氧化劑如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。在另一個方面中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明的不同的多肽和/或蛋白或任何前述各項的酯、鹽或酰胺中的一種或組合，以及至少一種藥用載體。治療性組合物在制造和儲存條件下通常是無菌和穩定的。組合物可以配制為溶液、微乳液、脂質體、或適合高藥物濃度的其他規則結構。載體可以是溶劑或分散介質，包括，例如，水、醇如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇)、或任何適合的混合物。例如，通過使用包衣如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒度，以及通過使用表面活性劑，根據本領域內公知的制劑化學，可以維持適當的流動性。在某些實施方案中，等滲劑，例如糖類，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉可以是在組合物中合乎需要的。可以通過在組合物中包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來產生可注射組合物的延長吸收。用于皮內或皮下施用的溶液或懸浮液通常包括下列各項中的一種或多種：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、非發揮性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如芐醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及張力(tonicity)調節劑如，例如，氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或堿，如鹽酸或氫氧化鈉，或者具有檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等的緩沖液調節pH。此類制劑可以封裝在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小藥瓶中。通過以所需的量將本發明的多肽或蛋白以及上述成分中的一種或組合加入適合的溶劑中，當需要時，繼之以進行滅菌微過濾，可以制備無菌可注射溶液。通過將活性化合物加入至含有分散介質和其他成分(如上述那些)的無菌賦型劑中，可以制備分散液。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其產生活性成分以及來自其無菌過濾溶液的任何另外的所需成分的粉末。當將治療有效量的本發明的多肽或蛋白設計為通過例如靜脈內、皮膚或皮下注射來施用時，粘合劑將會是無熱原、腸胃外可接受的水溶液的形式。考慮到適合的pH、等滲性、穩定性等，用于制備腸胃外可接受的蛋白質溶液的方法屬于本領域技術。除了粘合劑之外，用于靜脈內、皮膚、或皮下注射的優選的藥物組合物將含有等滲賦型劑，如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer′sinjection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸林格氏注射液、或在本領域中已知的其他賦型劑。本發明的藥物組合物還可以含有穩定劑、防腐劑、緩沖液、抗氧化劑、或對本領域技術人員來說公知的其他添加劑。如在本文中其他地方描述的，本發明的多肽或蛋白或其組合物可以用保護化合物免于快速釋放的載體來制備，如受控釋放制劑，包括植入物、經皮貼劑、和微囊化遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。許多用于制備這種制劑的方法被授予了專利或是本領域技術人員通常已知的(參見，例如，SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems(RobinsonJ，編，MarcelDekker，Inc.，NY，U.S.，1978))。在某些實施方案中，可以將本發明的藥物組合物配制成確保在體內的所需分布。例如，血腦屏障排除許多大型和/或親水性化合物。為了將本發明的治療性化合物或組合物靶向至特定的體內位置，例如，可以將它們配制在可以包含被選擇性地運輸至特定細胞或器官的一個或多個結構部分的脂質體中，從而增強靶向藥物遞送。示例性的靶向結構部分包括葉酸或生物素；甘露糖苷；抗體；表面活性劑蛋白A受體；p120聯蛋白等。藥物組合物包括被設計成用作植入物或微粒系統的胃腸外制劑。植入物的例子是由聚合的或疏水的組分(諸如乳劑、離子交換樹脂和可溶性的鹽溶液)組成的貯庫制劑。微粒系統的例子是微球、微粒、納米膠囊、納米球和納米顆粒(參見例如HondaM等，IntJNanomedicine8：495-503(2013)；SharmaA等，BiomedResInt2013：960821(2013)；RamishettiS，HuangL，TherDeliv3：1429-45(2012))。使用對離子敏感的聚合物，諸如，例如，脂質體、泊洛沙姆407和羥磷灰石，可以制備控釋制劑。VIII.多核苷酸、表達載體和宿主細胞除了本發明的多肽和蛋白以外，編碼本發明的多肽和蛋白或其功能部分的多核苷酸也在本發明的范圍內。術語“多核苷酸”是術語“核酸”的等同物，二者均包括脫氧核糖核酸(DNAs)的聚合物、核糖核酸(RNAs)的聚合物、利用核苷酸類似物產生的這些DNA或RNA的類似物、以及它們的衍生物、片段和同系物。本發明的多核苷酸可以是單鏈的、雙鏈的或三鏈的。例如，考慮RNA密碼子的第三位中可容忍的但是作為不同的RNA密碼子編碼相同氨基酸的擺動性(wobble)(參見StothardP，Biotechniques28：1102-4(2000))，公開的多核苷酸被具體公開為包括所有能夠編碼示例性細胞毒性蛋白的多核苷酸。在一個方面中，本發明提供編碼本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可以包括，例如，編碼與包含所述蛋白的氨基酸序列中的一個的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上的同一性的多肽的核酸序列。本發明還包括包含與編碼本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸在嚴格條件下雜交的核苷酸序列，或者任何這種序列的反義序列或互補序列的多核苷酸。本發明的多核苷酸(或去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白)的衍生物或類似物包括，尤其是，具有與本發明的多核苷酸、去免疫化志賀毒素效應子區多肽或蛋白基本同源的區域的多核苷酸(或多肽)分子，例如與相同尺寸的多核苷酸或多肽序列相比，或者當與比對的序列(其中所述比對由本領域中已知的計算機同源性程序進行)相比時，至少約45％、50％、70％、80％、95％、98％、或甚至99％的同一性(并且優選的同一性為80-99％)。示例性的程序是使用默認設置的GAP程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage，Version8forUNIX，GeneticsComputerGroup，UniversityResearchPark，Madison，WI，U.S.)，其使用SmithT，WatermanM，Adv.Appl.Math.2：482-9(1981)的算法。還包括能夠與編碼本發明的蛋白的序列的互補序列在嚴格條件下雜交的多核苷酸(參見例如AusubelF等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons，NewYork，NY，U.S.，1993))，以及以下。嚴格條件是本領域技術人員已知的并且可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons，NY，U.S.，Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。本發明還提供包含本發明范圍內的多核苷酸的表達載體。可以使用本領域內公知的材料和方法將能夠編碼本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白的多核苷酸插入至包括細菌質粒、病毒載體和噬菌體載體在內的已知載體中以產生表達載體。這種表達載體將包括支持在任何選擇的宿主細胞或無細胞表達系統(例如以下實施例中描述的pTxb1和pIVEX2.3)中產生預期的本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白所需的多核苷酸。用于與特定類型的宿主細胞或無細胞表達系統一起使用的包含具體的多核苷酸的表達載體對本領域普通技術人員來說是公知的，可以是使用常規實驗確定的，或者可以是購買的。如在本文中所使用的，術語“表達載體”是指包含一個或多個表達單元的線性或環形的多核苷酸。術語“表達單元”表示編碼目標多肽并且能夠提供核酸區段在宿主細胞中的表達的多核苷酸區段。表達單元通常包含均處于可操作構型的轉錄啟動子、編碼目標多肽的開放閱讀框、和轉錄終止子。表達載體含有一個或多個表達單元。因此，在本發明上下文中，編碼包含單個多肽鏈(例如具有志賀毒素效應子區的遺傳重組的scFv)的志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白的表達載體至少包括用于該單個多肽鏈的表達單元，而編碼包含例如兩個以上多肽鏈(例如與毒素效應子區連接的包含VL結構域的一條鏈和包含VH結構域的第二鏈)的蛋白包括至少兩個表達單元，各自用于所述蛋白的兩條多肽鏈中的每一個。對于本發明的多鏈蛋白的表達，用于每條多肽鏈的表達單元還可以單獨地包含在不同的表達載體中(例如，可以利用已經向其中引入用于每條多肽鏈的表達載體的單一宿主細胞實現表達)。能夠引導多肽和蛋白的瞬時或穩定表達的表達載體是在本領域內公知的。表達載體通常包括，但不限于下列各項中的一種或多種：異源信號序列或肽、復制起點、一個或多個標志基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列，其中的每一個均為在本領域內公知的。任選的調節控制序列、整合序列、和可以采用的可用標記物是在本領域中已知的。術語“宿主細胞”是指可以支持表達載體的復制或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞，如大腸桿菌，或者真核細胞(例如酵母、昆蟲、兩棲動物、鳥類、或哺乳動物細胞)。可以使用在本領域中已知的標準技術來實現包含本發明的多核苷酸或能夠產生本發明的多肽和/或蛋白的宿主細胞系的創建和分離。在本發明的范圍內的去免疫化志賀毒素效應子區多肽和/或蛋白可以是在本文中所描述的多肽和蛋白的變體或衍生物，其是這樣產生的：通過改變一個或多個氨基酸或者缺失或插入一個或多個氨基酸來修飾編碼多肽和/或蛋白的多核苷酸以可以使其更適用于實現所需性質，如通過宿主細胞的更優的表達。IX.遞送裝置和試劑盒在某些實施方案中，本發明涉及一種裝置，其包含用于遞送給受試者的本發明的物質的一種或多種組合物，諸如藥物組合物。因而，包含本發明的一種或多種化合物的遞送裝置可以用于通過多種遞送方法給患者施用本發明的物質的組合物，所述遞送方法包括：靜脈內、皮下、肌肉內或腹膜內注射；口服施用；透皮施用；肺或透粘膜施用；通過植入物、滲透泵、筒或微量泵施用；或通過本領域技術人員公知的其它方式。試劑盒也在本發明范圍內，所述試劑盒包含本發明的物質的至少一種組合物和任選的包裝和使用說明書。試劑盒可用于藥物施用和/或診斷信息收集。本發明的試劑盒可以任選地包含至少一種另外的試劑(例如，標準品、標志物等)。試劑盒典型地包括標簽，所述標簽指示試劑盒的內容物的預期用途。所述試劑盒還可以包含用于檢測在樣品中或在受試者中的細胞類型(例如腫瘤細胞)或用于診斷患者是否屬于對利用如本文中所述的本發明的化合物、組合物或有關方法的治療策略做出應答的群體的試劑和其它工具。X.使用去免疫化志賀毒素效應子區多肽或蛋白或其藥物組合物和/或診斷組合物的方法通常，本發明的一個目的是提供藥理學上有活性的試劑、以及包含它們的組合物，它們可以用于預防和/或治療疾病、病癥和病患，諸如某些癌癥、腫瘤、生長異常、免疫病癥、或在本文中提及的其它病理學狀況。因此，本發明提供了使用本發明的多肽、蛋白和藥物組合物的方法，其用于靶向殺傷細胞，用于將另外的外源物質遞送進被靶向的細胞中，用于標記被靶向的細胞的內部，用于收集診斷信息，和用于治療如本文中所述的疾病、病癥和病患。具體地，本發明的一個目的是提供這樣的藥理學上有活性的試劑、組合物和/或方法，其與本領域目前已知的試劑、組合物和/或方法相比具有某些優點。因此，本發明提供了使用具有特定的多肽序列的多肽和蛋白及其藥物組合物的方法。例如，在SEQIDNO：4-59中的任一個多肽序列可以具體地用作在下述方法中使用的蛋白的組分。本發明提供了殺傷細胞的方法，所述方法包括下述步驟：使體外或體內細胞與本發明的多肽、蛋白或藥物組合物接觸。在使一個或多個細胞與要求保護的物質的組合物之一接觸以后，本發明的多肽、蛋白和藥物組合物可以用于殺傷特定細胞類型。在某些實施方案中，本發明的細胞毒性多肽、蛋白或藥物組合物可以用于殺傷不同細胞類型的混合物中的特定細胞類型，諸如包含癌細胞、受感染的細胞和/或血液細胞的混合物。在某些實施方案中，本發明的細胞毒性多肽、蛋白或藥物組合物可以用于殺傷不同細胞類型的混合物中的癌細胞。在某些實施方案中，本發明的細胞毒性多肽、蛋白或藥物組合物可以用于殺傷不同細胞類型的混合物中的特定細胞類型，諸如移植前組織。在某些實施方案中，本發明的多肽、蛋白或藥物組合物可以用于殺傷細胞類型的混合物中的特定細胞類型，諸如用于治療目的的施用前組織材料。在某些實施方案中，本發明的多肽、蛋白或藥物組合物可以用于選擇性地殺傷被病毒或微生物感染的細胞，或以其它方式選擇性地殺傷表達特定細胞外靶標生物分子(諸如細胞表面生物分子)的細胞。本發明的多肽、蛋白和藥物組合物具有多種應用，包括，例如，用于從體外或體內組織除去不希望的細胞類型，用于調節免疫應答以治療移植物抗宿主病，用作抗病毒劑，用作抗寄生蟲劑，和用于凈化移植組織的不希望的細胞類型。在某些實施方案中，當施用給受試者中(諸如需要治療的患者中)的體外或體內細胞群體時，本發明的細胞毒性多肽、蛋白或藥物組合物(單獨地或與其它化合物或藥物組合物組合地)可以表現出有效的細胞殺傷活性。通過使用高親和力結合區使酶活性志賀毒素區域的遞送靶向特定的細胞型，可以將該有效的細胞殺傷活性限于特異性地和選擇性地殺傷生物體內的特定細胞類型，諸如某些癌細胞、贅生性細胞、惡性細胞、非惡性腫瘤細胞或受感染的細胞。本發明提供了一種殺傷有此需要的患者中的細胞的方法，所述方法包括下述步驟：給所述患者施用至少一種本發明的細胞毒性多肽或蛋白或其藥物組合物。本發明的細胞毒性多肽、蛋白或其藥物組合物的某些實施方案可以用于通過靶向被發現與癌癥或腫瘤細胞物理上關聯的細胞外生物分子而殺傷患者中的癌細胞。術語“癌細胞”或“癌性細胞”表示以異常加速的方式生長和分裂的各種贅生性細胞，且是技術人員顯而易見的。術語“腫瘤細胞”包括惡性的和非惡性的細胞。通常，癌癥和/或腫瘤可以定義為適合治療和/或預防的疾病、病癥或病患。由癌細胞和/或腫瘤細胞構成的癌癥和腫瘤(惡性的或非惡性的)是技術人員顯而易見的。贅生性細胞經常與以下一種或多種相關：失調的生長、分化的缺失、局部組織侵入、血管生成和轉移。本發明的細胞毒性多肽或蛋白或其藥物組合物的某些實施方案可以用于通過靶向被發現與免疫細胞物理上關聯的細胞外生物分子而殺傷患者中的免疫細胞(無論是健康的還是惡性的)。本發明的細胞毒性多肽或蛋白或其藥物組合物的某些實施方案可以用于通過靶向被發現與受感染的細胞物理上關聯的細胞外生物分子而殺傷患者中受感染的細胞。為了以下目的利用本發明的蛋白或其藥物組合物是在本發明范圍內：凈化患者細胞群體(例如骨髓)的被感染的、惡性的、腫瘤性的、或在其它方面不希望的T-細胞和/或B-細胞，然后將除去了T-細胞和/或B-細胞的物質重新輸入患者中(參見例如，vanHeeckerenW等，BrJHaematol132：42-55(2006)；(參見例如，AlpdoganO，vandenBrinkM，SeminOncol39：629-42(2012))。為了以下目的利用本發明的蛋白或其藥物組合物是在本發明范圍內：從取自患者的分離的細胞群體離體除去T細胞和/或B細胞。在一個非限制性實施例中，本發明的蛋白可以用在用于預防器官和/或組織移植排斥的方法中，其中在移植之前用本發明的細胞毒性蛋白或其藥物組合物灌注供體器官或組織，以便凈化器官的不需要的供體T-細胞和/或B-細胞(參見例如AlpdoganO，vandenBrinkM，SeminOncol39：629-42(2012))。為了以下目的利用本發明的蛋白或其藥物組合物也是在本發明范圍內：從供體細胞群體除去T-細胞和/或B-細胞作為要接受骨髓和/或干細胞移植的患者中針對移植物抗宿主病和耐受性誘導的預防(參見例如，vanHeeckerenW等，BrJHaematol132：42-55(2006)；(參見例如，AlpdoganO，vandenBrinkM，SeminOncol39：629-42(2012))。本發明的細胞毒性多肽或蛋白或其藥物組合物的某些實施方案可以用于通過靶向被發現與受感染的細胞物理上關聯的細胞外生物分子而殺傷患者中受感染的細胞。另外，本發明提供了治療患者中疾病、病癥或病患的方法，所述方法包括下述步驟：給有此需要的患者施用治療有效量的至少一種本發明的細胞毒性多肽或蛋白或其藥物組合物。可以使用該方法治療的預見到的疾病、病癥和病患包括癌癥、惡性腫瘤、非惡性腫瘤、生長異常、免疫病癥和微生物感染。“治療上有效劑量”的本發明的化合物的施用可以導致疾病癥狀的嚴重程度的降低，無疾病癥狀階段的頻率和持續時間的增加，或由疾病折磨而導致的損害或殘疾的預防。本發明的化合物的治療有效量將取決于施用途徑、所治療的哺乳動物的類型、和在考慮中的特定患者的體格特征。這些因素以及它們與確定這種量的關系是醫學領域的技術從業人員眾所周知的。這種量和施用方法可以進行調節以實現最佳效力，并且可以取決于醫學領域的技術人員眾所周知的因素，如重量、飲食、并存的藥物和其它因素。最適用于人類用途的劑量大小和定量施用方案可以由通過本發明得到的結果指導，并且可以在適當地設計的臨床試驗中確認。通過常規方式，在實驗動物中以低劑量開始并且然后在監測效果的同時增加劑量、以及系統性地改變給藥方案，可以確定有效劑量和治療方案。當為給定受試者確定最佳劑量時，臨床醫師可以考慮許多因素。這樣的考慮因素是技術人員已知的。可接受的施用途徑可以表示在本領域中已知的任何施用途徑，包括但不限于氣霧劑、腸內、鼻、眼、口服、腸胃外、直腸、陰道或透皮(例如，乳膏、凝膠或軟膏的局部施用，或借助于透皮貼劑)。“腸胃外施用”典型地與在預期作用部位處的注射有關或與預期作用部位連通，包括眶下、輸注、動脈內、囊內、心內、真皮內、肌肉內、腹膜內、肺內、椎管內、胸骨內、鞘內、子宮內、靜脈內、蛛網膜下、囊下、皮下、透粘膜或經氣管施用。關于本發明的藥物組合物的施用，劑量范圍通常將為約0.0001-100毫克/千克(mg/kg)宿主體重，并且更通常為0.01-5mg/kg宿主體重。示例性劑量可以是0.25mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg的范圍內。一個示例性的治療方案是每天一次或兩次施用，或每周一次或兩次施用，每兩周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每兩個月或三個月一次或者每三至六個月一次。劑量可以由熟練的健康護理專業人員根據需要選擇并重新調節以使對于特定患者而言的治療益處最大化。本發明的藥物組合物典型地將會在多種情形下施用給相同患者。單次劑量之間的間隔可以是，例如，2-5天、每周、每月、每兩個月或三個月、每六個月、或每年。基于調節受試者或患者中的血液水平或其它標志物，施用之間的間隔也可以是不規律的。本發明的化合物的劑量方案包括1mg/kg體重或3mg/kg體重的靜脈內施用，其中將化合物每兩至四周施用一次達六個劑量，然后以3mg/kg體重或1mg/kg體重每三個月施用一次。使用本領域已知的多種方法中的一種或多種，可以經由一種或多種施用途徑施用本發明的藥物組合物。如技術人員將會理解的，施用的途徑和/或模式將會根據期望的結果而變化。本發明的多肽、蛋白和其藥物組合物的施用途徑包括，例如靜脈內、肌肉內、真皮內、腹膜內、皮下、脊柱或其它腸胃外施用途徑，例如，通過注射或輸注。在其它實施方案中，本發明的多肽、蛋白或藥物組合物可以通過非腸胃外途徑施用，諸如局部、表皮或粘膜施用途徑，例如，鼻內地、口服地、陰道地、直腸地、舌下地或局部地。利用本領域已知的多種醫療裝置中的一種或多種，可以施用本發明的治療性多肽、蛋白或藥物組合物。例如，在一個實施方案中，可以利用無針皮下注射裝置施用本發明的藥物組合物。在本領域中具有可用于本發明的眾所周知的植入物和模塊的例子，包括例如，用于受控速率遞送的可植入微量輸液泵；用于穿過皮膚施用的裝置；用于以精確的輸注速率遞送的輸液泵；用于連續藥物遞送的可變流可植入輸注裝置；以及滲透藥物遞送系統。這些和其它這樣的植入物、遞送系統、和模塊是本領域技術人員已知的。本發明的多肽、蛋白或藥物組合物可以單獨施用或者與一種或多種其它治療劑或診斷劑聯合施用。聯合治療可以包括與至少一種其它治療劑組合的本發明的細胞毒性蛋白或其藥物組合物，所述其它治療劑基于待治療的特定患者、疾病或病患而選擇。其它這樣的藥劑的例子包括，尤其是，細胞毒性的抗癌劑或化學治療劑、抗炎或抗增殖劑、抗微生物或抗病毒劑、生長因子、細胞因子、鎮痛藥、治療活性的小分子或多肽、單鏈抗體、經典抗體或其片段、或調節一個或多個信號傳導途徑的核酸分子、以及在治療性或預防性處理方案中互補的或在其它方面有益的類似調節治療劑。用本發明的多肽、蛋白或藥物組合物對患者的治療優選地導致被靶向的細胞的細胞死亡和/或被靶向的細胞的生長抑制。這樣，本發明的細胞毒性蛋白和包含它們的藥物組合物將可用在治療多種病理學病癥(其中殺傷或除去靶細胞可能是有益的，例如尤其是癌癥、腫瘤、其他生長異常、免疫病癥和受感染的細胞)的方法中。本發明提供了用于抑制細胞增殖和治療細胞病癥(包括瘤形成、過度活躍的B-細胞和過度活躍的T-細胞)的方法。在某些實施方案中，本發明的多肽、蛋白和藥物組合物可以用于治療或預防癌癥、腫瘤(惡性的和非惡性的)、生長異常、免疫病癥和微生物感染。在另一個方面，以上離體方法可以與以上體內方法組合以提供治療或預防骨髓移植接受者中的排斥的方法和用于實現免疫耐受的方法。在某些實施方案中，本發明提供了治療哺乳動物受試者(諸如人)中的惡性病或腫瘤和其它血細胞相關癌癥的方法，所述方法包括下述步驟：給有此需要的受試者施用治療有效量的本發明的細胞毒性蛋白或藥物組合物。本發明的細胞毒性多肽、蛋白和藥物組合物具有多種用途，包括，例如，用于除去不希望的T-細胞，用于調節免疫應答以治療移植物抗宿主病，用作抗病毒劑，用作抗微生物劑，和用于凈化移植組織的不希望的細胞類型。本發明的細胞毒性多肽、蛋白和藥物組合物通常是抗腫瘤劑——意味著它們能夠通過抑制癌癥或腫瘤細胞的生長和/或造成癌癥或腫瘤細胞的死亡而治療和/或預防腫瘤或惡性細胞的發育、成熟或傳播。在某些實施方案中，本發明的多肽、蛋白或藥物組合物用于治療B-細胞-、漿細胞-或抗體-介導的疾病或病癥，諸如例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、人免疫缺陷病毒相關的淋巴瘤、淀粉樣變性、溶血性尿毒性綜合征、多動脈炎、膿毒性休克、克羅恩病、類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、銀屑病關節炎、潰瘍性結腸炎、銀屑病、哮喘、舍格倫綜合征、移植物抗宿主病、移植排斥、糖尿病、血管炎、硬皮病和系統性紅斑狼瘡。在另一個方面，本發明的多肽、蛋白和藥物組合物的某些實施方案是抗微生物劑——意味著它們能夠治療和/或預防微生物致病感染(諸如由病毒、細菌、真菌、朊病毒或原生動物造成)的獲得、發展或后果。提供對由T-細胞和/或B-細胞介導的疾病或病患的預防或治療的方法在本發明的范圍內，所述預防或治療包括向由此需要的患者施用本發明的細胞毒性蛋白或其藥物組合物，用于殺傷所述患者中的T-細胞或B-細胞的目的。該用法與準備或調理患者用于骨髓移植、干細胞移植、組織移植或器官移植相容，而無論移植的物質的來源，例如人或非人來源。提供通過用本發明的細胞毒性多肽、蛋白或藥物組合物對宿主T細胞的靶向性細胞殺傷而用于預防或治療宿主抗移植物病的骨髓接受體在本發明的范圍內。本發明的細胞毒性多肽、蛋白和藥物組合物可以用在治療癌癥的方法中，所述方法包括：給有此需要的患者施用治療有效量的本發明的細胞毒性多肽、蛋白或藥物組合物。在本發明的方法的某些實施方案中，正在治療的癌癥選自由下述組成的組：骨癌(諸如多發性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中樞/周圍神經系統癌癥(諸如腦癌、神經纖維瘤病或膠質母細胞瘤)、胃腸癌(諸如胃癌或結直腸癌)、生殖細胞癌(諸如卵巢癌和睪丸癌、腺癌(諸如胰腺癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、唾液腺癌或甲狀腺癌)、頭頸癌(諸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液學癌癥(諸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、腎-尿道癌(諸如腎癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(諸如間皮瘤、小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(諸如血管肉瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮膚癌(諸如基底細胞癌、鱗狀細胞癌或黑素瘤)和子宮癌。本發明的多肽、蛋白和藥物組合物可以用在治療免疫病癥的方法中，所述方法包括：給有此需要的患者施用治療有效量的本發明的細胞毒性蛋白或藥物組合物。在本發明的方法的某些實施方案中，所述免疫病癥與炎癥有關，所述炎癥與選自由以下組成的組的疾病有關：淀粉樣變性、強直性脊柱炎、哮喘、克羅恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、橋本甲狀腺炎、溶血性尿毒性綜合征、HIV相關的疾病、紅斑狼瘡、多發性硬化、多動脈炎、銀屑病、銀屑病關節炎、類風濕性關節炎、硬皮病、膿毒性休克、舍格倫綜合征、潰瘍性結腸炎和血管炎。在本發明的某些實施方案中是使用本發明的多肽或蛋白作為藥物組合物或藥物的組分，所述藥物組合物或藥物用于治療或預防癌癥、腫瘤、其他生長異常、免疫病癥和/或微生物感染。例如，可以用這樣的藥物治療在患者的皮膚上呈現的免疫病癥，以嘗試減少炎癥，。在另一個實施例中，可以用這樣的藥物治療皮膚腫瘤，以嘗試減小腫瘤大小或完全消除腫瘤。有益的臨床作用可以通過這樣的治療方案獲得：所述治療方案涉及向同一名受試者相繼施用多種本發明的細胞毒性蛋白，其中，每種細胞毒性蛋白包含在不同區域去免疫化的志賀毒素效應子區，以避免或減少發展針對來自涉及相同治療劑的連續施用的治療方案的單種細胞毒性蛋白的持久的免疫應答。本發明的某些細胞毒性多肽、蛋白和藥物組合物可以用在分子神經外科應用中，諸如免疫損傷(immunolesioning)和神經元示蹤(關于綜述，參見WileyR，LappiD，AdvDrugDelivRev55：1043-54(2003))。例如，可以從各種配體(諸如神經遞質和神經肽)選擇或衍生出靶向結構域，其通過結合神經元表面受體(諸如神經元回路特異性的G-蛋白連接的受體)而靶向特定神經元細胞類型。類似地，所述靶向結構域可以選自或源自結合神經元表面受體的抗體。因為志賀毒素穩健地指導它們自身的逆向軸突運輸，本發明的某些細胞毒性蛋白可以用于殺傷在遠離細胞體的細胞毒性蛋白注射部位處表達所述細胞外靶標的神經元(參見Llewellyn-SmithI等，JNeurosciMethods103：83-90(2000))。這些神經元細胞類型特異性的靶向細胞毒性多肽和蛋白用在神經科學研究中，諸如用于闡明感覺的機制(參見例如MishraS，HoonM，Science340：968-71(2013))，和建立神經變性疾病(諸如帕金森病和阿爾茨海默病)的模型系統(參見例如HamlinA等，PLoSOnee53472(2013))。在本發明的某些實施方案中是使用本發明的多肽、蛋白、藥物組合物和/或診斷組合物標記或檢測贅生性細胞和/或免疫細胞型的內部的方法。基于本發明的某些多肽、蛋白和藥物組合物進入特定細胞類型并通過逆向細胞內運輸在細胞內按路線發送的能力，特定細胞類型的內部區室被標記以用于檢測。這可以在患者內在原位細胞上執行，或在從生物體取出的細胞和組織(例如活組織檢查材料)上執行。為了關于疾病、病患和/或病癥的信息收集的目的，在本發明的某些實施方案中是使用本發明的多肽、蛋白、藥物組合物和/或診斷組合物檢測細胞類型的存在的方法。所述方法包括使細胞與診斷足夠量的細胞毒性分子接觸以通過測定或診斷技術檢測所述細胞毒性分子。短語“診斷足夠量”表示為了信息收集目的通過利用的特定測定或診斷技術提供充分檢測和準確測量的量。通常，對于完整生物體內診斷應用而言，診斷足夠量是每位受試者在0.1mg至100mg本發明的檢測促進劑連接的蛋白/千克受試者之間的非累積劑量。典型地，在這些信息收集方法中使用的本發明的多肽或蛋白的量將盡可能地低，前提條件是，它仍然是診斷足夠量。例如，對于在生物體中的體內檢測，施用給受試者的本發明的多肽、蛋白或藥物組合物的量將可行地盡可能地低。與檢測促進劑組合的本發明的多肽和蛋白的細胞型特異性的靶向提供檢測細胞并獲取其圖像的方式，所述細胞與本發明的分子的結合區的細胞外靶標生物分子物理上關聯。使用本發明的多肽或蛋白對細胞的成像可以通過本領域已知的任意合適的技術在體外或在體內執行。使用本領域已知的各種方法，包括生物體的全身成像或使用取自生物體的離體樣品，可以收集診斷信息。本文中使用的術語樣品表示任意數目的物品，但不限于，流體諸如血液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛門分泌物、陰道分泌物和精液，以及通過活組織檢查操作得到的組織。例如，通過技術諸如磁共振成像(MRI)、光學方法(諸如直接的、熒光的和生物發光的成像)、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射計算機體層攝影術(SPECT)、超聲、x-射線計算機體層攝影術和前述技術的組合，多種檢測促進劑可以用于非侵入性體內腫瘤成像(關于綜述，參見KaurS等，CancerLett315：97-111(2012))。在本發明的某些實施方案中是使用本發明的多肽、蛋白或藥物組合物作為診斷組合物來標記或檢測癌癥、腫瘤和/或免疫細胞型的內部的方法(例如，參見KoyamaY等，ClinCancerRes13：2936-45(2007)；OgawaM等，CancerRes69：1268-72(2009)；YangL等，Small5：235-43(2009))。基于本發明的某些多肽、蛋白和藥物組合物進入特定細胞類型并通過逆向細胞內運輸在細胞內按路線發送的能力，特定細胞類型的內部區室被標記用于檢測。這可以在患者內在原位細胞上執行，或在從生物體取出的細胞和組織(例如活組織檢查材料)上執行。本發明的診斷組合物可以用于將疾病、病癥或病患表征為本發明的有關藥物組合物潛在地可治療的。本發明的物質的某些組合物可以用于確定患者是否屬于對利用如本文中所述的本發明的化合物、組合物或有關方法的治療策略做出應答或非常適合使用本發明的遞送裝置的組。可以在檢測出疾病(例如癌癥)以后使用本發明的診斷組合物，以便更好地表征它，諸如以監測遠距離轉移、異質性和癌癥進展階段。疾病病癥或感染的表型評估可以幫助在做出治療決策的過程中的預后和預測。在疾病復發中，本發明的某些方法可以用于確定是局部還是全身問題。本發明的診斷組合物可以用于評估對治療劑的應答，無論治療劑的類型，例如小分子藥物、生物藥物或基于細胞的療法。例如，本發明的診斷的某些實施方案可以用于測量腫瘤大小的變化、抗原陽性細胞群體(包括數目和分布)的變化、或監測已經施用給患者的療法所靶向的抗原以外的標志物(參見Smith-JonesP等，Nat.Biotechnol22：701-6(2004)；EvansM等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108：9578-82(2011))。用于檢測細胞型的存在的方法的某些實施方案可以用于收集關于疾病、病癥和病患的信息，所述疾病、病癥和病患諸如，例如，骨癌(諸如多發性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中樞/周圍神經系統癌癥(諸如腦癌、神經纖維瘤病或膠質母細胞瘤)、胃腸癌(諸如胃癌或結直腸癌)、生殖細胞癌(諸如卵巢癌和睪丸癌、腺癌(諸如胰腺癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、唾液腺癌或甲狀腺癌)、頭頸癌(諸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液學癌癥(諸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、腎-尿道癌(諸如腎癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(諸如間皮瘤、小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(諸如血管肉瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮膚癌(諸如基底細胞癌、鱗狀細胞癌或黑素瘤)、子宮癌、AIDS、淀粉樣變性、強直性脊柱炎、哮喘、孤獨癥、心臟發生(cardiogenesis)、克羅恩病、糖尿病、紅斑(erythematosus)、胃炎、移植物排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病(Grave’sdisease)、橋本甲狀腺炎、溶血性尿毒癥綜合征、HIV-相關的疾病、紅斑狼瘡、淋巴增生性障礙(lymphoproliferativedisorders)、多發性硬化、重癥肌無力、神經炎癥、多動脈炎、銀屑病、銀屑病關節炎、類風濕性關節炎、硬皮病、膿毒性休克、舍格倫綜合征、系統性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus)、潰瘍性結腸炎、血管炎、細胞增殖、炎癥、白細胞激活、白細胞粘附、白細胞趨化性、白細胞成熟、白細胞遷移、神經元分化、急性淋巴母細胞白血病(acutelymphoblasticleukemia)(ALL)、T急性淋巴細胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓性白血病、急性髓樣白血病(acutemyeloidleukemia)(AML)、B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)、B細胞幼淋巴細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)(BL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML-BP)、慢性髓樣白血病(CML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡型淋巴瘤(follicularlymphoma)、毛細胞白血病(hairycellleukemia)(HCL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'sLymphoma)(HL)、血管內大B細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病(lymphomatoidgranulomatosis)、淋巴質漿細胞淋巴瘤(lymphoplasmacyticlymphoma)、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、多發性骨髓瘤(MM)、天然殺傷細胞白血病、結節邊緣B細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、漿細胞白血病、漿細胞瘤(plasmacytoma)、原發性滲出性淋巴瘤(primaryeffusionlymphoma)、幼淋巴細胞白血病(pro-lymphocyticleukemia)、早幼粒細胞性白血病(promyelocyticleukemia)、小淋巴細胞淋巴瘤、脾邊緣帶淋巴瘤(splenicmarginalzonelymphoma)、T-細胞淋巴瘤(TCL)、重鏈疾病(heavychaindisease)、單克隆丙種球蛋白病(monoclonalgammopathy)、單克隆免疫球蛋白沉積病、骨髓增生異常綜合征(myelodusplasticsyndromes)(MDS)、郁積型多發性骨髓瘤(smolderingmultiplemyeloma)和Waldenstrom巨球蛋白血癥(Waldenstrommacroglobulinemia)。在某些實施方案中，本發明的多肽和蛋白或其藥物組合物用于診斷和治療二者，或僅用于診斷。本發明的多肽具有作為免疫物質用于引發針對特定表位的免疫應答的應用，所述應用基于在所選表位區中的一個或多個破壞。本發明的多肽可以用作免疫物質用于施用給哺乳動物和/或用在展示篩選中以產生識別志賀毒素的免疫球蛋白結構域。下述選擇性的細胞毒性蛋白的非限制性實施例進一步舉例說明了本發明，所述選擇性的細胞毒性蛋白包含來源于志賀毒素家族成員的A亞基的去免疫化志賀毒素效應子區和能夠結合與特定細胞型物理連接的細胞外靶標生物分子的結合區。實施例以下實施例證實了本發明的某些實施方案。但是，應當理解，這些實施例僅僅用于解釋目的，且不意圖、也不應當解釋為對本發明的條件和范圍的一概限制。除了另外詳細描述以外，使用本領域技術人員眾所周知的且常規的標準技術進行以下實施例中的實驗。為了改善志賀毒素-來源的多肽區以用于在哺乳動物中的治療和診斷應用，將在整個毒素效應子區的預測的B細胞表位系統性破壞，目的是減弱哺乳動物B細胞介導的免疫應答。分析表示多種志賀毒素的A亞基的氨基酸序列，以鑒定推定的抗原性和/或免疫原性表位。使用計算機工具來預測B細胞和T細胞表位，包括考慮公眾可獲得的蛋白數據庫結構數據。表位預測憑經驗驗證。實驗檢測多種去免疫化志賀毒素效應子多肽失去天然志賀毒素A亞基中存在的表位并且保留志賀毒素效應子功能。將作為多種細胞毒性蛋白的組分的示例性的去免疫化志賀毒素效應子多肽的生物學活性與包含非去免疫化志賀毒素效應子多肽的細胞毒性蛋白(本文稱為“野生型”或“WT”)進行比較。下述去免疫化志賀毒素效應子多肽的實例證明了作為多種細胞毒性蛋白的組分保留了志賀毒素效應子功能。所述示例性的細胞毒性蛋白結合由被靶向的細胞型表達的靶標生物分子并且進入該被靶向的細胞。與包含野生型志賀毒素效應子區的細胞毒性蛋白相似，該內在化的細胞毒性蛋白有效地提供路線將它們的去免疫化志賀毒素效應子區運送到細胞質，以使核糖體失活，并且隨后引起被靶向的細胞的凋亡性死亡。此外，下述實施例證明了在志賀毒素效應子區多肽中可以組合多個表位破壞，以降低本發明的細胞毒性蛋白的整體抗原性和/或免疫原性同時保留有效的細胞毒性。實施例1.預測志賀毒素A亞基中的免疫原性和抗原性表位在志賀毒素A亞基內的抗原性和/或免疫原性位點從未被系統地繪出。利用計算機方法預測多種志賀毒素A亞基中的抗原性和/或免疫原性表位。在生物信息學(insilico)中預測具有引發哺乳動物免疫系統中的應答的B細胞表位和CD4+T細胞表位二者。由ProImmuneInc.(Sarasota，FL，U.S.)的志賀樣毒素A鏈(PDBID：1DM0_A)多肽序列和3D結構數據，使用它們的系統預測志賀樣毒素1成熟的A亞基(SLT-1A；SEQIDNO：1)的線性B細胞表位。平行地，使用BcePred網絡服務器(SahaS，RaghavaG，LectureNotesinComputSci3239：197-204(2004))、Bepipred線性表位預測(LarsenJ等，ImmunomeRes2：2(2006))和ElliPro抗體表位預測(HasteAndersenP等，ProteinSci15：2558-67(2006)；PonomarenkoJ，BourneP，BMCStructBiol7：64(2007))，由志賀毒素的A亞基(StxA；SEQIDNO：2)、志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A；SEQIDNO：1)和志賀樣毒素2的A亞基(Stx2A；SEQIDNO：3)的氨基酸序列預測B-細胞表位。各種計算方法揭示了三種原型志賀毒素A亞基中的B-細胞表位區域的類似預測(表1-3)。表1.志賀樣毒素1(SEQIDNO：1)的成熟的天然A亞基的B-細胞表位預測表2.志賀毒素(SEQIDNO：2)的成熟的天然A亞基的B-細胞表位預測表3.志賀樣毒素2(SEQIDNO：3)的成熟的天然A亞基的B-細胞表位預測先前的序列比對研究基于蓖麻毒蛋白中被中和抗體結合的表位預測志賀毒素A業基中可能是抗原性和/或免疫原性的免疫表位區(LebedaF，OlsonM，IntJBiolMacromol24：19-26(1999)；ZemlaA，EcaleZhouC，BioinformBiolInsights2：5-13(2008))。預測在StxA中大約殘基90-107處和Stx2A中大約殘基112-129處可能存在保守免疫原性表位(ZemlaA，EcaleZhouC，BioinformBiolInsights2：5-13(2008))。然而，由于在植物毒素蓖麻毒蛋白與細菌志賀毒素之間的關鍵差異，諸如，例如，在蓖麻毒蛋白與志賀毒素之間的大量的序列變異性，在志賀毒素的A亞基中缺少N端α螺旋，并且，與蓖麻毒蛋白相比，志賀毒素中預測的區域更短，且溶劑暴露性較小，公認該預測是不可靠的((FraserM等，NatureStructBiol1：59(1994)；LebedaF，OlsonM，IntJBiolMacromol24：19-26(1999)；ZemlaA，EcaleZhouC，BioinformBiolInsights2：5-13(2008))。據說由美國國立變態反應和傳染病研究所(NationalInstitutesofAllergyandInfectiousDiseasesoftheU.S.，NIAID)主辦的免疫表位數據庫(ImmuneEpitopeDatabase，IEDB)會提供志賀毒素的所有實驗性地表征的B-細胞和T-細胞表位。目前，IEDB僅提供了唯一的單一志賀毒素A亞基(Stx2dA)的單個表位：IEDB鑒定號為110493，其為實驗確定的不連續的B細胞表位，包含氨基酸42-49、96-100和245-260(SmithM等，InfectImmun77：2730-40(2009))。在下述實施例中，破壞SLT-1A中由多于一種方法鑒定的九個預測的B細胞表位區(表4)。表4.原型志賀毒素A亞基共有的九個推定的B細胞表位區另外，使用Epitopia網絡服務器分析志賀毒素A亞基，以預測B細胞表位和免疫原性殘基(RubinsteinN等，BMCBioinformatics10：287(2009))。使用Epitopia，基于線性氨基酸殘基片段中大部分氨基酸殘基的Epitopia評分為4或5(“高”)，鑒定SLT-1A中預測是免疫原性的線性氨基酸殘基。Epitopia分析預測的免疫原性區域在SLT-1A的氨基酸殘基1-15(以下稱為表位區0，參見表5，同上)。基于Epitopia分析，SLT-1A的免疫原性表位區2(參見表4)可能包括位置49。基于Epitopia分析，SLT-1A的免疫原性表位區3(參見表4)可能包括位置53并且延伸至大約位置62-66(以下稱為表位區3*，參見表5，同上)，SLT-1A中的表位區4(參見表4)可能包括位置94(以下稱為表位區4*，參見表5，同上)，并且SLT-1A中的表位區6(參見表4)可能包括位置179并且延伸至大約位置188-190(以下稱為表位區6*，參見表5，同上)。注意星號B細胞表位區全部完全包括它們各自與相同的數字標識符重疊的區域。比較這十個表位區(#0-9)，以與預測的CD4+T細胞表位重合。通過ProImmuneInc.(Sarasota，FL，U.S.)進行的REVEALTM免疫原性系統(IS)T細胞測定預測志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)的T細胞表位。該測定使用來自主題蛋白的多種重合肽序列，來檢測由來自耗盡CD8+T-細胞的健康捐贈者細胞樣品的CD4+T-細胞對任何免疫應答的引起。在這13個預測的B細胞表位區中，它們全部與至少一種預測的CD4+T細胞表位重合(表5)。在下述實施例中，表5中所有預測的B細胞表位區都單獨地或組合地被破壞或刪除。表5.具有重合的預測的CD4+T細胞表位的預測的B細胞表位區實施例2.志賀毒素效應子多肽的去免疫化在來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)的志賀毒素效應子多肽的推定的B細胞和T細胞表位中進行缺失和/或氨基酸置換。除了破壞預測的表位的所述點突變之外，一些構建體包含一個或多個對志賀毒素效應子酶活性或細胞毒性沒有明顯作用的點突變，諸如例如，SLT-1A中的R223A，SLT-1A中的C242S，和/或SLT-1A中的C261S。在該實施例中，志賀毒素效應子多肽區來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)。將編碼SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸用作模板，以產生多種編碼多種具有預測的B細胞表位的一個或多個破壞的志賀毒素效應子多肽的多核苷酸。由這些多核苷酸表達包含一個或多個表位破壞的志賀毒素效應子多肽，以研究哪些破壞可能更有效地使本發明的細胞毒性蛋白情形中的多種志賀毒素效應子多肽去免疫化。將SLT-1A的羧基端截短為SEQIDNO：1的氨基酸1-251去除了最后兩個B細胞表位區(表5，#8和#9)、最后兩個CD4+T細胞表位區(表5，#8和#9)以及由ElliPro預測的評分最高的不連續的B細胞表位(289-293)。另外，在位置251的階段可能破壞包含推定的B細胞和T細胞表位的第七表位區(表5)。使用本領域已知的方法，在包含SEQIDNO：1的氨基酸1-251的截短的志賀毒素效應子多肽中產生合理選擇的氨基酸置換(參見表6)。表位區#0(參見表5)，進行至少七種不同的氨基酸置換并檢測(參見表6)。在表位區#0，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A業基(SEQIDNO：2)中的位置1的賴氨酸突變成甲硫氨酸(K1M)。在表位區#0，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置4的蘇氨酸突變成異亮氨酸(T4I)。在表位區#0，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置8的絲氨酸突變成異亮氨酸(S8I)。在表位區#0，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置9的蘇氨酸突變成異亮氨酸(T9I)和纈氨酸(T9V)。在表位區#0，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置11的賴氨酸突變成丙氨酸(K11A)和組氨酸(K11H)。通過Epitopia網絡服務器預測表位區#0中突變的下面五個氨基酸殘基是溶劑暴露的：K1，T4，S8，T9和K11。在表位區#1(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置33的絲氨酸突變成異亮氨酸(S331)。在表位區#2(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)中的位置45的絲氨酸突變成纈氨酸(S45V)和異亮氨酸(S45I)。在表位區#2(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)中的位置47的天冬氨酸突變成甘氨酸(D47G)。在表位區#2(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)中的位置48的天冬酰胺突變成纈氨酸(N48V)和苯丙氨酸(N48F)。在表位區#3*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置53的天冬氨酸突變成丙氨酸(D53A)、甘氨酸(D53G)和天冬酰胺(D53N)。通過Epitopia網絡服務器預測D53是溶劑暴露的，并且具有5或“高”的免疫原性規格值。在表位區#3和#3*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置55的精氨酸突變成丙氨酸(R55A)、纈氨酸(R55V)和亮氨酸(R55L)。在表位區#3和#3*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置58的天冬氨酸突變成丙氨酸(D58A)、纈氨酸(D58V)和苯丙氨酸(D58F)。在表位區#3和#3*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置59的脯氨酸突變成丙氨酸(P59A)。在表位區#3和#3*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置60的谷氨酸突變成異亮氨酸(E60I)、蘇氨酸(E60T)和精氨酸(E60R)。在表位區#3和#3*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置61的谷氨酸突變成丙氨酸(E61A)、纈氨酸(E61V)和亮氨酸(E61L)。在表位區#3中#3*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置62的甘氨酸突變成丙氨酸(G62A)。在表位區#4*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置94的天冬氨酸突變成丙氨酸(D94A)。通過Epitopia網絡服務器預測該D94殘基是溶劑暴露的，并且具有5或“高”的免疫原性規格值。在表位區#4和#4*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置96的絲氨酸突變成異亮氨酸(S96I)。在表位區#4和#4*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置109的絲氨酸突變成纈氨酸(S109V)。在表位區#4和#4*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置110的甘氨酸突變成丙氨酸(G110A)。在表位區#4和#4*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置112的絲氨酸突變成纈氨酸(S112V)。在表位區#5(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置147的甘氨酸突變成丙氨酸(G147A)。在表位區6*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置179的精氨酸突變成丙氨酸(R179A)。由Epitopia網絡服務器預測該R179殘基是暴露的，并且具有5或“高”的免疫原性值。在表位區#6和#6*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置180的蘇氨酸突變成甘氨酸(T180G)。在表位區#6和#6*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置181的蘇氨酸突變成異亮氨酸(T181I)。在表位區#6和#6*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置183的天冬氨酸突變成丙氨酸(D183A)和突變成甘氨酸(D183G)。在表位區#6和#6*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置184的天冬氨酸突變成丙氨酸(D184A)或苯丙氨酸(D184F)。在表位區#6和#6*(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置185的亮氨酸突變成纈氨酸(L185V)。在表位區#6和#6*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置186的絲氨酸突變成丙氨酸(S186A)和突變成苯丙氨酸(S186F)。在表位區#6和#6*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置187的甘氨酸突變成丙氨酸(G187A)。在表位區#6和#6*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置188的精氨酸突變成丙氨酸(R188A)和突變成亮氨酸(R188L)。在表位區#6和#6*，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置189的絲氨酸突變成丙氨酸(S189A)。在表位區#7(參見表5)，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置248的精氨酸突變成丙氨酸(R248A)。在表位區#7，天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置251的精氨酸突變成丙氨酸(R251A)。天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置49的亮氨酸突變成丙氨酸(L49A)。通過Epitopia網絡服務器預測該L49殘基是溶劑暴露的，并且具有4的免疫原性值。天然位于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的位置205的精氨酸突變成丙氨酸(R205A)。通過Epitopia網絡服務器預測該R205殘基是溶劑暴露的，并且具有5或“高”的免疫原性值。表6.示例性的志賀毒素效應子多肽中的氨基酸置換作為具有靶向細胞的結合區的推定的細胞毒性蛋白的組分，檢測包含氨基酸置換的志賀毒素效應子多肽。該細胞毒性蛋白包含連接在一起形成融合蛋白的免疫球蛋白型結合區和志賀毒素效應子區。這些推定的細胞毒性融合蛋白通過用本領域已知的細菌系統表達編碼它們的多核苷酸而產生。實施例3.憑經驗檢測去免疫化志賀毒素效應子多肽保留一種或多種志賀毒素效應子功能憑經驗檢測多種去免疫化志賀毒素效應子區多肽的酶活性和細胞毒性的保留。在志賀毒素效應子多肽作為細胞毒性蛋白的組分的情形中，使用核糖體抑制檢測志賀毒素效應子多肽在去免疫化后酶活性的保留。在某些實施方案中，該實施例的細胞毒性蛋白的全長編碼輕鏈以編碼II的多核苷酸起始或結束，以促進檢測和純化。使用快速偶聯轉錄/翻譯試劑盒(QuickCoupledTranscription/Translationkit，L1170PromegaMadison，WI，U.S.)，使用無細胞體外蛋白翻譯測定，確定了去免疫化細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。所述試劑盒包括熒光素酶T7對照DNA(L4821PromegaMadison，WI，U.S.)和QuickMasterMix。根據生產商的說明書準備核糖體活性反應。在適當的緩沖液中制備一系列待測蛋白(其包含突變的志賀毒素效應子多肽區)的10倍稀釋液，并且為每個稀釋液產生一系列相同的TNT反應混合物組分。將在稀釋系列中的每個樣品與TNT反應混合物中的每一個以及熒光素酶T7對照DNA合并。將試驗樣品在30攝氏度(℃)溫育1.5小時。在溫育之后，將熒光素酶測定試劑(E1483Promega，Madison，WI，U.S.)加入所有試驗樣品，并且根據生產商的說明書通過發光測量熒光素酶蛋白翻譯的量。通過總蛋白的對數轉化濃度相對于相對發光單位的非線性回歸分析，確定翻譯抑制的水平。使用統計軟件(GraphPadPrism，SanDiego，CA，U.S.)，使用Prism軟件在標題劑量-響應-抑制下的log(抑制劑)相對于響應(三參數)的函數[Y＝底部+((頂部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]計算每個樣品的半最大抑制濃度(IC50)值。為每種包含去免疫化志賀毒素效應子多肽區的蛋白和包含沒有內部表位破壞的野生型志賀毒素效應子區的對照蛋白計算IC50值。如在表7中所指出的，本發明的示例性的志賀毒素效應子多肽區表現出核糖體抑制。如在表7中報道的，表現出在野生型SLT-1A對照構建體的10倍內的IC50的、包含置換的構建體被認為表現出與野生型相當的核糖體抑制活性；表現出在野生型SLT-1A對照的10倍-100倍之間的IC50的構建體被認為表現出較野生型減弱的活性；并且表現出大于野生型SLT-1A對照的100倍的IC50的構建體認為被嚴重消弱或是沒有活性的(嚴重消弱的/沒有活性)。表7.示例性志賀毒素效應子多肽的核糖體抑制活性表位區置換體外核糖體抑制(IC50)0K1M，K11A與野生型相當0S8I與野生型相當0T9I與野生型相當1S33I與野生型相當2S45I與野生型相當3*D53A與野生型相當3&3*R55A與野生型相當3&3*D58A與野生型相當3&3*D58F與野生型相當3&3*P59A與野生型相當3&3*E60I與野生型相當3&3*E60R與野生型相當3&3*E61A與野生型相當3&3*G62A與野生型相當4&4*D94A，S96I與野生型相當6*R179A嚴重消弱的/沒有活性6&6*D183A與野生型相當6&6*D184A與野生型相當6&6*D184F與野生型相當6&6*R188A與野生型相當6&6*D183A，D184A，R188A與野生型相當-R205A與野生型相當在志賀毒素效應子多肽作為具有能夠特異性且高親和力結合靶細胞(即，“靶標表達細胞”或“靶標生物分子陽性細胞”)表達的且與靶細胞的細胞表面物理偶聯的細胞外靶標生物分子的結合區的細胞毒性蛋白的組分的情形中，使用靶細胞殺傷測定，檢測多種示例性的志賀毒素效應子多肽在去免疫化后的細胞毒性活性的保留。與不表達細胞毒性蛋白結合區的靶標生物分子的細胞比較，使用靶標表達細胞確定去免疫化細胞毒性蛋白的細胞毒性水平。將靶標表達細胞鋪板(對于貼壁細胞，2x103個細胞/孔，在蛋白添加前一天鋪板；或對于懸浮細胞，7.5x103個細胞/孔，在蛋白添加同一天鋪板)在384-孔平板內的20μL細胞培養基中。在適當的緩沖液中制備每種待試蛋白(其包含突變的志賀毒素效應子多肽區)的一系列10倍稀釋液，然后將5μL稀釋液或緩沖液對照添加到細胞中。將僅含有培養基的對照孔用于基線校正。將細胞樣品與蛋白或僅緩沖液一起在37℃和在5％二氧化碳(CO2)氣氛下溫育3天。根據生產商的說明書，使用發光細胞存活力測定)LuminescentCellViabilityAssay，G7573PromegaMadison，WI，U.S.)使用發光讀出確定總細胞存活或生存力百分比。使用下述方程式計算實驗孔的生存力百分比：(試驗RLU-平均培養基RLU)/(平均細胞RLU-平均培養基RLU)*100。在Prism(GraphPadPrism，SanDiego，CA，U.S.)中繪制Log多肽濃度相對于生存力百分比，并使用log(抑制劑)相對于響應(3參數)分析來確定試驗的蛋白的半最大細胞毒性濃度(CD50)值。計算包含去免疫化志賀毒素效應子多肽的每種蛋白和沒有內部表位破壞的野生型對照蛋白的CD50。示例性志賀毒素效應子多肽區的細胞毒性顯示在表8中。如表8所報告的，表現出在野生型SLT-1A對照構建體的10倍內的CD50的包含置換的構建體被認為表現出與野生型相當的細胞毒性；表現出野生型SLT-1A對照的10倍-100倍之間的CD50的構建體被認為表現出較野生型減弱的細胞毒性；并且表現出大于野生型SLT-1A對照的100倍的CD50的構建體被認為是嚴重消弱的/沒有活性的。表8.示例性志賀毒素效應子多肽的細胞毒性活性術語“成功的”用于意指在預測的表位區中的一個或多個氨基酸殘基置換產生保留一種或多種志賀毒素效應子功能的志賀毒素效應子區多肽。組合在同一個表位區(#6&6*)分別是成功的三個置換(D183A、D184A和R188A)，產生保留與野生型相當的志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽(D183A/D184A/R188A)(表7和8)。這些結果表明，在志賀毒素效應子多肽的同一個表位區中的一些成功的氨基酸置換可以組合，以產生具有更大的整體表位破壞性的表位破壞，同時仍然保留顯著水平的一種或多種志賀毒素效應子功能。類似地，兩個表位區#0和#4&4*成功地耐受在它們各自的區域內的多個氨基酸置換(表7和8：K1M/K11A和D94A/S96I)。強化了下述觀點：在同一個表位區的多個示例性的置換可以組合，以產生具有更大整體表位破壞性的表位破壞，同時仍然保留顯著水平的一種或多種志賀毒素效應子功能。另外，使用本文實施例中所述的方法，檢測其他志賀毒素效應子區多肽的志賀毒素效應子功能和表位破壞，其中所述志賀毒素效應子區多肽在單一預測的B細胞表位區中包含多個氨基酸置換。所檢測的區域是存在于志賀樣毒素1的成熟的A亞基(SEQIDNO：1)和志賀毒素的成熟的A亞基(SEQIDNO：2)中的下述天然位置排列的區域：4-12，43-52，53-61，104-112和180-188。在包含含有SLT-1A(SEQIDNO：1)的殘基1-251的志賀毒素效應子區的細胞毒性蛋白的情形中，以多種組合產生這些單一區域、多個置換的構建體。這些構建體保留與野生型SLT-1A效應子構建體相當的核糖體抑制，并且針對靶細胞是有選擇性細胞毒性的。這些構建體在單一區域中包含與其他氨基酸置換不同組合的下述氨基酸置換：區域4-12：T4I，T9V和K11H；區域43-52：S45V，D47G，N48V，N48F和L49A；區域53-61：D53G，D53N，R55V，R55L，D58V，E60T，E61V和E61L；區域104-112：S109V，G110A和S112V；區域180-188：T180G，T181I，D183G，L185V，S186F和R188L。另外，這些構建體的蛋白質印跡分析表明一種或多種可以識別野生型SLT-1A的抗體(實施例4中所述的mAb1，pAb1和pAb2)對每種構建體的減少的或消除的識別。另外，通過置換R248A或R251破壞表位區#7，對核糖體抑制活性或細胞毒性沒有任何明顯的作用。可以將R248A或R251A成功地引入到上述示例性的志賀毒素效應子區多肽中，而不改變核糖體抑制或細胞毒性。將上文提及的個體表位破壞以及新的破壞組合，產生包含兩個以上表位區的破壞的志賀毒素效應子多肽的多種組合(表9)，然后憑檢驗檢驗志賀毒素效應子功能的保留，如在該實施例中所述。表9列出了在單個表位區中或在多至五個不同的表位區中具有氨基酸置換組合的構建體所展示的活性(使用前述術語)。表9.在去免疫化志賀毒素效應子多肽和細胞毒性蛋白中的多表位區氨基酸置換組合這些結果一般表明，如果不是全部成功的氨基酸置換(意味著憑經驗表明保留志賀毒素效應子功能并預測破壞表位的任意置換)，則志賀毒素效應子多肽的一個表位區中的大部分可以與不同表位區的大部分(如果不是全部其他的成功的氨基酸置換)組合，以形成多個表位區被破壞同時仍然保留至少一種志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽。實施例4.憑經驗檢測去免疫化志賀毒素效應子多肽的抗原性和/或免疫原性表位的破壞進行實驗檢測，以基于由已知的抗體識別的憑檢驗驗證的表位來證實B細胞表位的破壞。在變性條件下進行蛋白質印跡分析，以確定表位破壞。在更天然的蛋白折疊條件下(即，非變性條件下)進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)分析，以確定表位破壞。將包含II和野生型志賀毒素效應子多肽區或去免疫化志賀毒素效應子多肽區的細胞毒性蛋白以相等的量上樣到兩塊(replicate)4-20％十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠(Lonza，Basel，CH)上，并在變性條件下電泳。得到的凝膠通過考馬斯染色進行分析，或用(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，U.S.)系統按照制造商的使用說明轉移到聚乙烯基二氟化物(PVDF)膜上。得到的膜在標準條件下用下述抗體進行探測：兔多克隆α-NWSHPQFEK(A00626，Genscript，Piscataway，NJ，U.S.)，其識別多肽NWSHPQFEK(還稱為II)，小鼠單克隆α-StxA(抗SLT-1AmAb1或mAb1)(BEINR-867BEIResources，Manassas，VA，U.S.)，兔多克隆抗體α-SLT-1A(抗-SLT-1ApAb1或pAb1)(HarlanLaboratories，Inc.Indianapolis，IN，U.S.，定制抗體制備，針對SLT-1A氨基酸1-251)，和兔多克隆抗體α-SLT-1A(抗-SLT-1ApAb2或pAb2)(Genscript，Piscataway，NJ，U.S.，定制抗體制備)，其針對肽RGIDPEEGRFNN和HGQDSVRVGR。肽序列RGIDPEEGRFNN跨越推定的B細胞表位區#3(表5)，并且肽序列HGQDSVRVGR位于SLT-1A和StxA的214-223。使用標準標間檢測膜結合的抗體，并且，當合適時，使用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的二級抗體(山羊抗-兔-HRP或山羊抗-小鼠-HRP，ThermoScientific，Rockford，IL，U.S.)檢測。圖2-5顯示蛋白質印跡，其中凝膠和/或膜的泳道編號，并且圖例用相同的各自的編號表示，其中志賀毒素效應子區包含在上樣到每個泳道中的蛋白中。D58A置換成功地破壞了多克隆α-SLT-1ApAb2識別的表位中的一個(圖2)。類似地，D58A/G110A/G147A三聯置換和S33I/S45I/D58A/G110A/G147A五聯置換突變體表現出α-SLT-1ApAb2識別的至少一個表位的強破壞(圖3；圖4)和α-SLT-1ApAb1識別的至少一個表位的部分破壞(圖3)。S45I/G110A/G147A和S33I/G110A/G147A三聯置換突變體表現出對α-SLT-1ApAb1識別的至少一個表位的部分破壞(圖3)。S45I/G110A/G147A三聯突變體強烈破壞單克隆抗體mAb1識別的表位，并且部分破壞多克隆α-SLT-1ApAb2識別的表位(圖3；圖4)。D58A/G110A/G147A三聯突變體非常有效地破壞單克隆抗體mAb1識別的表位和多克隆α-SLT-1ApAb2識別的至少一個表位(圖3；圖4)。D183A/D184A/R188A三聯突變體表現出對單克隆抗體mAb1識別的表位的非常有效的破壞(圖5)。D58A/G110/G147A/R188A四聯突變體非常有效地破壞單克隆抗體mAb1識別的表位和多克隆α-SLT-1ApAb2識別的至少一個表位，并且部分破壞α-SLT-1ApAb1識別的至少一個表位(圖5)。可能的是，在D58A/G110A/G147A三聯突變體、S45I/G110A/G147A三聯突變體和D58A/G110A/G147A/R188A四聯突變體中破壞的表位(一個由mAb1識別，其他由pAb2識別)更可能存在于兩個不連續的區域中。因此，D58A/G110A/G147A三聯突變體、S45I/G110A/G147A三聯突變體和D58A/G110A/G147A/R188A四聯置換突變體分別包含憑檢驗驗證具有同時被破壞的至少兩個不同表位的去免疫化志賀毒素效應子區多肽。類似地，可能的是，在D58A/G110A/G147A三聯突變體、S45I/G110A/G147A三聯突變體、S33I/G110A/G147A三聯突變體、D58A/G110A/G147A/R188A四聯突變體和S33I/S45I/D58A/G110A/G147A五聯突變體中被破壞的某些優勢表位(由pAb1和pAb2識別的表位)更可能存在于至少兩個不連續的區域中。因此，D58A/G110A/G147A三聯突變體、S45I/G110A/G147A三聯突變體、S33I/G110A/G147A三聯突變體、D58A/G110A/G147A/R188A四聯突變體和S33I/S45I/D58A/G110A/G147A五聯突變體可能包含憑檢驗驗證具有同時被破壞的至少兩個不同表位的去免疫化志賀毒素效應子區多肽。使用標準ELISA測量mAb1識別細胞毒性蛋白情形中具有多個被破壞的表位區的去免疫化志賀毒素效應子區的能力。該細胞毒性蛋白結合其scFv結合區的靶標生物分子。將Nunc平板的孔(在磷酸緩沖鹽水(1XPBS)(HycloneBrand，FisherScientific，Waltham，MA，U.S.)中)用該細胞毒性蛋白的結合區的重組人靶蛋白包被。將平板在4℃溫育過夜。將孔用1XPBS0.05％吐溫-20(PBS-T)洗滌，然后通過用在PBS-T中的3％牛奶在室溫溫育孔1小時而封閉非特異性的結合。將包含II和去免疫化志賀毒素效應子區(D58A/G110A/G147A/R188A)的細胞毒性蛋白以確定高于結合解離長度(KD)的濃度加入到孔中。作為陽性對照和野生型活性的參比，向孔中加入相同濃度的包含野生型志賀毒素效應子區和II的細胞毒性蛋白。將平板在室溫溫育一小時，以允許在非變性條件下細胞毒性蛋白結合。用PBS-T洗滌孔，然后用PBS-T或小鼠單克隆抗體抗-SLT-1AmAb1在室溫溫育一小時。在PBS-T中洗滌孔，然后用檢測抗體溫育：針對II的HRP--綴合的抗體或抗-小鼠-HRP-綴合的抗體。在PBS-T中洗滌孔，然后用PierceTMBUltra(ThermoScientificInc.，Rockford，IL，U.S.)溫育。用250mM鹽酸(HCl)終止反應。通過測量設置為450納米(nm)波長的光的吸光度(Abs)的平板讀取裝置檢測HRP活性的產物。通過減去用PBS而不是任何志賀毒素構建體溫育的包被的封閉的孔的吸光度值，針對背景校正測量的吸光度值。兩種細胞毒性蛋白結合scFv的人、重組蛋白、靶標生物分子，如通過針對II抗體的剛吸光度值測量的(圖6)。包含去免疫化志賀毒素效應子區(D58A/G110A/G147A/RI88A)的細胞毒性蛋白不被單克隆抗體抗-SLT-1AmAb1識別(圖6)。包含野生型志賀毒素效應子多肽的陽性對照細胞毒性蛋白被抗體抗-SLT-1AmAb1結合(圖6)。這些結果表明，被抗-SLT-1AmAb1識別的表位存在于天然折疊的野生型志賀毒素效應子區中，但是在天然折疊的去免疫化志賀毒素效應子區中，該表位被突變組合D58A/G110A/G147A/R188A破壞。實施例5.預測志賀毒素效應子多肽中抗原性和/或免疫原性表位的破壞使用具有下述的BcePred網絡服務器：具有下述默認設置的靈活性讀數：親水性2，可及性2，暴露的表面2.4，抗原性傾向性1.8，靈活性1.9，turns1.9，極性2.3，和合并的1.9(SahaS，RaghavaG，LectureNotesinComputSci3239：197-204(2004))，檢驗實施例4中進行的每種置換(目的是使志賀毒素效應子多肽去免疫化，同時保留志賀毒素效應子功能)是否消除包含所述置換的表位區中預測的B細胞表位。表10顯示分析中存在的置換和最后一列中的B細胞表位預測的結果。注意，通過具有默認設置的BcePred靈活性方法沒有預測到野生型SLT-1A中的表位區s#0(1-15)和#7(243-257)。通過BcePred靈活性方法，檢測的置換(參見表6)沒有從頭產生任何預測的B細胞表位(參見例如，表10)，包括表位區#0中的K1M，S8I，T9I，K11A；表位區#4*中的D94A；和表位區#4與4*中的S96I。另外，關于使用BcePred計算方法分析的其他置換的結果列在表10中，其不是憑經驗檢測的。表10.氨基酸置換后的B細胞表位預測與SLT-1AD58A相比，SLT-1A野生型的蛋白質印跡分析(圖2)表明BcePred計算靈活性方法準確預測B細胞表位存在于SLT-1A的位置55-66(表1)，并且還準確預測了通過D58A置換對該表位區的破壞(表10)。實施例6.使用哺乳動物模型，與野生型志賀毒素效應子多肽相比，憑檢驗檢測去免疫化志賀毒素效應子多肽的相對免疫原性在本實施例中，使用人免疫系統的哺乳動物模型，確定本發明的去免疫化細胞毒性蛋白與未去免疫化細胞毒性蛋白相比的相對免疫原性。使用哺乳動物免疫系統的鼠模型比較包含示例性的去免疫化志賀毒素效應子多肽的示例性細胞毒性蛋白與包含僅具有野生型序列的志賀毒素效應子區的親本細胞毒性蛋白的相對免疫原性。由于細菌來源的志賀毒素效應子區多肽是哺乳動物的外源(或非自身的)分子結構，預測野生型志賀毒素效應子多肽將展現某種水平的免疫原性。使用小鼠確定的非哺乳動物蛋白的相對免疫原性通常指示其對所有哺乳動物的相對免疫原性。使用溶液中的ELISA測定來確定特異性針對下述不同細胞毒性蛋白樣品的血清鼠抗體的相對量：包含野生型志賀毒素效應子多肽(SLT-1A的氨基酸1-251)或示例性去免疫化志賀毒素效應子區多肽(SLT-1A的氨基酸1-251，具有特定的氨基酸置換)的細胞毒性蛋白。將雌性BALB/c小鼠隨機分組，形成每組六只小鼠的各個組。首先，在暴露于細胞毒性蛋白之前，從每只小鼠采集血清樣品。接著，將組中的每只小鼠通過腹膜內注射施用每劑量0.25mg/kg的細胞毒性蛋白(包含野生型(SLT-1A的氨基酸1-251)或示例性的去免疫化志賀毒素效應子區(SLT-1A的氨基酸1-251，包含D58A/G110A/G147A/R188A))，每周三次，持續兩周，在十二天內共六次注射。在細胞毒性蛋白施用過程中和之后，從所有組的小鼠收集鼠血清，以使用溶液中ELISA測定觀察抗-“施用的蛋白”的水平。如下述進行溶液中的抗-“細胞毒性蛋白”ELISA測定。將與用于在小鼠組中注射的相同的細胞毒性蛋白在溶液中與來自該組的小鼠的血清在4℃溫育過夜，然后使用用適當的靶標蛋白包被的ELISA平板孔捕獲免疫復合物(由與血清中任何誘導的抗體結合的細胞毒性蛋白組成)。使用辣根過氧化物酶綴合的、抗-小鼠IgG、二級抗體檢測包含鼠IgGs的捕獲的免疫復合物。將ELISA平板顯色，以檢測辣根過氧化物酶活性，并且使用平板讀數儀，在450nm檢測辣根過氧化物酶活性或“ELISA信號”。將“ELISA信號”或“ELISA值”計算為減去背景信號(如使用“無血清”陰性對照測量的)后的吸光度值。對于該溶液中ELISA測定和設置，較大的ELISA值表示更強的免疫應答(抗體誘導)。通過該溶液中ELISA測定，在通過注射暴露于細胞毒性蛋白之前，任意組中沒有小鼠檢測到具有識別任一種細胞毒性蛋白的預先形成的血清抗體。因此，使用溶液中ELISA測定，在這些小鼠中抗-“細胞毒性蛋白”抗體的任意施用后檢測表示誘導的從頭抗體形成，這在施用后發生。對于該實施例的相對免疫原性研究，在ELISA測定中使用與注射到小鼠組中的相同的細胞毒性蛋白，以捕獲來自該組小鼠的血清抗體。換言之，在ELISA測定中，在來自“野生型志賀毒素效應子區”組的小鼠的血清中存在的抗體用包含野生型志賀毒素效應子區的細胞毒性蛋白捕獲，并且在ELISA測定中，在來自“去免疫化志賀毒素效應子區多肽”組的小鼠的血清中存在的抗體用包含示例性去免疫化志賀毒素效應子區多肽(D58A/G110A/G147A/R188A)的示例性細胞毒性蛋白捕獲。在第15天(施用第六次劑量后3天)和第22天(施用第六次劑量后10天)，通過上述溶液中ELISA測定測量抗-“細胞毒性蛋白”IgG反應(圖7)。在圖7中，符號表示個體小鼠：實心符號表示施用包含野生型志賀毒素效應子區的細胞毒性蛋白的小鼠，空心符號表示施用包含去免疫化志賀毒素效應子區多肽的示例性細胞毒性蛋白的小鼠。在圖7中，豎直線分別表示每個組的平均IgG反應信號。在第15和22天，如通過ELISA信號所示，在施用了包含野生型志賀毒素效應子區的細胞毒性蛋白的組中的小鼠具有比施用了包含去免疫化志賀毒素效應子區(D58A/G110A/G147A/R188A)的細胞毒性蛋白的組中的小鼠更高幅度的抗體反應(圖7)。“去免疫化志賀毒素效應子區多肽”組的平均ELISA信號(定量抗體反應)是“野生型志賀毒素效應子區”組的25％(第15天)和39％(第22天)。基于t檢驗(p值小于0.005)，“去免疫化志賀毒素效應子區多肽”組與“野生型志賀毒素效應子區”組之間的ELISA信號差異是統計學顯著的。施用0.9Abs單位的名義吸光度值截點表示“強”抗體反應，在“野生型志賀毒素效應子區”組中的6/6(100％)只小鼠在第15或22天具有強抗體反應，而在“去免疫化志賀毒素效應子區多肽”組中僅有3/6(50％)只小鼠具有強抗體反應。包含去免疫化志賀毒素效應子區多肽(D58A/G110A/G147A/R188A)的示例性細胞毒性蛋白在哺乳動物模型中表現出降低的免疫原性(圖7)。與“野生型志賀毒素效應子區”組相比，在“去免疫化志賀毒素效應子區多肽”組中的小鼠中，抗體誘導總量的減少，以及在該組中誘導有效的抗體反應的小鼠數量的減少，表明去免疫化志賀毒素效應子區多肽(D58A/G110A/G147A/R188A)成功地被去免疫化(即，在哺乳動物中具有降低的免疫原性潛力)，并且包含其的示例性的細胞毒性蛋白是去免疫化細胞毒性蛋白(即，在哺乳動物中具有降低的免疫原性潛力)。該示例性去免疫化細胞毒性蛋白包含含有四個不同的B細胞表位區破壞同時保留三種以上志賀毒素效應子功能的志賀毒素效應子區多肽，所述三種以上志賀毒素效應子功能為：催化核糖體抑制，細胞內按路線發送，和細胞毒性(表9)。另外，該細胞毒性蛋白的去免疫化志賀毒素效應子區多肽顯示具有被mAb1、pAb2和pAb1識別的破壞的表位(通過蛋白質印跡)(圖5)和被mAb1識別的破壞的表位(通過ELISA測定)(圖6)。因此，該示例性的細胞毒性蛋白是包含去免疫化志賀毒素效應子區多肽的去免疫化細胞毒性蛋白，其具有降低的針對哺乳動物免疫系統的抗原性和免疫原性。通過在相同的或另外的預測的B細胞表位區引入另外的突變，可以進一步降低該示例性細胞毒性蛋白的抗原性和/或免疫原性。另外，在已經破壞的B細胞表位區中相同的或不同的位置的備選置換將導致降低的相對免疫原性。以相似的方式檢測多種示例性去免疫化志賀毒素效應子區多肽或包含多種去免疫化志賀毒素效應子多肽區的示例性細胞毒性蛋白的相對免疫原性。使用本文所述的或技術人員已知的動物模型和測定，將某些示例性的去免疫化志賀毒素效應子區多肽，包括1.(1-251：K1M/K11A/S33I/S45I/D58A/G110A/G147A/R188A)，2.(1-251：K1M/K11A/S331/S45I/D58A/G110A/G147A/D183A/D184A/R188A)，3.(1-251：K1M/K11A/S33I/S45I/D58A/E60I/G110A/G147A/D183A/D184/R188A)，4.(1-251：K1M/K11A/S33I/S45I/R55A/D58A/P59A/E60I/E61A/G62A/G110A/G147A/D183A/D184A/R188A)，5.(1-251：K1M/K11A/S33I/S45I/D58A/G110A/G147A/D183A/D184A/S189A)，and6.(1-251：K1M/K11A/S33I/S45I/R55A/D58A/P59A/E60I/E61A/G62A/G110A/G147A/D183A/D184/R188A/R205A)，和SEQIDNOs：4-52，與僅包含野生型氨基酸序列的志賀毒素效應子多肽和/或包含野生型志賀毒素效應子多肽區的親本細胞毒性蛋白比較。在該實施例中，小鼠靜脈內施用去免疫化形式或野生型形式，以7天的時間間隔施用4次。從注射的小鼠采集血液樣品，并且通過ELISA測定檢測針對細胞毒性蛋白和/或志賀毒素效應子多肽的反應性。與包含僅含有野生型氨基酸序列的志賀毒素效應子區多肽的分子相比，將在注射了特定的示例性去免疫化志賀毒素效應子多肽或包含其的細胞毒性蛋白的小鼠中測量相對減少的免疫原性反應。包含含有多個B細胞表位區破壞的示例性去免疫化志賀毒素效應子區多肽的某些示例性去免疫化細胞毒性蛋白將保留顯著水平的一種或多種志賀毒素效應子功能：催化核糖體抑制，細胞內按路線發送，和細胞毒性，并且，在蛋白質印跡和/或ELISA測定二者中，具有減少的被預先形成的識別抗-志賀樣毒素A亞基抗體的抗體的識別。這些包含具有多個B細胞表位區破壞的去免疫化志賀毒素效應子區多肽的示例性細胞毒性蛋白是具有降低的抗原性和/或免疫原性的去免疫化志賀毒素效應子區多肽。總結前述實施例證明了志賀毒素效應子區多肽內的B細胞表位區可以通過氨基酸置換破壞，并且導致抗原性和免疫原性二者的降低。表11中總結了在保留至少一種志賀毒素功能的細胞毒性蛋白的情形中在志賀毒素效應子區多肽的預測的表位區內的氨基酸殘基置換。除了置換R179A干擾兩種以上志賀毒素效應子功能之外，所有的示例性置換導致功能上保留高細胞毒性的志賀毒素效應子區，其具有一個或多個B細胞表位的同時破壞。表11.B細胞表位區中保留志賀毒素效應子功能的置換的總結盡管有推理預測成功的置換的挑戰，本文實施例中提供的數據提供了相信某些氨基酸置換可能成功地降低抗原性和/或免疫原性同時保持顯著的志賀毒素效應子功能的理由。例如，當用某些其他氨基酸置換時，在本文顯示為成功耐受置換的特定氨基酸位置的置換(表11)更可能成功地用于保留至少一種志賀毒素效應子功能。關于在組合多個單個氨基酸置換(預測破壞表位區并且保留細胞毒性)時包含志賀毒素效應子區的細胞毒性蛋白保留細胞毒性的證明表明成功的單個氨基酸置換通常可以與不同表位區的其他成功的氨基酸置換組合，以產生保留顯著的志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽。類似地，關于包含在相同表位區內具有多個單個氨基酸置換的志賀毒素效應子區的細胞毒性蛋白保留酶活性的證明(表9；表11)表明在相同表位區中的成功的單個氨基酸置換通常可以與在相同表位區中的其他單個氨基酸置換組合，以產生保留顯著志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽。包含在相同表位區內具有多個單個氨基酸置換的志賀毒素效應子區多肽的細胞毒性蛋白保留細胞毒性的事實(表9；表11)表明在表位區中的成功的單個氨基酸置換可以與同一表位區中其他單個氨基酸置換組合，以產生保留顯著的志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽。經驗數據證明某些置換(K1M，S8I，T9I，K11A，S331，S45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，D183A，D184A，D184F，R188A，R205A，和/或它們的組合)和某些位置(1，4，8，9，11，33，45，48，53，55，57，58，59，60，61，62，94，96，109，110，147，180，181，183，184，185，186，187，188，189，205，248，和251)耐受置換，同時保留顯著水平的至少一種志賀毒素效應子功能的活性。該經驗數據表明可以用于產生保留顯著的志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽的某些其他表位破壞性置換和表位破壞性置換的組合。可以預測還將耐受置換成保守功能組的氨基酸殘基的其他氨基酸置換。例如，技術人員已知與下述任一種相似的其他置換也能夠破壞表位，同時保持至少一種志賀毒素效應子功能：K1M，T4I，S8I，T9V，T9I，K11A，S33I，S45V，S45I，D47G，N48V，N48F，L49A，D53A，D53G，D53N，R55A，R55L，I57F，D58A，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，D94A，S96I，S109V，G110A，S112V，G147A，T180G，T181T，D183A，D183G，D184A，D184F，L185V，S186A，S186F，G187A，R188A，R188L，S189A，R205A，R248A，或R251A。具體地，與K1M，T4I，S8I，T9V，T9I，K11A，S33I，S45V，S45I，D47G，N48V，N48F，L49A，D53A，D53G，D53N，R55A，R55L，I57F，D58A，D58F，P59A，P59F，E60I，E60T，E60R，E61A，E61V，E61L，G62A，D94A，S96I，S109V，G110A，S112V，G147A，T180G，T181T，D183A，D183G，D184A，D184F，L185V，S186A，S186F，G187A，R188A，R188L，S189A，R205A，R248A，或R251A類似的置換成保守氨基酸殘基的氨基酸置換具有相同的作用。相似的保守氨基酸置換的實例包括K1置換成A，G，V，L，I，F和H；T4I置換成A，G，V，L，F，M和S；S8置換成A，G，V，L，F和M；T9置換成A，G，L，F，M和S；K11置換成G，V，L，I，F和M；S33置換成A，G，V，L，F和M；S45置換成A，G，L，F和M；T45置換成A，G，V，L，I，F和M；D47置換成A，V，L，I，F，S和Q；N48置換成A，G，L，I和M；L49置換成G；D53置換成V，L，I，F，S和Q；R55置換成G，I，F，M，Q，S，K和H；D58置換成G，V，L，I，S和Q；P59置換成G；E60置換成A，G，V，F，S，Q，N，D和M；E61置換成G，I，F，S，Q，N，D，M和R；D94置換成G，V，L，I，F，S和Q；S96置換成A，G，V，L，F和M；S109置換成A，G，I，L，F和M；T109置換成A，G，V，I，L，F和M；S112置換成A，G，L，I，F和M；T180置換成A，V，L，I，F，M和S；T181置換成A，G，V，L，F，M和S；D183置換成V，L，I，F，S和Q；D184置換成G，V，L，I，S和Q；L185置換成A和G；S186置換成G，V，I，L，F和M；R188置換成G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S189置換成G，V，I，L，F和M；R204置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；R205置換成A，G，V，L，I，F，M，Q，S，K和H；S247置換成A，G，V，I，L，F和M；Y247置換成A，G，V，L，I和F，R248置換成G，V，L和I；R250置換成A，G，V，L，I和F；以及R251置換成G，V，L和I。去除電荷、極性和/或減短側鏈長度的氨基酸置換也將能夠破壞表位，同時保持至少一種志賀毒素效應子功能。例如，用A，G，V，L，I，P，C，M，F，S，D，N，Q，H和K置換氨基酸殘基K1，T4，S8，T9，K11，S33，S45，D47，N48，L49，D53，R55，157，D58，P59，E60，E61，G62，D94，S96，S109，T109，G110，S112，G147，T180，T181，D183，D184，L185，S186，G187，R188，S189，R205，R248，或R251，以使側鏈電荷被去除，極性被去除，和/或側鏈長度被減短。具體地，下述氨基酸置換將能夠破壞表位，同時保持至少一種志賀毒素效應子功能：D47，D53，D58，D94，D183，D184，D264置換成A，G，V，L，I，S和N；E60或E61置換成A，G，L，V，I，S，N，Q，D和M；G62，G110，G147，G187，或G265置換成A；K1或K11置換成A，G，L，V，I，F，C，M，P，S，T，N，H和Q；L49或L185置換成A和G；N48置換成A，G，V，L和I；R55，R188，R205，R247，R248，R250或R251置換成A，G，L，V，I，S，Q，K，M，F和H；S33，S45，S96，S109，S112，S186，或S189置換成A，G，V和L，以及T4，T9，T45，T109，T180，T181，T286置換成A，G，V，L，I，M和F。另外，在志賀毒素效應子多肽的一個表位區的破壞表位同時保留顯著的志賀毒素效應子功能的氨基酸置換通常預測可與相同或不同表位區的破壞表位同時保留顯著的志賀毒素效應子功能的其他氨基酸置換組合，以形成具有多個被破壞的表位區同時仍然保留顯著水平的志賀毒素效應子功能的去免疫化志賀毒素效應子多肽。例如，K1M，S8I，T9I，S9I，K11A，S33I，S45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，和/或R205A可以組合，其中可能地與K1M，S8I，T9I，S9I，K11A，S33I，S45I，D53A，R55A，D58A，D58F，P59A，E60I，E60R，E61A，G62A，D94A，S96I，G110A，G147A，D183A，D184A，D184F，S186A，G187A，R188A，S189A，和/或R205A組合，以產生本發明的去免疫化志賀毒素效應子區多肽。實施例7.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和特異性針對CD20的結合區的細胞毒性蛋白(與SLT-1A融合的αCD20)在該實施例中，所述志賀毒素效應子區是來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)并且包含前述實施例中所述的一個或多個去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。免疫球蛋白型結合區αCD20-抗原來源于識別人CD20的免疫球蛋白型結構域(參見例如，Haisma等，Blood92：184-90(1999)；GengS等，CellMolImmunol3：439-43(2006)；OlafesnT等，ProteinEngDesSel23：243-9(2010))，其包含能夠結合CD20的細胞外部分的免疫球蛋白型結合區。CD20在多個癌細胞型上表達，諸如，流入，B細胞淋巴瘤細胞、毛細胞白血病細胞、B細胞慢性淋巴細胞白血病變性和黑素瘤細胞。另外，CD20是用于治療某些涉及過度活躍的B-細胞的自身免疫疾病、病癥和病患的治療劑的有吸引力的靶標。細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD20的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區αCD20和志賀毒素效應子區(諸如，例如，SEQIDNOs：4-52)連接在一起。例如，通過表達編碼αCD20-抗原-結合蛋白SLT-1A：：αCD20(參見，例如，SEQIDNOs：53，54，55和56)的多核苷酸來生產融合蛋白。使用如在以前的實施例中所述的或技術人員已知的細菌的和/或無細胞的蛋白翻譯系統完成SLT-1A：：αCD20細胞毒性蛋白的表達。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD20的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術測定，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對CD20+細胞和CD20-細胞的結合特性，即最大特異性結合(Bmax)和平衡結合常數(KD)。SLT-1A：：αCD20對CD20+細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM范圍內的KD，而在該測定中不存在與CD20-細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αCD20細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細胞測定中SLT-1A：：αCD20對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用CD20+細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD20的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定，使用CD20+細胞確定了SLT-1A：：αCD20的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用CD20-細胞作為CD20+細胞的對比，確定了SLT-1A：：αCD20的選擇性細胞毒性特征。對于CD20+細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達CD20的細胞的CD50是在細胞表面上表達CD20的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：αCD20的相對去免疫化。使用動物模型確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD20的體內效應使用動物模型確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCD20對贅生性細胞的體內效應。使用多個小鼠品系試驗細胞毒性蛋白在靜脈內施用以后對小鼠中的異種移植物腫瘤的效應，所述異種移植物腫瘤由向這些小鼠注射在它們的細胞表面上表達CD20的人贅生性細胞產生。實施例8.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和特異性針對HER2的結合區的細胞毒性蛋白(“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”)在本實施例中，志賀毒素效應子區源自如上所述的志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)，并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換。免疫球蛋白型結合區是來源于駱駝科抗體(VHH)蛋白5F7的單結構域可變區的αHER2VHH，如在美國專利申請公開2011/0059090中所述。細胞毒性蛋白“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區和志賀毒素效應子區連接在一起以形成融合蛋白(例如，參見，SEQIDNOs：57，58，和59)。在該實施例中，可以將編碼從蛋白5F7來源的αHER2-VHH可變區的多核苷酸與本領域已知的編碼接頭的多核苷酸在框架內和與編碼志賀毒素效應子區(其包含SEQIDNOs：4-52的氨基酸)的多核苷酸在框架內克隆。產生“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”細胞毒性蛋白的變體，使得所述結合區任選地位于志賀毒素效應子區的氨基端附近，且任選地包含KDEL家族的羧基端內質網信號基序。使用如在前述實施例中所述的細菌的和/或無細胞的蛋白翻譯系統，完成“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”細胞毒性蛋白變體的表達。確定細胞毒性蛋白“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術測定，確定本實施例的細胞毒性蛋白對HER2+細胞和HER2-細胞的結合特性。“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”變體對HER2+細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與HER2-細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細胞測定中“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”變體對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用HER2+細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用HER2+細胞確定“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”變體的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用HER2-細胞作為HER2+細胞的對比，確定“與SLT-1A融合的αHER2-VHH”的選擇性細胞毒性特征。對于HER2+細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達HER2的細胞的CD50是在細胞表面上表達HER2的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定與SLT-1A融合的αHER2-VHH的相對去免疫化。使用動物模型確定細胞毒性蛋白與SLT-1A融合的αHER2-VHH的體內效應使用動物模型來確定細胞毒性蛋白與SLT-1A融合的αHER2-VHH對贅生性細胞的體內效應。使用多個小鼠品系試驗細胞毒性蛋白在靜脈內施用以后對小鼠中的異種移植物腫瘤的效應，所述異種移植物腫瘤由向這些小鼠注射在它們的細胞表面上表達HER2的人贅生性細胞產生。實施例9.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和來源于抗體αEB抗原的結合區的細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是源自如上所述的志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。免疫球蛋白型結合區αEB抗原來源于針對EB抗原的單克隆抗體(FangC等，JImmunolMethods287：21-30(2004))，其包含能夠結合被EB病毒感染的人細胞或表達EB抗原的轉化細胞的免疫球蛋白型結合區。所述EB抗原在多個細胞類型上表達，諸如被EB病毒感染的細胞和癌細胞(例如淋巴瘤和鼻咽癌細胞)。另外，EB感染與其它疾病(例如，多發性硬化)有關。細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB：：KDEL的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區αEB-抗原和志賀毒素效應子區連接到一起，并添加羧基端KDEL以形成蛋白。例如，通過表達編碼αEB-抗原-結合蛋白SLT-1A：：αEB：：KDEL的多核苷酸來生產融合蛋白。使用如在前述實施例中所述的細菌的和/或無細胞的蛋白翻譯系統，完成SLT-1A：：αEB：：KDEL細胞毒性蛋白的表達。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB：：KDEL的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術測定，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對EB抗原陽性細胞和EB抗原陰性細胞的結合特性。SLT-1A：：αEB：：KDEL對EB抗原陽性細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與EB抗原陰性細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αEB：：KDEL細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細胞測定中SLT-1A：：αEB：：KDEL對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB：：KDEL的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用EB抗原陽性細胞確定SLT-1A：：αEB：：KDEL的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用EB抗原陰性細胞作為EB抗原陽性細胞的對比，確定SLT-1A：：αEB：：KDEL的選擇性細胞毒性特征。對于EB抗原陽性細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達EB抗原的細胞的CD50是在細胞表面上表達EB抗原的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：αEB：：KDEL的相對去免疫化。使用動物模型確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB：：KDEL的體內效應使用動物模型來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEB：：KDEL對贅生性細胞的體內效應。使用多個小鼠品系試驗細胞毒性蛋白在靜脈內施用以后對小鼠中的異種移植物腫瘤的效應，所述異種移植物腫瘤由向這些小鼠注射在它們的細胞表面上表達EB抗原的人贅生性細胞產生。實施例10.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和來源于抗體α利什曼原蟲-抗原的細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。免疫球蛋白型結合區α利什曼原蟲抗原來源于使用本領域已知的技術制備的抗體，所述抗體針對存在于攜帶細胞內錐蟲原生動物的人細胞上的細胞表面利什曼原蟲抗原(參見SilveiraT等，IntJParasitol31：1451-8(2001)；KennerJ等，JCutanPathol26：130-6(1999)；BermanJandDwyer，ClinExpImmunol44：342-348(1981))。細胞毒性蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區α利什曼原蟲抗原和志賀毒素效應子區連接在一起，并添加羧基端KDEL以形成蛋白。例如，通過表達編碼利什曼原蟲抗原結合蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL的多核苷酸產生融合蛋白。SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL細胞毒性蛋白的表達使用前面實施例所述的細菌和/或無細胞蛋白翻譯系統實現。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對利什曼原蟲抗原陽性細胞和利什曼原蟲抗原陰性細胞的結合特征。SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL對利什曼原蟲抗原陽性細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與利什曼原蟲抗原陰性細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細胞測定中SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用利什曼原蟲抗原陽性細胞確定SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用利什曼原蟲抗原陰性細胞作為利什曼原蟲抗原陽性細胞的對比，確定SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL的選擇性細胞毒性特征。對于利什曼原蟲抗原陽性細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達利什曼原蟲抗原的細胞的CD50是在細胞表面上表達利什曼原蟲抗原的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：α利什曼原蟲：：KDEL的相對去免疫化。實施例11.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和來源于免疫球蛋白型結合區α神經降壓肽受體的結合區的細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。免疫球蛋白型結合區α神經降壓肽受體來源于DARPinTM(GenBank登記號：2P2C_R)或結合人神經降壓肽受體的單克隆抗體(OvigneJ等，Neuropeptides32：247-56(1998))。神經降壓肽受體由多種癌細胞表達，諸如乳腺癌、結腸癌、肺癌、黑素瘤和胰腺癌細胞。細胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區α神經降壓肽R和志賀毒素效應子區連接在一起，并添加羧基端KDEL以形成蛋白。例如，通過表達編碼神經降壓肽受體結合蛋白SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的多核苷酸產生融合蛋白。SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL細胞毒性蛋白的表達使用前面實施例所述的細菌和/或無細胞蛋白翻譯系統實現。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對神經降壓肽受體陽性細胞和神經降壓肽受體陰性細胞的結合特征。SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL對神經降壓肽受體陽性細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與神經降壓肽受體陰性細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細胞測定中SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用神經降壓肽受體陽性細胞確定SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用神經降壓肽受體陰性細胞作為神經降壓肽受體陽性細胞的對比，確定SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的選擇性細胞毒性特征。對于神經降壓肽受體陽性細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達神經降壓肽受體的細胞的CD50是在細胞表面上表達神經降壓肽受體的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的相對去免疫化。使用動物模型確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL的體內效應使用動物模型來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：α神經降壓肽R：：KDEL對贅生性細胞的體內效應。使用多個小鼠品系試驗細胞毒性蛋白在靜脈內施用以后對小鼠中的異種移植的腫瘤的效應，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細胞(所述細胞在它們細胞表面上表達神經降壓肽受體)而產生。實施例12.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和來源于免疫球蛋白型結合區αEGFR的結合區的細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。結合區αEGFR來源于AdNectinTM(GenBank登記號：3QWQ_B)、AffibodyTM(GenBank登記號：2KZI_A；美國專利8,598,113)或抗體，它們都與一種或多種人表皮生長因子受體結合。表皮生長因子受體的表達與人癌細胞相關，諸如，例如，肺癌細胞、乳腺癌細胞和結腸癌細胞。細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區αEGFR與志賀毒素效應子區連接在一起，并添加羧基端KDEL以形成蛋白。例如，通過表達編碼EGFR結合蛋白SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的多核苷酸產生融合蛋白。SLT-1A：：αEGFR：：KDEL細胞毒性蛋白的表達使用前面實施例所述的細菌和/或無細胞蛋白翻譯系統實現。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對EGFR+細胞和EGFR-細胞的結合特征。SLT-1A：：αEGFR：：KDEL對EGFR+細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與EGFR-細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αEGFR：：KDEL細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細胞測定中SLT-1A：：αEGFR：：KDEL對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用EGFR+細胞確定SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用利EGFR-細胞作為利什曼原蟲抗原陽性細胞的對比，確定SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的選擇性細胞毒性特征。對于EGFR+細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達EGFR的細胞的CD50是在細胞表面上表達EGFR的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的相對去免疫化。使用動物模型確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR：：KDEL的體內效應使用動物模型來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEGFR：：KDEL對贅生性細胞的體內效應。使用多個小鼠品系試驗細胞毒性蛋白在靜脈內施用以后對小鼠中的異種移植的腫瘤的效應，所述小鼠中的異種移植的腫瘤通過向這些小鼠注射人贅生性細胞(所述細胞在它們細胞表面上表達EGFR(s))而產生。實施例13.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和來源于抗體αCCR5的結合區的細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。免疫球蛋白型結合區αCCR5來源于針對人CCR5(CD195)的單克隆抗體(BernstoneL等，Hybridoma31：7-19(2012))。CCR5主要在T細胞、巨噬細胞、樹突細胞和小膠質細胞上表達。另外，CCR5在人免疫缺陷病毒(HIV)的發病機制和傳播中起作用。細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5：：KDEL的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區αCCR5與志賀毒素效應子區連接在一起，并添加羧基端KDEL以形成蛋白。例如，通過表達編碼αCCR5-結合蛋白SLT-1A：：αCCR5：：KDEL的多核苷酸產生融合蛋白。SLT-1A：：αCCR5：：KDEL細胞毒性蛋白的表達使用前面實施例所述的細菌和/或無細胞蛋白翻譯系統實現。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對CCR5+細胞和CCR5-細胞的結合特征。SLT-1A：：αCCR5：：KDEL對CCR5+陽性細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與CCR5-細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αCCR5：：KDEL細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。SLT-1A：：αCCR5：：KDEL對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用CCR5+細胞確定SLT-1A：：αCCR5：：KDEL的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用CCR5-細胞作為CCR5+細胞的對比，確定SLT-1A：：αCCR5：：KDEL的選擇性細胞毒性特征。對于CCR5+細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達CCR5的細胞的CD50是在細胞表面上表達CCR5的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：αCCR5：：KDEL的相對去免疫化。使用動物模型確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5：：KDEL的體內效應使用動物模型來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αCCR5：：KDEL對從耗盡來自供體物質的T細胞的體內效應(參見TsirigotisP等，Immunotherapy4：407-24(2012))。使用非人靈長動物確定SLT-1A：：αCCR5的體內效應。當用SLT-1A：：αCCR5：：KDEL預處理捐贈的器官時，在腎移植后，在恒河猴(rhesusmacaques)中分析移植物抗宿主疾病(參見WeaverT等，NatMed15：746-9(2009))。在腸胃外施用不同劑量的SLT-1A：：αCCR5：：KDEL以后，觀察到食蟹猴靈長類動物中外周血T淋巴細胞的體內消耗。如下試驗SLT-1A：：αCCR5：：KDEL的阻斷HIV感染的用途：給非人靈長類動物施用急性劑量的SLT-1A：：αCCR5：：KDEL，以便在暴露于猿猴免疫缺陷病毒(SIV)時嚴格耗盡循環T-細胞(參見SellierP等，PLoSOne5：e10570(2010))。實施例14.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和來源于抗-Env免疫球蛋白結構域的結合區的細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是來源于志賀毒素的A亞基(StxA)并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。免疫球蛋白型結合區αEnv來源于現有的結合HIV包膜糖蛋白(Env)的抗體，諸如GP41，GP120，GP140或GP160(參見，例如ChenW等，JMolBio382：779-89(2008)；ChenW等，ExpertOpinBiolTher13：657-71(2013)；vandenKerkhofT等，Retrovirology10：102(2013))，或來源于用標準技術產生的抗體(參見Prabakaran等，FrontMicrobiol3：277(2012))。Env是在HIV復制過程中也在被展示在HIV-感染的細胞的細胞表面上的HIV表面蛋白。盡管Env在受感染的細胞中主要在胞內體區室中表達，足夠量的Env可以存在于要被本發明的非常有效的細胞毒性蛋白靶向的細胞表面上。另外，靶向Env的細胞毒性蛋白可能結合HIV病毒粒子并在病毒粒子與宿主細胞的融合過程中進入新感染的細胞。因為HIV表現出高突變率，優選的是使用結合Env的功能受限部分的免疫球蛋白結構域，諸如結合來自多個HIV毒株的Env的寬泛中和抗體所證實的(vandenKerkhofT等，Retrovirology10：102(2013))。因為認為在受感染的細胞的表面上存在的Env呈遞空間上受限的表位(ChenW等，JVirol88：1125-39(2014))，優選的是，使用小于100kD且理想地小于25kD的結合區，諸如sdAb或VHH結構域。細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEnv：：KDEL的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區αEnv和志賀毒素效應子區連接在一起，并添加羧基端KDEL以形成細胞毒性蛋白。例如，通過表達編碼αEnv-結合蛋白SLT-1A：：αEnv：：KDEL的多核苷酸來生產融合蛋白。SLT-1A：：αEnv：：KDEL細胞毒性蛋白的表達使用前面實施例所述的細菌和/或無細胞蛋白翻譯系統實現。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEnv：：KDEL的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對Env+細胞和Env-細胞的結合特征。SLT-1A：：αEnv：：KDEL對Env+陽性細胞的Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與Env-細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αEnv：：KDEL細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。在該無細胞測定中SLT-1A：：αEnv：：KDEL對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEnv：：KDEL的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用Env+細胞確定SLT-1A：：αEnv：：KDEL的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用Env-細胞作為Env+細胞的對比，確定SLT-1A：：αEnv：：KDEL的選擇性細胞毒性特征。對于Env+細胞(取決于細胞系)和/或用于感染細胞使其成為Env+的HIV毒株，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達Env的細胞的CD50是在細胞表面上表達Env的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：αEnv：：KDEL的相對去免疫化。使用動物模型確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αEnv：：KDEL的體內效應通過向感染了猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的非人靈長動物施用SLT-1A：：αEnv：：KDEL檢測SLT-1A：：αEnv：：KDEL抑制HIV感染的應用(參見SellierP等，PLoSOne5：e10570(2010))。實施例15.包含去免疫化志賀毒素效應子多肽和來源于抗體αUL18的結合區的細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)并且包含一個或多個前述實施例所述的去免疫化氨基酸置換的去免疫化志賀毒素效應子多肽。免疫球蛋白型結合區αUL18來源于使用本領域已知的技術產生的針對細胞表面巨細胞病毒蛋白UL18的抗體，所述細胞表面巨細胞病毒蛋白UL18存在于感染了巨細胞病毒的人細胞上(YangZ，BjorkmanP，ProcNatlAcadSciUSA105：10095-100(2008))。人巨細胞病毒感染與多種癌癥和炎性病癥相關。細胞毒性蛋白SLT-1A：：αUL18：：KDEL的構建、生產和純化將免疫球蛋白型結合區αUL18與志賀毒素效應子區連接在一起，并添加羧基端KDEL以形成蛋白。例如，通過表達編碼αUL18-結合蛋白SLT-1A：：αUL18：：KDEL的多核苷酸產生融合蛋白。SLT-1A：：αUL18：：KDEL細胞毒性蛋白的表達使用前面實施例所述的細菌和/或無細胞蛋白翻譯系統實現。確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αUL18：：KDEL的體外特征通過基于熒光的流式細胞計量術，確定了本實施例的細胞毒性蛋白對巨細胞病毒蛋白UL18陽性細胞和巨細胞病毒蛋白UL18陰性細胞的結合特征。SLT-1A：：αUL18：：KDEL對巨細胞病毒蛋白UL18陽性細胞Bmax被測量為大約50,000-200,000MFI，具有在0.01-100nM的范圍內的KD，而在該測定中不存在與巨細胞病毒蛋白UL18陰性細胞的顯著結合。在如上面在前述實施例中所述的無細胞體外蛋白翻譯中確定了SLT-1A：：αUL18：：KDEL細胞毒性蛋白的核糖體滅活能力。本實施例的細胞毒性蛋白對無細胞蛋白合成的抑制作用是顯著的。SLT-1A：：αUL18：：KDEL對蛋白合成的IC50是大約0.1-100pM。使用細胞殺傷測定來確定細胞毒性蛋白SLT-1A：：αUL18：：KDEL的細胞毒性通過如上面在前述實施例中所述的一般細胞殺傷測定使用巨細胞病毒蛋白UL18陽性細胞確定SLT-1A：：αUL18：：KDEL的細胞毒性特征。另外，通過相同的一般細胞殺傷測定，使用巨細胞病毒蛋白UL18陰性細胞作為巨細胞病毒蛋白UL18陽性細胞的對比，確定SLT-1A：：αUL18：：KDEL的選擇性細胞毒性特征。對于巨細胞病毒蛋白UL18陽性細胞(取決于細胞系)，本實施例的細胞毒性蛋白的CD50是大約0.01-100nM。所述細胞毒性蛋白對于不在細胞表面上表達巨細胞病毒蛋白UL18的細胞的CD50是在細胞表面上表達巨細胞病毒蛋白UL18的細胞的大約10-10,000倍(更少的細胞毒性)。確定抗原性和/或免疫原性的降低如實施例4和6所述，使用蛋白質印跡分析、ELISA分析和鼠模型，相對于野生型志賀毒素效應子區多肽，確定SLT-1A：：αUL18：：KDEL的相對去免疫化。實施例16.靶向不同細胞型的去免疫化細胞毒性蛋白在本實施例中，志賀毒素效應子區是來源于志賀樣毒素1的A亞基(SLT-1A)、志賀毒素的A亞基(StxA)和/或志賀樣毒素2的A亞基(SLT-2A)并且具有破壞的B細胞表位區的任意組合的去免疫化志賀毒素效應子多肽。結合區來源于這樣的免疫球蛋白結構域：其來自選自表12的第1列的分子，且其結合在表12的第2列中指示的細胞外靶標生物分子。使用本領域已知的試劑和技術，任選地產生具有羧基端KDEL型信號基序和/或檢測促進劑的該實施例的示例性細胞毒性蛋白。如在前述實施例中所述，使用表達適當的細胞外靶標生物分子的細胞，檢測本實施例的示例性細胞毒性蛋白。例如，可以使用本實施例的示例性蛋白診斷和治療在表12的第3列中所示的疾病、病患和/或病癥。表12.細胞毒性蛋白用于細胞靶向的不同結合區盡管已經通過舉例說明的方式描述了本發明的一些實施方案，顯而易見，可以利用許多修改、變化和改編以及利用在本領域技術人員范圍內的眾多等同或替代方案實施本發明，而不背離本發明的精神或超出權利要求的范圍。所有出版物、專利和專利申請通過引用整體并入本文，達到如同明確地且單獨地指出每篇單獨的出版物、專利或專利申請通過引用整體并入的程度。美國臨時專利申請系列號61/777,130、61/932,000、61/951,110、61/951,121、62/010,918和62/049,325的公開內容各自通過引用整體并入本文。國際PCT專利申請系列號PCT/US2014/023198和PCT/US2014/023231的公開內容各自通過引用整體并入本文。關于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的來自GenBank(國家生物技術信息中心，美國)的所有可電子獲得的生物序列信息的完整公開內容各自通過引用整體并入本文。當前第1頁1 2 3