棘孢木霉h2及其在降解芘中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一株新的微生物及其在降低污染物中的應用，特別涉及棘孢木霉H2及其在降解芘中的應用。
【背景技術】
[0002]PAHs由兩個或兩個以上苯環以線性排列、彎接或簇聚的方式構成的。一般可分為兩類，即孤立多環芳烴和稠合多芳烴。稠合多環芳烴對人類的威脅較大，有致癌作用的多環芳烴多為四到六環的稠環化合物。大多數PAHs不溶于水，熔點高達101°C?438°C，沸點150°C?525°C，分子量在178?300之間。雙環、三環的PAHs易降解，四環以上的PAHs極難降解。研究結果表明:在室內環境下，雙環PAHs的半衰期為2天;三環的半衰期為:16天(蒽)，134天(菲)；而四環以上的PAHs半衰期約在200天以上。
[0003]PAHs的基本結構單位是苯環，苯環的數目和連接方式的不同引起分子量、分子結構變化，進而導致了某些不同的物理化學性質。PAHs具有致誘變性，且結構穩定，生物難降解。1979年，美國環保局(EPA)首先公布129種優先監測污染物，其中PAHs有16種。而后歐洲將6種PAHs作為目標污染物，我國國家環保局也將7種PAHs列入中國環境優先污染物黑名單。
[0004]環境中的PAHs來源主要來自人類的生產活動，由各種有機物不完全燃燒所致。例如，煤的汽化和液化過程、石油的裂解過程、各種石油餾份的燃燒、烹調油煙以及廢棄物等均可造成環境中PAHs的污染。四環以下分子量較小的PAHs多以蒸氣態存在，而分子量較大的則被吸附在顆粒物表面，尤其是在小于5μπι的顆粒上，可以進入肺的深部。這樣的顆粒可以在空氣中懸浮幾天到幾周，也能遠距離轉移。
[0005]PAHs不易溶于水，極易附著在固體顆粒上，因此，大氣、水及土壤中PAHs處于吸附態。PAHs在環境中是不斷積累的。研究表明在河水、海水沉積物中，PAHs的濃度高而且積累的快。因排廢氣、廢水及廢物傾倒，PAHs對水、大氣及土壤產生直接污染。吸附在煙氣微粒的PAHs隨氣流傳向周圍及更遠處，又隨降塵、降雨及降雪進入水體及土壤，而土壤及地面多環芳烴通過揚塵再次進入大氣，通過呼吸及食物鏈進入動物體產生毒害。
[0006]目前PAHs作為持久性有機污染物，因具有以下特性而被各國所關注:(l)PAHs具有極強的“三致”效應，即致癌性、致突變性及致畸性。人類及動物癌癥病變有70%?90%是環境中化學物質引起的，而PAHs則是環境中致癌化學物質中最大的一類；(2)PAHs對微生物的生長有強抑制作用。PAHs因水溶性差及其穩定的環狀結構而不易被生物利用，它們對細胞的破壞作用抑制普通微生物的生長；(3)PAHs經紫外照射后毒性更大(光毒效應hPAHs吸收紫外光能后，被激發成單線態及三線態分子，被激發分子的能量可以通過不同途徑損失。其中一部分被激發的PAHs分子將能量傳給氧，從而產生反應能力極強的單線態氧，它能損壞生物膜。
[0007]1775年，英國人發現煙囪清掃工人多患陰囊癌；1882年，又有人發現從事煤焦油和瀝青作業的工人多患皮膚癌。20世紀70年代以前，人們一直以為多環芳烴是直接致癌物，后來，動物實驗的結果表明，多環芳烴本身對生物并無多大負效應，它們只有被酶系統代謝，轉化為多種代謝產物后，其中某些活性形式的代謝產物與DNA發生共價結合，才具有致癌作用。
[0008]而多環芳烴進入土壤后，由土壤表面污染進一步導致下層土壤污染，甚至地下水污染。多環芳烴在土壤中的迀移與轉化受揮發、光解及生物降解等過程的影響，在光誘導、生物積累及生物代謝變迀過程中，多環芳烴一般轉化為酚類、醌類及芳香族羧酸類物質，有的轉化產物甚至比原始多環芳烴更具毒性。
[0009]以往降解PAHs菌的分離報道，很多以萘、菲等低分子量的PAHs為主。自1988年Heitkamp等首次報道從土壤中分離到1株能降解芘的菌，經鑒定為分枝桿菌屬的一個新種(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)，之后高分子量PAHs的降解研究也有很多，分枝桿菌(如Mycobacterium sp.strain APInMycobacterium sp.strain RJGI1-135、Mycobacterium flavescens，紅球菌(Rhodococcus sp.strain UW1)、白腐真菌(Pleurotusostreatus、Panerochaete chrysosporium)和糖絲菌(Saccharothrix sp.PYX-6)等。
[0010]PAHs的芘苯環對稱排列組成，結構穩定，是高分子量PAHs的代表化合物，具有致癌、致畸的結構域，因此能降解芘的微生物資源還很有限，特別是芘降解霉菌的相關研究目前更少見報道。
【發明內容】
[0011]本發明的目的在于提供棘孢木霉H2及其在降解芘中的應用。
[0012]發明人通過大量的篩選，篩選得到了一株可降解PAHs，特別是降解芘的新菌株，經鑒定，命名該新菌株為棘孢木霉H2。棘孢木霉H2已經于2015年11月3日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏機構于2015年11月3日鑒定存活，給予保藏編號為CGMCC N0.11577，建議的分類命名為棘抱木霉(Trichoderma asperellum)。
[0013]實驗數據表明棘孢木霉H2具有降解芘的能力，降解力強，可以用于PAHs的降解。
【附圖說明】
[0014]圖1為棘孢木霉H2在察氏培養基(25°C，7d)上的菌落形態；
圖2為棘孢木霉H2在在麥芽汁培養基(25°C，7d)上的菌落形態；
圖3為棘孢木霉H2在察氏酵母培養基(25°C，7d)上的菌落形態；
圖4為棘孢木霉H2在不同培養基(25°C，7d)上的背面菌落形態；
圖5為棘孢木霉H2的分生孢子梗；
圖6為棘孢木霉H2對芘的降解曲線；
圖7為棘孢木霉H2的菌絲干重增長圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實驗，進一步說明本發明的技術方案。
[0016]芘降解菌的分離與鑒定培養基配方 PDA培養基:土豆浸出物200g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15_20g/L。
[0017]液體培養基:在Tienand Kirk (1988)的配方的基礎上稍加改良:其中用濃度為0.02mol.L—1的乙酸緩沖液(pH=4.4)代替丁二酸二甲酯緩沖液。其中葡萄糖10g/L，KH2P04 2g/L，MgS04.7H20 0.25g/L，CaCl2 0.1 g/L，酒石酸銨0.5g/L(C4H12N206)，微量元素 10g/L，微量元素的組成(/L):
MnS04 0.5g，NaCl 1.0 g,FeS04.7H20 0.1 g，C0Cl2 0.1g,ZnS04.7H20 0.lg,CuS040.1g，AlK(S04)2.12H20 0.01g，Na2Mo04.2H20 0.0lg
接種前無菌過濾加入VB1溶液，使得最終VB1的質量濃度為5mg/L。
[0018]察氏培養基配方:30.0g/L蔗糖，3 g/LNaN03，l g/LK2HP04,0.5 g/LMgS04.7H20,
0.5 g/LKCl，0.01 g/L FeS04.7H20，15-20g/L瓊脂。
[0019]麥芽汁培養基配方:20g/L麥芽浸膏，lg/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15_20g/L瓊脂。
[0020]察氏酵母培養基配方:Κ2ΗΡ04 lg/L，查氏濃縮液10ml /L，酵母抽提物5g/L，蔗糖30g/L，15-20g/L 瓊脂。
[0021]芘降解菌的馴化
樣品采自廣東省清遠市，取樣品蚯蚓糞，300g，含水量約50%，平攤于托盤中，添加芘使得最終艇頓中花的濃度為:第1天25mg.kg—工，4天后50mg.kg—工，8天后lOOmg.kg—S15天后200mg.kg—、添加芘的方法為:取一定量的芘溶于丙酮溶液，取芘丙酮溶液均勻噴施到土壤中，攪拌均勻，并放置通風廚待丙酮揮發完畢，在28°C，避光條件下連續馴化20天。
[0022]分離
稱取已經馴化好的土樣10 g，放入90