發明領域
本發明涉及通式(v)的化合物，其任選是藥學上可接受的鹽、溶劑合物、多晶型物、共用藥物(codrug)、共晶(cocrystal)、前藥、互變異構體、外消旋物、對映體或非對映體或其混合物的形式，
其可用于治療、改善或預防流感。此外，本發明還公開了特定的組合治療。
發明背景
最近一些年，流感病毒感染對全球的公共健康所造成的嚴重威脅已經凸顯在以下方面：首先，高致病性鳥甲型流感病毒h5n1病毒株向人類的持續性低傳播(在被感染的人中死亡率為63％，http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/en/)，第二，在2009年出乎預料地出現了新的大流行流感病毒株a/h1n1，其已經迅速擴散到全世界(http://www.who.int/csr/disease/swineflu/en/)。盡管該新病毒株具有高度接觸傳染性、但目前通常僅產生輕度疾患，然而這種病毒將來的演變是不可預期的。在一種嚴重得多的、但是高度合理的情形中，h5n1和相關的高致病性鳥流感病毒可能獲得了使其在人之間更容易傳播的突變或者新的a/h1n1可能變得毒力更強且僅單點突變將足以產生對奧塞米韋的抗性(neumann等,nature,2009(18；459(7249)931-939))；如許多季節性h1n1病毒株最近已經顯示的那樣(dharan等,thejournaloftheamericanmedicalassociation,2009年3月11日；301(10),1034-1041；moscona等,thenewenglandjournalofmedicine,2009(3月5日；360(10)pp.953-956))。在這種情況下，生產和使用疫苗的延遲(在a/h1n1的較有利的情況下為～6個月，對于h5n1而言仍然是沒有解決的問題)在人類生活和社會瓦解方面可能已經是災難性的代價。
廣泛公認的是，為了跨越可獲得新疫苗并治療嚴重情況以及克服病毒抗藥性問題之前的這段時間，需要更寬泛的抗流感藥選擇。因此，在獲得神經氨酸酶抑制劑后大制藥公司已經大半放棄了開發新的抗流感藥，但開發新的抗流感藥已經再次變得具有高度優先性。
開發抗病毒藥的一個良好起點是重要病毒蛋白質的結構信息。因此，例如流感病毒表面抗原神經氨酸酶的晶體結構測定(vonitzstein,m.等,(1993),nature,363,pp.418-423)直接導致了開發具有抗病毒活性的神經氨酸酶抑制劑，其阻止病毒從細胞中被釋放，但是不阻止病毒產生本身。隨后這些神經氨酸酶抑制劑以及它們的衍生物已經被開發成抗流感藥扎那米韋(glaxo)和奧塞米韋(roche)，它們目前被許多國家作為對抗可能的大流行病的一線防御措施進行儲備。然而，這些藥物僅縮短臨床疾病的持續時間。或者，其它種類的被批準的抗流感化合物(例如金剛烷胺和金剛乙胺)靶向于病毒m2離子通道蛋白，其位于病毒膜中，干擾細胞內病毒顆粒的脫殼。然而，由于其副作用和迅速發生抗藥性病毒突變體，它們已經不被廣泛使用(magden,j.等,(2005),appl.microbiol.biotechnol.,66,pp.612-621)。另外，已經證明另一些非特異性病毒藥物例如利巴韋林對治療流感和其它病毒感染有效(eriksson,b.等,(1977),antimicrob.agentschemother.,11,pp.946-951)。然而，可能是由于其嚴重的副作用，利巴韋林僅在少數幾個國家獲得批準(furuta等,antimicrobialagentsandchemotherapy,2005,p.981–986)。顯然，需要新的抗病毒化合物，優選對抗不同靶標的新的抗病毒化合物。
流感病毒以及托高土病毒(thogotovirus)和傳染性鮭魚貧血病毒屬病毒(isavirus)屬于正粘病毒科家族，正粘病毒科家族以及本雅病毒科(bunyaviridae)家族(包括漢灘病毒屬、內羅畢羊病病毒屬、正本雅病毒屬(orthobunyavirus)和白蛉熱病毒屬)尤其是負鏈rna病毒。它們的基因組被分段并以核糖核蛋白顆粒的形式出現，所述核糖核蛋白顆粒包括rna依賴性rna聚合酶，其進行(i)單鏈負義病毒rna(vrna)向病毒mrna中的初始拷貝(即，轉錄)和(ii)vrna復制。該酶是由亞單位pa、pb1和pb2構成的三聚體復合物，對病毒的生命周期而言至關重要，因為它負責病毒rna的復制和轉錄。在以前的工作中，已經鑒定所述聚合酶的兩個關鍵結構域的原子結構—pb2亞單位中的mrna帽結合結構域(guilligay等,naturestructural&molecularbiology2008；5月；15(5):500-506)和位于pa亞單位中的內切核酸酶活性部位(dias等,nature2009,458,914-918)，并且已經表征了它們的分子結構。這兩個部位對于流感病毒和某些該種類的其它病毒家族用于產生病毒mrna的獨特的“搶帽(cap-snatching)”模式、從而啟動mrna轉錄而言很重要。5'帽是已經被加入信使rna的5'末端的修飾的鳥嘌呤核苷酸。所述5'帽(也稱為rna帽或rnam7g帽)通過5'-5'-三磷酸鍵與第一個轉錄的核苷酸連接的末端7-甲基鳥苷殘基組成。病毒聚合酶與細胞mrna分子的5’rna帽結合并將rna帽連同10-15個核苷酸的一段序列一起斷裂。然后加帽的rna片段用作合成病毒mrna的引物(plotch,s.j.等,(1981),cell,23,pp.847-858；kukkonen,s.k.等(2005),arch.virol.,150,pp.533-556；leahy,m.b.等,(2005),j.virol.,71,pp.8347-8351；noah,d.l.等,(2005),adv.virusres.,65,pp.121-145)。
聚合酶復合物似乎是適宜的抗病毒藥靶標，因為它對于病毒mrna的合成和病毒復制而言非常重要，并且含有可能與宿主細胞蛋白中發現的功能活性部位顯著不同的多種功能活性部位(magden,j.等,(2005),appl.microbiol.biotechnol.,66,pp.612-621)。因此，例如，已經嘗試了用類似于pb1內的pa-結合結構域的25-氨基酸肽來干擾聚合物亞單位的裝配(ghanem,a.等,(2007),j.virol.,81,pp.7801-7804)。此外，還已經靶向于所述聚合酶的內切核酸酶活性，并且作為流感病毒中這一活性的選擇性抑制劑已經鑒定了一系列4-取代的2,4-二氧代丁酸化合物(tomassini,j.等,(1994),antimicrob.agentschemother.,38,pp.2827-2837)。另外，已經證明在delitschiaconfertaspora(一個真菌種類)的提取物中鑒定的flutimide(一種取代的2,6-二酮基哌嗪)抑制流感病毒的內切核酸酶(tomassini,j.等,(1996),antimicrob.agentschemother.,40,pp.1189-1193)。而且，已經嘗試了用核苷類似物例如2’-脫氧-2’-氟鳥苷干擾病毒轉錄(tisdale,m.等,(1995),antimicrob.agentschemother.,39,pp.2454-2458)。
wo2006/066414涉及某些羥基二氫吡啶并吡嗪-1,8-二酮，聲稱其適合用于抑制hiv整合酶。
ep-a-1544199公開了被描述為hiv整合酶抑制劑的特定的含氮稠環化合物。
本發明的一個目的是鑒定有效對抗流感且具有改善的藥理學性質的另外的化合物。
附圖簡要說明
圖1
用于quantigeneta測定法探針組設計的從頭合成的病毒mrna的序列：將標記延伸物(labelextender)(le)雜交至5'-端的來源于所提供的合成rna底物的加帽引物序列和從頭合成的病毒mrna的前幾個堿基(le1)和3'-端的多聚a尾(le2)。俘獲延伸物(captureextender)(ce1–9)特異性地雜交至基因特異性區并且同時將俘獲的rna固定至板上。封閉探針(bp)雜交至從頭合成的病毒mrna的不同段序列。用3'-rlmrace驗證了3'-端以斜體字顯示的序列(未顯示完整序列)。所述探針組由panomics以全部三個的混合物形式提供。
發明概述
因此，在第一個實施方案中，本發明提供了通式(v)的化合物。
應當理解的是，在本申請文件中，除非另有說明，否則術語“通式(v)的化合物”涵蓋藥學上可接受的鹽、溶劑合物、多晶型物、前藥、共用藥物、共晶、互變異構體、外消旋物、對映體或非對映體或者其混合物。
本發明的另一個實施方案涉及藥物組合物，其包含通式(v)的化合物，并且任選地包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑和/或載體。
通式(v)的化合物可用于治療、改善或預防流感。
已經令人驚奇地發現，具有特定連接基–(cr***r***)–r53的本發明的化合物具有改善的性質。特別地，與蛋白質的相互作用能被優化，從而產生更好的結合特性。與蛋白質的疏水結合袋中相關氨基酸的另外的相互作用能被建立，從而導致通過置換水分子增加與另外的熵因子的焓結合(enthalpicbinding)相互作用。
發明詳述
在下面詳細描述本發明之前，應當理解的是，本發明不限于本文所述的具體的方法、方案和試劑，因為它們可以變化。還應當理解的是，本文所用的術語是僅為了描述具體實施方案，不旨在限制本發明的范圍，其將僅由所附的權利要求書來限定。除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與本領域技術人員通常理解的含義相同的含義。
優選地，本文所用的術語如“amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms:(iupacrecommendations)”,leuenberger,h.g.w,nagel,b.和
除非上下文另有要求，否則在本說明書和隨后的權利要求書中，詞語“包含”及其變體例如“包括”和“含有”均應理解為表示包括所給出的整數或步驟或者整數組或步驟組，但是不排除任何其它整數或步驟或者整數組或步驟組。在下面的段落中，更詳細地定義了本發明的不同方面。如此定義的每個方面可以與任意另外的一個或多個方面組合，有清楚的相反說明時除外。特別地，所給出的任意優選的或有利的特征可以與任意另外的一個或多個優選的或有利的特征組合。
在本說明書的正文中引用了多個文獻。無論是上文引用的，還是下文引用的，將本文所引用的每篇文獻(包括所有專利、專利申請、科學出版物、制造商說明書、使用說明等)通過引用整體合并入本文中。本文中的任何內容均不應理解為承認這類公開內容構成本發明的現有技術。
定義
術語“烷基”指飽和的直鏈或支鏈碳鏈。
術語“環烷基”表示環形式的“烷基”。術語“環烷基”還包括其二環、三環和多環形式。除非另有規定，否則環烷基可具有3–10個碳原子，優選3–8個碳原子，更優選3–10個碳原子。
“hal”或“鹵素”表示f、cl、br和i。
術語“碳環基”涵蓋環系中不包含雜原子的任意烴環系。術語“碳環基”涵蓋飽和環(包括環烷基環)、不飽和環和芳族環(包括芳基環)。術語“碳環基”還包括其二環、三環和多環形式。多環形式的實例包括例如金剛烷基、
“雜環基”是指其中環中沒有碳原子、一個或多個碳原子已經被1或2個(對于3元環而言)、1、2或3個(對于4元環而言)、1、2、3或4個(對于5元環而言)或1、2、3、4或5個(對于6元環而言)以及1、2、3、4、5或6個(對于7元環而言)等相同或不同的雜原子代替的環，其中所述雜原子選自o、n和s。優選地，雜環基含有1、2或3個雜原子，更優選1或2個雜原子。術語“雜環基環”涵蓋飽和的、不飽和的環和芳族環(包括雜芳基環)。術語“雜環基”還包括其二環、三環和多環形式。實例包括吡咯、吡咯烷、氧雜環戊烷、呋喃、咪唑烷、咪唑、吡唑、
術語“芳基”優選指含有6個碳原子的芳族單環、含有10個碳原子的芳族二環環系或含有14個碳原子的芳族三環環系。實例有苯基、萘基或蒽基，優選苯基。
術語“雜芳基”優選指5或6元芳族環，其中環中的一個或多個碳原子已經被1、2、3或4個(對于5元環而言)或者1、2、3、4或5個(對于6元環而言)相同或不同的雜原子代替，其中所述雜原子選自o、n和s。優選地，雜芳基含有1、2或3個雜原子，更優選1或2個雜原子。
如果一個化合物或基團被稱為是“任選被取代的”，則它在每種情況下可以包括一個或多個所給出的取代基，其中所述取代基可以相同或不同。
術語“藥學上可接受的鹽”指本發明的化合物的鹽。適合的藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽，其可以例如通過將本發明的化合物的溶液與藥學上可接受的酸的溶液混合來形成，所述的藥學上可接受的酸例如鹽酸、硫酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。此外，在化合物帶有酸性基團的情況下，其適合的藥學上可接受的鹽可以包括堿金屬鹽(例如，鈉鹽或鉀鹽)；堿土金屬鹽(例如，鈣鹽或鎂鹽)；以及與適合的有機配體形成的鹽(例如，銨鹽、季銨鹽和使用抗衡陰離子如鹵素離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、磷酸根、硝酸根、烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的胺陽離子)。藥學上可接受的鹽的舉例說明性實例包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、丁酸鹽、乙二胺四乙酸鈣鹽(calciumedetate)、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、樟磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、克拉維酸鹽(clavulanate)、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、二鹽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、依托酸鹽、乙磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖庚酸鹽(glucoheptonate)、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、甘油磷酸鹽、乙醇酰阿散酸鹽(glycolylarsanilate)、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、己基間苯二酚鹽、哈胺(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、羥基萘酸鹽、碘化物、異硫代硫酸鹽(isothionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、2-萘磺酸鹽、萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、n-甲基葡糖胺銨鹽、油酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽(雙羥萘酸鹽)、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、硫酸鹽、堿式乙酸鹽(subacetate)、琥珀酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽、甲苯磺酸鹽、triethiodide、十一烷酸鹽、戊酸鹽等(參見例如s.m.berge等,"pharmaceuticalsalts",j.pharm.sci.,66,pp.1-19(1977))。
當本發明的化合物是結晶形式時，該結構可以含有溶劑分子。所述溶劑典型地是藥學上可接受的溶劑，尤其包括水(水合物)或有機溶劑。可能的溶劑合物的實例包括乙醇合物和異丙醇合物。
術語“共用藥物”指通過共價化學鍵鍵合的兩種或更多種治療化合物。詳細的定義可見于例如n.das等,europeanjournalofpharmaceuticalsciences,41,2010,571–588。
術語“共晶”指一種多組分晶體，其中所有組分當是其純形式時在環境條件下均是固體。這些組分以化學計量比或非化學計量比的靶標分子或離子(即，本發明的化合物)和一種或多種中性分子共晶形成物的形式共存。詳細討論可見于例如ningshan等,drugdiscoverytoday,13(9/10),2008,440-446和d.j.good等,cryst.growthdes.,9(5),2009,2252–2264中。
本發明的化合物也可以是前藥、即其在體內代謝成活性代謝物的化合物的形式。適合的前藥是例如酯、醚、膦酸酯和碳酸酯。潛在的前藥的詳細討論可以在j.rautio(編輯),prodrugsandtargeteddelivery,wiley-vch,2011,isbn：978-3-527-32603-7中找到。適合基團的更具體的實例尤其在us2007/0072831的第[0082]–[0118]段在標題前藥和保護基下給出。前藥的優選實例包括其中r51選自–c(o)–r、–c(o)–or、–po(ora)(orb)或–oc(o)or的化合物，其中r、ra和rb獨立地選自c1–6烷基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、芳基或雜芳基可以任選被取代，例如任選被–oh或o–c1–6烷基取代。r的實例包括c1–6烷基(ch3、叔丁基)、苯基、苯基–oh或苯基–och3。
通式(v)的化合物
本發明提供了通式(v)的化合物。
本發明提供了通式(v)的化合物，其中適用下面的定義。
r51選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)和–c(o)–(任選被取代的c1–6烷基)；優選r51選自–h和–c1–6烷基；更優選r51是–h。
r52選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)、–(ch2)q–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)、–(ch2)q–(任選被取代的c3–10碳環基)、–(ch2)p–or55和–(ch2)p–nr56r57；優選r52選自–h、–(ch2)q–(任選被取代的具有3-6個環原子的雜環基)和–c1–6烷基，更優選–h和–c1–6烷基。
r53是–l1–(cr*r**)t–r54。
r54選自–h、–cf3、–chf3、–ch2f、–cocf3、–(任選被取代的c3–20碳環基)和–(任選被取代的具有3-20個環原子的雜環基)；優選r54選自–h、–cf3、–(任選被取代的c3–6碳環基)和–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)。
r55選自–h、–c1–6烷基和–(ch2ch2o)rh。
r56選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)、–(任選被取代的c3–10碳環基)、–c1–4烷基–(任選被取代的c3–10碳環基)、–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)和–c1–4烷基–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)；r56優選是–h或–(任選被取代的c1–6烷基)，更優選–h或–c1–6烷基。
r57選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)、–(任選被取代的c3–10碳環基)、–c1–4烷基–(任選被取代的c3–10碳環基)、–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)和–c1–4烷基–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)；優選r57是–h或–(任選被取代的c1–6烷基)；更優選–h或–c1–6烷基。
r58選自–h和–c1–6烷基。
r59選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)、–(任選被取代的c3–10碳環基)、–c1–4烷基–(任選被取代的c3–10碳環基)、–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)和–c1–4烷基–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)；優選r59選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)、–(任選被取代的c3–10碳環基)、–c1–4烷基–(任選被取代的c3–10碳環基)。更優選r59選自–h、–(任選被取代的c1–4烷基)和–(任選被取代的c3–6碳環基)。
l1選自nr59、n(r59)c(o)、c(o)nr59、n(r59)so2、so2n(r59)和n(r59)so2n(r59)；優選l1是n(r59)so2。
x51選自nr56、n(r56)c(o)、c(o)nr56、o、c(o)、c(o)o、oc(o)、n(r56)so2、so2n(r56)、n(r56)so2n(r56)、s、so、so2和(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)–nr56。
r*每次出現時獨立地選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)、–(任選被取代的c3–10碳環基)、–c1–4烷基–(任選被取代的c3–10碳環基)、–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)和–c1–4烷基–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)；優選r*每次出現時獨立地選自–h、–(任選被取代的c1–4烷基)和–(任選被取代的c3–6碳環基)。
r**每次出現時獨立地選自–h、–(任選被取代的c1–6烷基)、–(任選被取代的c3–10碳環基)、–c1–4烷基–(任選被取代的c3–10碳環基)、–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)和–c1–4烷基–(任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基)；優選r**是h。
在另一個實施方案中，r*和r**可以任選形成任選被取代的c3–10碳環基或任選被取代的具有3-10個環原子的雜環基。
r***每次出現時獨立地是–h、–c1–6烷基或被一個或多個鹵素原子取代的–c1–6烷基。
p是1-4。
q是0-4。
r是1-3。
s是0-4。
t是0-6；優選t是0-4。
所述烷基可以任選被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自鹵素、–cn、–nr56r57、–oh、–o–c1–6烷基、–(c3–20碳環基)和–(具有3-20個環原子的雜環基)，優選的任選取代基包括鹵素、–cn、–nr56r57、–oh和–o–c1–6烷基。
所述雜環基和/或碳環基可以任選被一個或多個取代基取代，所述取代基獨立地選自鹵素、–cn、–cf3、–oh、–(ch2)s–x51–r58、–c1–6烷基、可以任選被鹵素取代的–c3–10碳環基、可以任選被鹵素取代的–c1–4烷基–c3–10碳環基、–(可以任選被鹵素取代的具有3-10個環原子的雜環基)和–c1–4烷基–(可以任選被鹵素取代的具有3-10個環原子的雜環基)。優選的任選取代基包括鹵素、–cn、–cf3、–oh、–ch2oh、–c1–6烷基和可以任選被鹵素取代的–c3–10碳環基。
上面的定義和優選定義的所有組合也是本發明的發明人的構思。
本發明的發明人已經令人驚奇地發現，具有特定的連接基–(cr***r***)–r53的本發明的化合物與不具有這類連接基的相應化合物相比具有改善的藥理學性質。不希望受理論的束縛，認為本申請的化合物不僅提供雙金屬結合，而且提供促成配體的內在結合性質的疏水性相互作用。將雙金屬首基與大的疏水性取代基組合的更靈活的連接基提供了更高的構象靈活性，從而提供了正確的載體，其適于特異性相互作用并且以更優的方式通過更高的構象靈活性與結合袋的幾個氨基酸相互作用，但不釋放熵貢獻(一個分子)。
本發明的化合物可以以藥物組合物的形式施用于患者，所述藥物組合物可任選包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑和/或載體。
本發明的化合物可以通過各種公知的途徑施用，包括口服、直腸、胃內(intragastrical)、顱內和腸胃外施用，例如靜脈內、肌內、鼻內、真皮內、皮下，以及類似的施用途徑。特別優選的是口服、鼻內和腸胃外施用。根據施用途徑的不同，需要不同的藥物制劑，這些施用途徑中的一些可能需要給藥物制劑涂敷保護性包衣以防止本發明的化合物在例如消化道內降解。
因此，優選地，本發明的化合物被配制成糖漿、輸液或注射液、噴霧劑、片劑、膠囊、膠囊形片劑(capslet)、錠劑、脂質體、栓劑、膏藥、繃帶(band-aid)、延遲釋放膠囊(retardcapsule)、散劑或緩慢釋放制劑。優選地，稀釋劑是水、緩沖劑、緩沖鹽溶液或鹽溶液，載體優選選自可可脂和vitebesole。
用于施用本發明的化合物的特別優選的藥物形式是適合注射使用的形式，包括無菌的水性溶液或分散體和用于即時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。在所有情況中，最終的溶液或分散體形式必須是無菌的并且是流體。典型地，這類溶液或分散體將包含溶劑或分散介質，其含有例如水-緩沖水溶液例如生物相容性的緩沖劑、乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其適合的混合物，表面活性劑或植物油。本發明的化合物也可以被配制成脂質體，特別是用于腸胃外施用的脂質體。脂質體提供在循環中半衰期增加的優點(如果與游離藥物相比)以及所包裹的藥物的延長的更均勻的釋放。
輸液和注射液的滅菌可以通過任意數量的本領域公認的技術來實現，包括但不限于加入防腐劑如抗細菌劑或抗真菌劑，例如尼泊金酯(parabene)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸或硫柳汞(thimersal)。此外，還可以在輸液和注射液中摻入等張劑，例如糖或鹽，特別是氯化鈉。
含有一種或多種本發明的化合物的無菌注射液的生產通過以下方法完成：將所需量的各化合物摻入酌情具有上面列出的各種成分的適宜溶劑中，然后滅菌。為了獲得無菌粉末，將上述溶液按照需要真空干燥或冷凍干燥。本發明的優選的稀釋劑是水、生理學上可接受的緩沖劑、生理學上可接受的緩沖鹽溶液或鹽溶液。優選的載體是可可脂和vitebesole。可以與本發明的化合物的各種藥物形式一起使用的賦形劑可選自下面的非限制性列表：
a)粘合劑，例如乳糖、甘露醇、結晶山梨醇、磷酸氫鹽、磷酸鈣鹽(calciumphosphates)、糖、微晶纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等；
b)潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸、氫化植物油、亮氨酸、甘油酯和硬脂酰醇富馬酸鈉，
c)崩解劑，例如淀粉、交聯羧甲基纖維素、甲基纖維素鈉、瓊脂、膨潤土、海藻酸、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
在一個實施方案中，制劑用于口服施用，并且制劑包含下列成分中的一種或多種或全部：預膠化淀粉、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮k30、交聯羧甲基纖維素鈉、硬脂酰醇富馬酸鈉、明膠、二氧化鈦、山梨醇、檸檬酸一鈉、黃原膠、二氧化鈦、矯味劑、苯甲酸鈉和糖精鈉。
如果在一個優選的實施方案中本發明的化合物被鼻內施用，其可以以干粉末吸入器或來自使用適合的拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷如1,1,1,2-四氟乙烷(hfa134atm)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(hfa227eatm)、二氧化碳、或其它適合的氣體的加壓容器、泵、噴霧器或霧化器中的噴霧劑的形式被施用。所述的加壓容器、泵、噴霧器或霧化器可以含有本發明的化合物的溶液或混懸液，例如使用乙醇和拋射劑作為溶劑的溶液或混懸液，其還可以含有潤滑劑，例如三油酸山梨坦。
其它適合的賦形劑可見于美國藥學協會(americanpharmaceuticalassociation)出版的藥物賦形劑手冊(handbookofpharmaceuticalexcipients)，通過引用將其合并入本文。
應當理解的是，根據可用本發明的化合物之一治療的障礙的嚴重性和具體類型，以及根據待治療的各個患者例如患者的總體健康狀態等，需要不同劑量的各化合物來產生治療或預防效果。適宜劑量的確定由主治醫師酌情確定。認為在本發明的治療或預防應用中本發明的化合物的劑量應當在約0.1mg至約1g活性成分(即，本發明的化合物)/千克體重范圍內。然而，在一個優選的本發明的應用中，將本發明的化合物以1.0-500mg/kg體重、優選1-200mg/kg體重的量施用于需要其的個體。用本發明的化合物治療的持續時間將根據所治療的疾病的嚴重性以及每個單個患者的情況和特質反應而變化。在一個優選的預防或治療應用的實施方案中，每天給成年人口服施用10mg–200mg化合物，這取決于疾病的嚴重性和/或暴露于疾病載體的程度。
如本領域中已知的那樣，給定化合物的藥學有效量還取決于施用途徑。一般而言，如果施用是通過胃腸道(例如用栓劑)、直腸或通過胃內探針進行，則所需的量較高，如果施用途徑是腸胃外例如靜脈內，則所需的量較低。典型地，如果使用直腸或胃內施用，則本發明的化合物將以50mg–1g/kg體重、優選10mg–500mg/kg體重被施用，如果使用腸胃外施用，則本發明的化合物將以1–100mg/kg體重被施用。對于鼻內施用，使用1–100mg/kg體重。
如果已知一個人具有發生可用本發明的化合物治療的疾病的風險，則可以預防性施用生物學活性血清或本發明的藥物組合物。在這些情況下，本發明的各化合物優選以天為基礎以上述優選的和特別優選的劑量被施用。優選地，每天一次0.1mg–1g/kg體重，優選10–200mg/kg體重。該施用可以持續至發生各病毒性障礙的風險已經減小。然而，在大部分情況下，在已經診斷出疾病/障礙后施用本發明的化合物。在這些情況中，優選的是每天施用首劑量的本發明的化合物一次、兩次、三次或四次。
本發明的化合物特別可用于治療、改善或預防流感，特別是甲型、乙型和丙型流感病毒。在本發明內，術語“流感”包括由任意流感病毒例如甲型、乙型和丙型流感病毒(包括它們的各種病毒株和分離物(isolate))導致的流感，還涵蓋通常被稱為鳥流感(birdflu)和豬流感的甲型流感病毒株。對待治療的個體沒有特別限制，其可以是任意脊椎動物，例如鳥和哺乳動物(包括人)。
不希望受理論束縛，認為本發明的化合物能抑制內切核酸酶活性、特別是流感病毒的內切核酸酶活性。更具體地，認為它們直接干擾具有內切核酸酶活性且對于流感病毒復制而言所必需的流感病毒pa蛋白的n-末端部分。流感病毒復制在細胞內發生在細胞核內。因此，被設計用于抑制pa內切核酸酶活性的化合物需要跨過細胞膜和核膜二者，該性質主要取決于設計的所述化合物的物理化學性質。
式(v)的化合物的體外內切核酸酶抑制活性的一種可能測定法是本文所公開的基于fret(熒光共振能量轉移)的內切核酸酶活性測定法。優選地，在該fret測定法中所述化合物在25μm下表現出至少約50％的％降低。在該語境中，％降低是被測量為與未處理的樣品相比化合物處理后被流感病毒內切核酸酶亞單位(pa-nter)裂解的雙標記的rna底物的熒光增加的初始反應速度(v0)的％降低。優選地，在該測定法中所述化合物表現出小于約50μm、更優選小于約20μm的ic50。半數最大抑制濃度(ic50)是化合物抑制生物學或生物化學功能的有效性的量度，是由從最大100μm–至少2nm范圍內的給定濃度系列的初始反應速度(v0)計算得到的。
通式(v)的化合物可以與一種或多種其它藥劑組合使用。對所述的其它藥劑的類型沒有特別限制，取決于待治療的障礙。優選地，所述的其它藥劑是可用于治療、改善或預防由流感病毒感染導致的流感和與該病毒感染相關的病癥例如病毒性肺炎或繼發性細菌性肺炎的另外的藥劑以及治療諸如受寒、發熱、咽喉痛(sorethroat)、肌肉疼痛、嚴重頭痛、咳嗽、虛弱和疲勞等癥狀的藥劑。此外，通式(v)的化合物可以與抗炎藥組合使用。
下面的藥劑組合被認為是特別適合的：
(i)內切核酸酶和帽結合抑制劑(特別是靶向于流感的)的組合。對所述的內切核酸酶抑制劑沒有特別限制，可以是任意內切核酸酶抑制劑，特別是任意病毒內切核酸酶抑制劑。優選的內切核酸酶抑制劑是美國申請us2013/0102600、us2013/0317022、us2013/0317021和us2014/0038990中所定義的那些。通過引用將這些申請的全部公開內容合并入本文。特定地，將這些美國申請的關于化合物通式、各取代基的優選實施方案以及所述化合物的醫學效用和優點的所有描述通過引用合并入本文。
另外的優選的內切核酸酶抑制劑是美國序號61/750,023(2013年1月8日提交)中所定義的通式(ii)的化合物和美國序號61/750,023(2013年1月8日提交)中所定義的通式(v)的化合物，通過引用將其全部公開內容合并入本文。特定地，將關于這些化合物的通式、各取代基的優選實施方案以及所述化合物的醫學效用和優點的所有描述通過引用合并入本文。這些化合物可以任選地是藥學上可接受的鹽、溶劑合物、多晶型物、共用藥物、共晶、前藥、互變異構體、外消旋物、對映體或非對映體或者其混合物的形式。
對所述的帽結合抑制劑也沒有特別限制，可以是任意帽結合抑制劑，特別是任意病毒帽結合抑制劑。優選的帽結合抑制劑是美國申請2013/0102601中所定義的通式(ii)的那些和/或wo2011/000566中所公開的化合物，通過引用將其全部公開內容合并入本文。特定地，將關于us2013-0102601或wo2011/000566的化合物的通式、各取代基的優選實施方案以及所述化合物的醫學效用和優點的所有描述通過引用合并入本文。
在大流行的和季節性出現的病毒株二者中均出現了對兩類獲得許可的流感抗病毒藥(m2離子通道抑制劑(金剛烷類)和神經氨酸酶抑制劑(例如奧塞米韋))的廣泛抗藥性，使得這些藥物在治療方式中僅具有最低限度的效用。對于m2離子通道抑制劑而言，病毒抗藥性的頻率自從2003年以來一直在增加，對于季節性流感a/h3n2而言，金剛烷類現在被認為是無效的。實際上，所有2009h1n1和季節性h3n2病毒株均對金剛烷類(金剛乙胺和金剛烷胺)具有抗藥性，對于奧塞米韋(最廣泛被開具處方的神經氨酸酶抑制劑(nai))，who報告了在2007/2008流感季節開始的顯著出現的流感a/h1n1抗藥性；并且在南半球持續了2008年的第二和第三季度。在2008年的第四季度公開了甚至更嚴重的數字(北半球)，其中所有測試的分離物的95％顯示對奧塞米韋不敏感。考慮到現在大多數國家的政府已經作為它們的流感大流行準備計劃的一部分儲備奧塞米韋的事實，顯然對新的有效藥物的需求大大增加。為了解決對更有效的療法的需求，已經用具有不同作用機制的抗病毒藥的二聯或甚至三聯組合進行了初步研究。對金剛烷類和神經氨酸酶抑制劑的組合在體外和體內進行了分析，發現它們高度協同作用。然而，已知的是，非常迅速地出現了對這兩類抗病毒藥均有抗藥性的病毒，這一問題無法通過組合使用這些已有的抗病毒藥來解決。
流感病毒聚合酶抑制劑是靶向于聚合酶的轉錄活性的新藥。針對病毒聚合酶的帽結合和內切核酸酶活性部位的選擇性抑制劑通過停止病毒增殖周期而大幅度地減弱病毒感染。這兩個靶標位于聚合酶復合物的不同亞單位內，因此代表獨特的藥物靶標。由于兩個功能都是所謂的“搶帽”機制(其是病毒轉錄所必需的)所需要的這一事實，預期同時抑制兩種功能會高度協同地起作用。這種高度有效的藥物組合將導致更低的物質濃度，并且因此導致改善的劑量-響應關系和更佳的副作用特性。
在所有甲型流感病毒株(例如鳥和人)、甚至乙型流感病毒中這兩個活性部位都是高度保守的，因此這種高度的序列保守性為這些靶標不可能引發迅速抗藥病毒產生的認知提供了依據。另外，與宿主蛋白質的緊密相互作用使得這些病毒蛋白質更不容易突變。因此，無論是何種病毒株，各自和組合使用的內切核酸酶和帽結合抑制劑是對抗季節性和大流行流感這二者的理想藥物候選物。
內切核酸酶抑制劑和帽結合抑制劑的組合或靶向于內切核酸酶活性部位和帽結合結構域二者的雙重特異性聚合酶抑制劑將有效對抗對金剛烷類和神經氨酸酶抑制劑有抗藥性的病毒株，而且合并了對產生抗藥性的低敏感性的優點與對抗寬范圍的病毒株的活性。
(ii)不同抗病毒靶標的抑制劑(特別是靶向于流感的)的組合集中于作為雙或多組合療法的具有(優選流感病毒)聚合酶抑制劑的組合。流感病毒聚合酶抑制劑是靶向于聚合酶轉錄和復制活性的新藥。針對病毒聚合酶的選擇性抑制劑通過停止病毒增殖周期而大幅度地減弱了病毒感染。預計特別針對病毒細胞內靶標的聚合酶抑制劑與不同抗病毒靶標的抑制劑的組合高度協同地起作用。這基于以下事實：這些不同類型的抗病毒藥表現出完全不同的作用機制，其需要有利地、協同地作用于所述組合的抗病毒功效的不同的藥動學性質。
這種高度有效的藥物組合會導致更低的物質濃度，并且從而導致改善的劑量-響應關系和更佳的副作用特性。此外，以上針對聚合酶抑制劑所述的優點普遍存在于不同抗病毒靶標的抑制劑與聚合酶抑制劑的組合中。
典型地，將選自第一組聚合酶抑制劑的至少一種化合物(例如，帽結合和內切核酸酶抑制劑)與選自第二組聚合酶抑制劑的至少一種化合物組合。
能用于該類型的組合療法的所述的第一組聚合酶抑制劑包括但不限于通式(v)的化合物。
能用于該類型的組合療法的所述的第二組聚合酶抑制劑包括但不限于美國申請us2013/0102600中所定義的通式(v)的化合物、美國申請us2013/0102601中所定義的通式(ii)的化合物、wo2011/000566、wo2010/110231、wo2010/110409、wo2006/030807或us5,475,109中所公開的化合物以及flutimide及其類似物、法匹拉韋(favipiravir)及其類似物、表棓兒茶素棓酸酯(epigallocatechingallate)及其類似物、以及核苷類似物例如利巴韋林。
(iii)聚合酶抑制劑與神經氨酸酶抑制劑的組合
流感病毒聚合酶抑制劑是靶向于聚合酶的轉錄和復制活性的新藥。預計特異性地針對病毒細胞內靶標的聚合酶抑制劑與不同的細胞外抗病毒靶標、尤其是(例如病毒)神經氨酸酶的抑制劑的組合高度協同地起作用。這基于以下事實：這些不同類型的抗病毒藥表現出完全不同的作用機制，其需要有利地、協同地作用于所述組合的抗病毒功效的不同的藥動學性質。
這種高度有效的藥物組合會導致更低的物質濃度，并且從而導致改善的劑量-響應關系和更佳的副作用特性。此外，以上針對聚合酶抑制劑所述的優點普遍存在于不同抗病毒靶標的抑制劑與聚合酶抑制劑的組合中。
典型地，將選自上述的第一組聚合酶抑制劑的至少一種化合物與至少一種神經氨酸酶抑制劑組合。
對所述的神經氨酸酶抑制劑(特別是流感神經氨酸酶抑制劑)沒有特別限制。實例包括扎那米韋、奧塞米韋、帕拉米韋(peramivir)、kdndana、fana和環戊烷衍生物。
(iv)聚合酶抑制劑與m2通道抑制劑的組合
流感病毒聚合酶抑制劑是靶向于聚合酶的轉錄和復制活性的新藥。預計特異性地針對病毒細胞內靶標的聚合酶抑制劑與不同的細胞外和細胞質抗病毒靶標、尤其是病毒m2離子通道的抑制劑的組合高度協同地起作用。這基于以下事實：這些不同類型的抗病毒藥表現出完全不同的作用機制，其需要有利地、協同地作用于所述組合的抗病毒功效的不同的藥動學性質。
這種高度有效的藥物組合會導致更低的物質濃度，并且從而導致改善的劑量-響應關系和更佳的副作用特性。此外，以上針對聚合酶抑制劑所述的優點普遍存在于不同抗病毒靶標的抑制劑與聚合酶抑制劑的組合中。
典型地，將選自上述的第一組聚合酶抑制劑的至少一種化合物與至少一種m2通道抑制劑組合。
對m2通道抑制劑(特別是流感m2通道抑制劑)沒有特別限制。實例包括金剛烷胺和金剛乙胺。
(v)聚合酶抑制劑與α葡糖苷酶抑制劑的組合流感病毒聚合酶抑制劑是靶向于聚合酶的轉錄和復制活性的新藥。預計特異性地針對病毒細胞內靶標的聚合酶抑制劑與不同的宿主細胞靶標、尤其是α葡糖苷酶的抑制劑的組合高度協同地起作用。這基于以下事實：這些不同類型的抗病毒藥表現出完全不同的作用機制，其需要有利地、協同地作用于所述組合的抗病毒功效的不同的藥動學性質。
這種高度有效的藥物組合會導致更低的物質濃度，并且從而導致改善的劑量-響應關系和更佳的副作用特性。此外，以上針對聚合酶抑制劑所述的優點普遍存在于與病毒復制相互作用的細胞靶標的抑制劑與聚合酶抑制劑的組合中。
典型地，將選自上述的第一組聚合酶抑制劑的至少一種化合物與至少一種α葡糖苷酶抑制劑組合。
對α葡糖苷酶抑制劑沒有特別限制。實例包括chang等,antiviralresearch2011,89,26-34中所述的化合物。
(vi)聚合酶抑制劑與其它流感靶標的配體的組合
流感病毒聚合酶抑制劑是靶向于聚合酶的轉錄和復制活性的新藥。預計特異性地針對病毒細胞內靶標的聚合酶抑制劑與不同的細胞外、細胞質或細胞核抗病毒靶標的抑制劑的組合高度協同地起作用。這基于以下事實：這些不同類型的抗病毒藥表現出完全不同的作用機制，其需要有利地、協同地作用于所述組合的抗病毒功效的不同的藥動學性質。
這種高度有效的藥物組合會導致更低的物質濃度，并且從而導致改善的劑量-響應關系和更佳的副作用特性。此外，以上針對聚合酶抑制劑所述的優點普遍存在于不同抗病毒靶標的抑制劑與聚合酶抑制劑的組合中。
典型地，將選自上述的第一組聚合酶抑制劑的至少一種化合物與至少一種另外的流感靶標的配體組合。
對另外的流感靶標的配體沒有特別限制。實例包括作用于唾液酸酶融合蛋白的化合物(例如，fludase(das181)、sirna和硫代磷酸寡核苷酸)、信號轉導抑制劑(例如，erbb酪氨酸激酶、abl激酶家族、map激酶、pkca-介導的erk信號發放的活化)以及干擾素(誘導物)。
(vii)(優選流感)聚合酶抑制劑與用作最小化疾病癥狀的輔藥(adjuvant)的化合物(抗生素、抗炎藥如cox抑制劑(例如，cox-1/cox-2抑制劑、選擇性cox-2抑制劑)、脂氧化酶抑制劑、ep配體(特別是ep4配體)、緩激肽配體和/或大麻素配體(例如，cb2激動劑)的組合。流感病毒聚合酶抑制劑是靶向于聚合酶的轉錄和復制活性的新藥。特異性地針對病毒細胞內靶標的聚合酶抑制劑與用作最小化疾病癥狀的輔藥的化合物的組合解決了病毒感染的起因性和癥狀性病理結果。預計該組合協同地其作用，因為這些不同類型的藥物表現出完全不同的作用機制，其需要有利地、協同地作用于所述組合的抗病毒功效的不同的藥動學性質。
這種高度有效的藥物組合會導致更低的物質濃度，并且從而導致改善的劑量-響應關系和更佳的副作用特性。此外，以上針對聚合酶抑制劑所述的優點普遍存在于不同抗病毒靶標的抑制劑與聚合酶抑制劑的組合中。
在不脫離本發明的范圍的情況下本發明的各種調整和變型對于本領域技術人員而言是顯而易見的。盡管已經使用具體的優選實施方案對本發明進行了描述，但是應當理解的是要求保護的發明不應當被不合理地局限于這些具體的實施方案。實際上，對于相關領域的技術人員而言顯而易見的所述的實施本發明的方式的各種調整也被本發明所涵蓋。
下面的實施例僅用于對本發明進行舉例說明，絕不應當理解為是對所附的權利要求所給出的本發明范圍的限制。
實施例
fret內切核酸酶活性測定法
如dias等,nature2009；4月16日；458(7240),914-918中所述的那樣制備并純化了具有流感內切核酸酶活性的甲型流感病毒(iav)pa-nter片段(氨基酸1–209)。將該蛋白質溶解在含有20mmtrisph8.0、100mmnacl和10mmβ-巰基乙醇的緩沖液中，將等分試樣貯存在–20℃。
將20個堿基的用5′-fam熒光團和3′-bhq1猝滅劑雙重標記的rnaoligo作為通過pa-nter的內切核酸酶活性被裂解的底物。rna底物的裂解從猝滅劑中釋放出熒光團，從而導致熒光信號增加。
將所有測定組分稀釋在含有20mmtris-hclph8.0、100mmnacl、1mmmncl2、10mmmgcl2和10mmβ-巰基乙醇的測定緩沖液中。pa-nter的終濃度是0.5μm和1.6μmrna底物。將測試化合物溶解在dmso中，一般在兩個濃度或者濃度系列下測試，從而使得最終的板孔dmso濃度是0.5％。在其中化合物在該濃度下不溶解的那些情況中，將它們在最高可溶的濃度下進行測試。
在一式八份的白色384孔微量滴定板(perkinelmer)的孔中提供5μl每種化合物稀釋液。加入pa-nter稀釋液后，將板密封并在室溫下孵育30min，然后加入1.6μm用測定緩沖液稀釋的rna底物。隨后，在微量滴定板讀數器(synergyht,biotek)中在485nm的激發波長和535nm的發射波長下測量裂解的rna的增加的熒光信號。動力學讀數間隔是35秒，敏感度是35。使用20min期間的熒光信號數據計算底物裂解的初始速度(v0)。最終讀數是與未處理的樣品相比化合物處理的樣品的v0的％降低。半數最大抑制濃度(ic50)是化合物抑制生物學或生物化學功能的有效性的量度，并且由最大100μm–至少2nm范圍內的給定濃度系列下的初始反應速度(v0)計算得到。
細胞致病作用(cpe)測定法
甲型流感病毒(iav)獲自美國組織培養物保藏中心(americantissueculturecollection)(a/aichi/2/68(h3n2)；vr-547)。通過以下方法制備病毒儲備液：在mardin-darby犬腎(mdck；atccccl-34)細胞上繁殖病毒，如reed,l.j.和h.muench.1938,am.j.hyg.27:493-497中所述用50％組織培養物感染劑量(tcid50)分析測定病毒儲備液的感染滴度。
用含有10％胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺和1％抗生素(全部來自paa)的dmem/ham’sf-12(1:1)培養基將mdck細胞以2×104個細胞/孔接種在96孔板中。直至感染前，將細胞在37℃、5.0％co2下孵育5小時，從而在孔的底部形成～80％匯合單層。將每種測試化合物溶解在dmso中，一般在25μm和250μm下進行測試。在其中化合物在該濃度下不溶的那些情況中，將它們在最高可溶濃度下進行測試。將化合物稀釋在感染培養基(dmem/ham’sf-12(1:1)，含有5μg/ml胰蛋白酶和1％抗生素)中，以便最終板孔dmso濃度為1％。將病毒儲備液稀釋在感染培養基(dmem/ham’sf-12(1:1)，含有5μg/ml胰蛋白酶、1％dmso和1％抗生素)中，以便理論感染復數(moi)為0.05。
除去培養基并且用pbs進行一個洗滌步驟后，將病毒和化合物一起加入到細胞中。在用于細胞毒性測定的孔中(即，不存在病毒感染)，不加入病毒混懸液。代之以加入感染培養基。每個處理均一式兩份地進行。在37℃、5％co2下孵育48小時后，用顯微鏡觀察每個孔的表觀細胞毒性、沉淀物形成或其它值得注意的異常。然后，用celltiter-glo發光細胞生存力測定法(promega)測定細胞生存力。小心地取出上清液，向每個孔中加入65μl重構的試劑，在溫和振搖下于室溫孵育15min。然后，將60μl溶液轉移到不透明的板中，用synergyht板讀數器(biotek)測量發光(rlu)。
用與未感染的未處理的細胞相比的未感染的處理的細胞的相對細胞生存力值評價化合物的細胞毒性。將在測試濃度下相對生存力低于80％的物質視為是細胞毒性的，在更低濃度下再進行測試。
如下計算經化合物處理的病毒介導的細胞致病作用(cpe)的降低：從感染的處理的樣品的響應(rlu)中減去感染的未處理的樣品的響應(rlu)，然后用相應的未感染的樣品的生存力歸一化，得到％cpe降低。半數最大抑制濃度(ic50)是化合物抑制生物學或生物化學功能的有效性的量度，是由最大100μm–至少100nm范圍內的給定濃度系列的rlu響應計算得到的。
ic50值的測定–轉錄測定法(ta測定法)
ta測定法原理
為了分析所述抑制劑的活性，使用完整的rnp復合物在不含細胞的環境中進行轉錄測定法(ta)，但不使用放射性標記的核苷酸。
體外合成的加帽的mrnaoligo用作病毒mrna合成的引物，同時使用
材料和方法
化合物
所有化合物均溶于dmso并且貯存在4℃。所有其它試劑均得自sigma–aldrich，另有說明的除外。
rna底物的制備
所用的底物rna來源于根據制造商的方案(但使用16hr的延長的孵育時間)生產的用t7高收率rna合成試劑盒(newenglandbiolabsinc.)合成的體外轉錄的rna。使用mirneasy小型試劑盒(qiagen)凝膠純化rna產物。使用scriptcapm7g加帽系統(cellscript,madisonwi)以酶促方式給rna加帽。得到的加帽的rna寡核苷酸(5’-m7gpppg-gggaauacucaagcuaugcaucgcauuaggcacgucgaagua-3‘；seqidno:1)用作流感病毒聚合酶的引物。
rnp的制備
所有實驗均用iav株a/pr/8/34進行，其在含胚雞蛋中擴增或由charlesriverlaboratories純化和濃縮獲得。將蛋-擴增的病毒用4％w/vpeg8000在含有100mmnacl的2mmtris-hcl(ph8.0)緩沖液中進行peg-沉淀(4℃,45min)，在4℃以3600g離心45min。將沉淀物混懸在含有100mmnacl和6％w/v蔗糖的10mmtris-hcl(ph8.0)緩沖液中，然后通過30％w/v蔗糖墊純化(109,000g,120min,4℃)。
如之前所公開的那樣(進行一些調整)(klumpp等2001.influenzavirusendoribonuclease,p.451-466,342ed.)進行rnp純化。將病毒凍干物以2mg/ml的病毒蛋白質終濃度溶解在1x裂解緩沖液(1％w/vtritonx-100,1mg/ml溶血卵磷脂,2.5mmmgcl2,100mmkcl,5mmdtt,2.5％v/v甘油,20mmtris-hcl(ph8.0),20u/mlrnase抑制劑)中，然后在30℃孵育60分鐘。將3.3ml得到的裂解物荷載至甘油梯度(2ml70％v/v，1.5ml50％v/v，0.75ml40％v/v和3.6ml33％v/v–在20mmtris-hcl、50mmnacl、5mmdtt、5mm2-巰基乙醇中緩沖)。在4℃、240,000g下用sorvall超速離心機ah641轉子將所述梯度旋轉6小時。從梯度上部收集級分(0.5ml)。將含有rnp顆粒的級分合并，用10kdvivaspin2柱進一步濃縮，貯存在-20℃。通過uv光譜法測定rnp濃度，使用1.0＝60mg/mlrnp的od260nm作為換算因子(klumpp等2001.influenzavirusendoribonuclease,p.451-466,342ed.)。
rna分析和轉錄測定法(ta測定法)
通過
對于標準反應，將80pmrnp在30℃下與在反應緩沖液(55mmtris-hcl,20mmkcl,1mmmgcl2,0.2％v/vtritonx-100,0.25u/μlrnaseout,12.5mmnacl,1.25mmdtt,1.25mm2-巰基乙醇,12.5％v/v甘油)中的1％v/v最終dmso濃度的抑制劑稀釋液系列一起孵育2小時。然后加入2nm加帽的rna底物，然后在30℃下孵育2小時。通過在95℃下孵育5min終止反應。
為了檢測合成的mrna，將
使用graphpadprism分析響應值(相對發光單位)，以便使用4-參數邏輯方程測定ic50值和95％置信區間。包括陽性對照和陰性對照以便定義用于擬合曲線的上限值和下限值。
通過將純化的rnp與已知序列的加帽的rna底物一起孵育生成了從頭合成的病毒mrna。
本發明的化合物的ta測定法結果
使用上述ta測定法，測定了本發明的化合物的ic50值。
合成實施例
在下文中，除非給出具體的合成方法，否則化合物是按照通用方案制備的。
方案：
通用操作：
e-1-012的合成：
向2-氨基乙醇(6.1g,0.1mol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中緩慢地加入二碳酸二叔丁酯(tert-butyldicarbonate)(21.8g,0.1mol)。將得到的混合物在室溫攪拌過夜。減壓除去有機溶劑，得到期望的粗產物e-1-012(16.0g,99％)，為無色油狀物，將其不經進一步純化即用于下一步。
e-1-013的合成：
在0℃向e-1-012(16.0g,0.1mol)和et3n(20.2g,0.2mol)在二氯甲烷(180ml)中的混合物中加入mscl(12.0g,0.105mol)。將該溶液溫熱至室溫，攪拌3h。用水稀釋所得物，用ch2cl2萃取。用hcl水溶液(1mol/l)和鹽水洗滌有機相。用無水na2so4干燥后，真空除去溶劑，得到e-1-013(21.0g,88％)，為無色油狀物。
e-1-014的合成：
向e-1-013(20g,87.5mmol)在ch3cn(350ml)中的溶液中依次加入k2co3(36g,262mmol)和丙烷-2-胺(15.5g,262mmol)。將得到的混合物在80℃攪拌12h。過濾該混合物，濃縮濾液，得到e-1-014(15g,85％)，為無色油狀物。
e-1-001的合成：
向sm-1(142g,1mol)在二氯甲烷(1000ml)中的溶液中滴加亞硫酰氯(236g,2mol)。將該溶液在室溫攪拌6h。過濾混合物，用石油醚洗滌殘余物，得到e-1-001(144g,90％)，為白色固體。
e-1-002的合成：
向e-1-001(16.0g,0.10mol)在dmf中的溶液中加入nan3(7.2g,0.11mol)。將混合物在室溫攪拌6h，然后用h2o稀釋。過濾所得物。用h2o和pe洗滌殘余物，得到e-1-002(13.3g,80％)，為淡黃色固體。
e-1-004的合成：
在0℃向e-1-002(16.0g,0.095mol)在甲醇(100ml)中的溶液中加入naoh(4.2g,0.100mol)在h2o(12ml)中的溶液。將混合物在0℃攪拌15分鐘，加入35％甲醛溶液(20ml)。此后，將混合物溫熱至室溫，攪拌過夜。用37％hcl溶液將所得物調整至ph＝1。減壓除去有機溶劑，用etoac萃取殘余物。濃縮有機相，得到e-1-003粗產物，不進一步純化。向上述粗e-1-003在甲醇(80ml)中的溶液中依次加入naoh(3.8g,0.095mol)在h2o(12ml)中的溶液和bnbr(10.4g,0.095mol)。將得到的混合物在60℃攪拌4h。減壓除去有機溶劑，用etoac萃取殘余物。用鹽水洗滌有機層，用無水naso4干燥，濃縮。通過色譜法(pe:etoac＝6:1)純化殘余物，得到e-1-004(8.2g,30％)，為黃色固體。
e-1-005的合成：
向e-1-004(5.74g,20mmol)在dmso中的溶液中加入ibx(10.00g,36mmol)。將得到的混合物在室溫攪拌過夜，然后用h2o稀釋。過濾產物，用二氯甲烷稀釋濾液。用鹽水洗滌有機相，用無水na2so4干燥，濃縮，得到e-1-005(5.24g,92％)，為無色油狀物。
e-1-006的合成：
向e-1-005(3.00g,10.52mmol)在叔丁醇(20ml)中的溶液中依次加入2-甲基丁-2-烯(4ml)、nah2po4(2.52g,21.52mmol)在h2o(5ml)中的溶液。然后緩慢地加入naclo2(1.43g,15.78mmol)在h2o(6ml)中的溶液。在原料耗盡后，減壓除去有機溶劑。用hcl(37％)將殘余物調整至ph＝2。過濾產物，用h2o洗滌殘余物，得到e-1-006(3.00g,94％)，為白色固體。
e-1-007的合成：
向e-1-006(3.00g,10mmol)、e-1-014(2.42g,12mmol)和et3n(1.50g,15mmol)在dmf(20ml)中的溶液中加入hatu(4.56g,12mmol)。將得到的混合物在室溫攪拌3h，然后用h2o稀釋。用etoac萃取所得物。用鹽水洗滌有機相，用無水na2so4干燥，濃縮。通過色譜法(pe:etoac＝2:1)純化殘余物，得到e-1-007(4.00g,82％)，為淺黃色固體。
e-1-009的合成：
向e-1-007(4.00g,8.24mmol)在二氯甲烷(30ml)中的溶液中加入cf3cooh(6ml)。將得到的混合物在室溫攪拌過夜。減壓除去有機溶劑。將殘余物溶于甲醇，用飽和nahco3水溶液調整至ph＝8。將混合物在室溫再攪拌6h。減壓除去有機溶劑，用二氯甲烷萃取殘余物。用鹽水洗滌有機相，用na2so4干燥，濃縮。通過色譜法(dcm:meoh＝30:1)純化殘余物，得到e-1-009(1.89g,63％)，為淺黃色固體。
e-1-010的合成
向e-1-009(1.89g,5.14mmol)在thf(15ml)中的溶液中加入h2o(1.5ml)和pph3(1.62g，6.17mmol)。將混合物在70℃攪拌8h。減壓除去溶劑。通過色譜法(dcm∶meoh＝10∶1)純化殘余物，得到e-1-010(1.23g，70％)，為淺黃色固體。
6-(氨基甲基)-9-(芐基氧基)-2-異丙基-3，4-二氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮(e-1-010)
收率：70％
ms(esi):342(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ7.51(d，j＝6.8hz，2h)，7.29-7.37(m，3h)，6.40(s，1h)，5.07(s，2h)，4.64-4.67(m，1h)，4.08(t，j＝5.2hz，2h)，3.74(s，2h)，3.47(t，j＝5.2hz，2h)，1.13(d，j＝6.8hz，6h).
e-1-010-a的合成：
向e-1-010(1g，2.93mmol)在meoh(30ml)中的溶液中加入pt/c(150mg)。將混合物在h2氣氛下攪拌過夜。此后，過濾出pt/c，濃縮濾液，得到e-1-010-a(663mg，90％)，為白色固體。
6-(氨基甲基)-9-羥基-2-異丙基-3，4-二氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮(e-1-010-a)
收率：90％
ms(esi):252(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ6.25(s，1h)，4.71-4.76(m，1h)，4.16(t，j＝5.2hz，2h)，3.70(s，2h)，3.58(t，j＝5.2hz，2h)，1.15(d，j＝6.8hz，6h).
通用操作：e-1-015系列的合成
向e-1-010-a(80mg，0.23mmol)在dmf(1.5ml)中的溶液中依次加入et3n(48mg，0.46mmol)和rso2cl(0.35mmol)。將反應混合物在室溫攪拌5h。過濾所得物，通過制備型-hplc純化，得到期望的化合物。
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-01)
根據通用操作，用苯磺酰氯處理e-1-010-a，得到化合物e-1-015-01，為淺黃色固體。
收率：21％
ms(esi):392(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.48(t，j＝6.ohz，1h)，7.83(d，j＝7.6hz，2h)，7.60-7.70(m，3h)，6.64(s，1h)，4.69-4.72(m，1h)，4.18-4.23(m，4h)，3.50(s，2h)，1.17(d，j＝6.8hz，6h).
n-((9-(芐基氧基)-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-01-1).
根據通用操作，用苯磺酰氯處理e-1-010-a，得到化合物e-1-015-01-1，為淺白色固體。
收率：60％
ms(esi):482(m+h)+
1hnmr(d-cdcl3，400mhz):δ8.39(t，j＝6.0hz，1h)，8.03(d，j＝8.4hz，2h)，7.62-7.65(m，3h)，7.54-7.60(m，2h)，7.26-7.33(m，3h)，6.11(s，1h)，5.14(s，2h)，4.67-4.70(m，1h)，4.04(t，j＝4.8hz，2h)，3.80(t，j＝5.6hz，2h)，3.18(t，j＝4.8hz，2h)，1.05(d，j＝6.8hz，6h).
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-4-甲基苯磺酰胺(e-1-015-02).
根據通用操作，用4-甲基苯-1-磺酰氯處理e-1-010-a，得到化合物e-1-015-02，為淺黃色固體。
收率：30％
ms(esi):406(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.38(t，j＝6.4hz，1h)，7.70(d，j＝8.4hz，2h)，7.40(d，j＝8.4hz，2h)，6.66(s，1h)，4.67-4.74(m，1h)，4.23(t，j＝5.6hz，2h)，4.16(d，j＝6.0hz，2h)，3.62(t，j＝5.6hz，2h)，2.39(s，3h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h).
2-氟-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-03).
收率：40％
ms(esi):410(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.83(t，j＝5.6hz，1h)，7.79(t，j＝7.6hz，1h)，7.72-7.74(m，1h)，7.47(t，j＝9.6hz，1h)，7.39(t，j＝7.6hz，1h)，6.66(s，1h)，4.69-4.73(m，1h)，4.31(d，j＝5.6hz，2h)，4.26(d，j＝6.0hz，2h)，3.64(t，j＝5.6hz，2h)，1.18(d，j＝7.2hz，6h).
2-氟苯磺酸6-((2-氟苯基磺酰氨基)甲基)-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-9-基酯(e-1-015-03-1)
收率：20％
ms(esi):566(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.70(t，j＝5.6hz，1h)，7.68-7.80(m，4h)，7.31-7.48(m，4h)，6.30(s，1h)，4.36-4.40(m，1h)，4.19(d，j＝5.6hz，2h)，4.03(t，j＝5.6hz，2h)，3.49(t，j＝5.6hz，2h)，1.09(d，j＝6.8hz，6h).
3-氟-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-04).
收率：37％
ms(esi):410(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):68.64(t，j＝6.0hz，1h)，7.67-7.70(m，2h)，7.63(d，j＝8.0hz，1h)，7.54-7.59(m，1h)，6.70(s，1h)，4.68-4.75(m，1h)，4.26(d，j＝5.6hz，4h)，3.61(t，j＝5.6hz，2h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h).
4-氰基-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-05).
ms(esi):417(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.72(t，j＝6.0hz，1h)，8.11(d，j＝8.4hz，2h)，7.97(d，j＝8.0hz，2h)，6.39(s，1h)，4.66-4.76(m，1h)，4.19(d，j＝6.0hz，2h)，4.15(t，j＝5.2hz，2h)，3.61(t，j＝5.2hz，2h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h).
2，6-二氯-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-06).
收率：40％
ms(esi):460(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.94(t，j＝5.6hz，1h)，7.52-7.63(m，3h)，6.44(s，1h)，4.69-4.75(m，1h)，4.30(d，j＝6.0hz，2h)，4.20(t，j＝5.2hz，2h)，3.61(t，j＝5.2hz，2h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h).
2，4-二氯-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-07).
收率：40％
ms(esi):460(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.82(t，j＝5.6hz，1h)，7.90-7.94(m，2h)，7.63(dd，j＝8.4hz，2.4hz，1h)，6.45(s，1h)，4.68-4.75(m，1h)，4.25(d，j＝6.0hz，2h)，4.18(t，j＝5.2hz，2h)，3.61(t，j＝5.2hz，2h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h).
4-氯-2-氟-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-08).
收率：42％
ms(esi):444(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ12.6(br，1h)8.79(t，j＝5.6hz，1h)，7.74-7.78(m，2h)，7.48(dd，j＝8.4hz，1h)，6.17(s，1h)，4.68-4.75(m，1h)，4.17(d，j＝5.6hz，2h)，4.08(t，j＝5.2hz，2h)，3.57(t，j＝5.2hz，2h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h).
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-1-苯基甲磺酰胺(e-1-016).
收率：40％
ms(esi):406(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ7.97(t，j＝5.2hz，1h)，7.39(s，5h)，6.79(s，1h)，4.68-4.75(m，1h)，4.47(s，2h)，4.33(d，j＝5.2hz，2h)，4.26(s，2h)，3.67(s，2h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h).
1-(4-氯苯基)-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)甲磺酰胺(e-1-016-1).
收率：42％
ms(esi):440(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):67.88(t，j＝6.0hz，1h)，7.40-7.48(m，4h)，6.47(s，1h)，4.68-4.75(m，1h)，4.48(s，2h)，4.26(d，j＝5.6hz，2h)，4.15(t，j＝5.6hz，2h)，3.62(t，j＝5.6hz，2h)，1.18(d，j＝6.8hz，6h)
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-1-甲基-1h-咪唑-4-磺酰胺(e-1-017).
收率：36％
ms(esi):396(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ8.38(t，j＝6.0hz，1h)，7.80(s，1h)，7.75(s，1h)，6.84(s，1h)，4.69-4.76(m，1h)，4.34(t，j＝6.0hz，2h)，4.26(d，j＝6.0hz，2h)，3.69(s，3h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h)
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-3，5-二甲基異
收率：40％
ms(esi):411(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ12.93(br，1h)，8.67(t，j＝6.0hz，1h)，6.64(s，1h)，4.71-4.74(m，1h)，4.26(t，j＝6.0hz，2h)，4.23(d，j＝6.0hz，2h)，3.66(t，j＝5.6hz，2h)，2.61(s，3h)，2.36(s，3h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h)
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-2-甲基丙烷-1-磺酰胺(e-1-019).
收率：42％
ms(esi):372(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):612.69(br，1h)，7.89(t，j＝6.0hz，1h)，6.83(s，1h)，4.69-4.76(m，1h)，4.31-4.37(m，4h)，3.69(t，j＝5.6hz，2h)，3.03(d，j＝5.6hz，2h)，2.10-2.14(m，1h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h)，1.03(d，j＝6.8hz，6h)
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)環丙烷磺酰胺(e-1-020).
收率：40％
ms(esi):356(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz)δ7.94(t，j＝6.0hz，1h)，6.83(s，1h)，4.68-4.76(m，1h)，4.40(d，j＝6.4hz，2h)，4.33(t，j＝6.0hz，2h)，3.69(d，j＝5.6hz，2h)，2.66-2.69(m，1h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h)，0.96-0.99(m，4h)
n，n-二甲基-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)磺酰胺(e-1-021).
收率：40％
ms(esi):359(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ7.97(t，j＝6.0hz，1h)，6.83(s，1h)，4.68-4.75(m，1h)，4.32(d，j＝6.4hz，4h)，3.69(t，j＝5.6hz，2h)，2.71(s，6h)，1.19(d，j＝6.8hz，6h)
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)萘-1-磺酰胺(e-1-022).
收率：44％
ms(esi)：442(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz)61242(br，1h)，8.67(br，1h)，8.61(d，j＝8.4hz，1h)，8.19(d，j＝8.0hz，1h)，8.04-8.09(m，2h)，7.72(t，j＝7.6hz，1h)，7.66(t，j＝7.6hz，1h)，7.56(t，j＝7.6hz，1h)，6.07(s，1h)，4.58-4.65(m，1h)，4.09(s，2h)，3.80(s，2h)，3.21(s，2h)，1.06(d，j＝6.8hz，6h)
n-((2-異丙基-9-甲氧基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯磺酰胺(e-1-015-01-4)
收率：38％
ms(esi):406(m+h)+
1hnmr(cdcl3，400mhz):68.48(br，1h)，7.80(d，j＝7.6hz，2h)，7.55-7.62(m，3h)，6.17(s，1h)，4.82-4.85(m，1h)，4.30(t，j＝5.2hz，2h)，3.95(s，3h)，3.85(d，j＝5.6hz，2h)，3.67(t，j＝5.2hz，2h)，1.22(d，j＝6.8hz，6h)
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-n-甲基苯磺酰胺(e-1-015-01-2)
收率：38％
ms(esi):406(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):67.88(d，，j＝7.2hz2h)，7.79(t，j＝7.6hz，1h)，7.72(t，j＝7.6h2，2h)，6.73(br，1h)，4.70-4.77(m，1h)，4.36(br，4h)，3.73(s，2h)，2.60(s，3h)，1.20(d，j＝6.8hz，6h)
方案：
通用操作：
向化合物e-1-010的溶液(80mg，0.23mmol)中加入et3n(34mg，0.33mmol)、rcooh(0.24mmol)和hatu(92mg，0.24mmol)。將得到的混合物在室溫攪拌4h，然后用水稀釋。用ch2cl2/meoh(10∶1)萃取所得物。用hcl(1mol/l)和鹽水依次洗滌合并的有機相，然后濃縮，得到粗產物，為固體。向粗產物的meoh溶液(10ml)中加入pd/c(20mg)。將得到的混合物在h2氣氛下在室溫攪拌過夜。過濾出pd/c，濃縮濾液。通過制備型-hplc純化殘余物，得到期望的化合物。
4-氯-n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯甲酰胺(e-1-023)
收率：42％
ms(esi):390(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)δ8.03(d，j＝6.8hz，2h)，7.61(s，1h)，7.59(d，j＝6.8hz，2h)，4.77(s，2h)，4.70-4.74(m，3h)，3.81(t，j＝5.2hz，2h)，1.21(d，j＝6.8hz，6h).
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)苯甲酰胺(e-1-024)
收率：40％
ms(esi):356(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz):δ8.00(d，j＝7.6hz，2h)，7.50-7.60(m，4h)，4.78(s，2h)，4.71-4.74(m，3h)，3.82(t，j＝5.2hz，2h)，1.22(d，j＝6.8hz，6h).
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺(e-1-025)
收率：45％
ms(esi):390(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz)69.57(t，j＝6.4hz，1h)，8.26(s，1h)，8.24(d，j＝8.0hz，1h)，7.98(d，j＝8.0hz，1h)，7.79(t，j＝7.6hz，1h)，7.16(s，1h)，477(d，j＝5.6hz，2h)，471-4.76(m，1h)，4.57(t，j＝5.6hz，2h)，3.77(t，j＝5.6hz，2h)，1.21(d，j＝6.8hz，6h).
n-((9-羥基-2-異丙基-1，8-二氧代-2，3，4，8-四氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-6-基)甲基)-1-甲基-1h-吡咯-2-甲酰胺(e-1-027)
收率：40％
ms(esi):359(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400hz):δ8.58(t，j＝5.6hz，1h)，6.97(t，j＝2hz，1h)，6.89(dd，j＝4hz，2hz，1h)，
6.50(s，1h)，6.06(dd，j＝4hz，2hz，1h)，4.70-4.75(m，1h)，4.48(d，j＝5.6hz，2h)，4.31(t，j＝5.2hz，2h)，3.84(s，3h)，3.67(t，j＝5.2hz，2h)，1.21(d，j＝6.8hz，6h).
方案：
向化合物e-1-010(100mg，0.29mmol)在hcooh(2ml)中的溶液中加入(hcho)n(87mg，2.9mmol)。將得到的混合物在90℃攪拌3h。減壓除去溶劑。通過制備型-hplc純化殘余物，得到化合物e-1-026(15mg，19％)，為淺白色固體。
6-((二甲基氨基)甲基)-9-羥基-2-異丙基-3，4-二氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮(e-1-026)
ms(esi):280(m+h)+
1hnmr(d-cdcl3，400hz):δ6.29(s，1h)，4.94-4.98(m，1h)，4.37(s，2h)，3.53(s，2h)，3.27(s，2h)，2.22(s，6h)，1.24(d，j＝6.8hz，6h).
方案：
向化合物e-1-010(100mg，0.29mmol)在ch3cn(5ml)中的溶液中加入環己酮(34mg，34mmol)。將混合物在室溫攪拌10分鐘，然后加入nabh(oac)3(123mg，0.58mmol)。將得到的混合物攪拌過夜。在根據tlc判斷原料完全消失后，用水稀釋該混合物，用etoac萃取。用鹽水洗滌有機層，濃縮。通過制備型-tlc純化殘余物，得到e-1-015-01-3(87mg，70％)，為白色固體。
9-(芐基氧基)-6-((環己基氨基)甲基)-2-異丙基-3，4-二氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮(e-1-015-01-3)
ms(esi):424(m+h)+
1hnmr(d-cdcl3，400hz):δ7.64(d，j＝6.8hz，2h)，7.27-7.35(m，3h)，6.46(s，1h)，5.29(s，2h)，4.89-4.93(m，1h)，4.27(t，j＝5.2hz，2h)，3.67(s，2h)，3.76((t，j＝5.2hz，2h)，2.42-2.45(m，1h)，1.88(d，j＝11.2hz，2h)，1.71-1.86(m，2h)，1.62-1.65(m，1h)，1.02-1.30(m，12h).
方案：
e-1-030-02的合成
將化合物e-1-010(100mg，0.29mmol)和5-氯二苯并環庚烷(67mg，0.29mmol)的混合物在120℃攪拌10h，不使用溶劑。直接通過制備型-hplc純化所的物，得到e-1-030-02(11mg，9％)，為淺黃色固體。
6-((5-氨基二苯并環庚烷)甲基)-9-羥基-2-異丙基-3，4-二氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮(e-1-030-02)
ms(esi):563(m+h)+
1hnmr(d6-dmso，400mhz):δ7.26-7.34(m，9h)，7.08(s，1h)，4.85-4.89(m，1h)，4.41(d，j＝5.6hz，2h)，3.82(s，2h)，3.72(s，4h)，3.63(d，j＝5.6hz，2h)，1.29(d，j＝6.8hz，6h).
6-((二苯甲基氨基)甲基)-9-羥基-2-異丙基-3，4-二氫-1h-吡啶并[1，2-a]吡嗪-1，8(2h)-二酮(e-1-030-03)：
按照與e-1-030-02相同的方式合成了e-1-030-03。
收率：8％
ms(esi):418(m+h)+
1hnmr(cd3od，400hz):δ7.54(d，j＝7.6hz，4h)，7.31-7.42(m，6h)，6.90(s，1h)，5.29(s，1h)，4.86-4.88(m，1h)，4.46(s，2h)，4.16(s，2h)，3.74(s，2h)，1.29(d，j＝6.8hz，6h)。