一株綠色木霉及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，涉及一株綠色木霉及其應用，特別是涉及一株耐抑 制物強的綠色木霉及其在制備纖維素酶方面的應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素是世界上最大的可再生性有機資源，每年通過全球生物合成可再生性纖維 素達1000億噸以上，但被利用的極少。將天然纖維素降解為可利用的糖類，再進一步轉化 為乙醇、菌體蛋白、氣體燃料等物質，對解決當今世界所面臨的環境污染、糧食短缺、資源緊 張和能源危機等問題具有重大現實意義，而纖維素酶是降解纖維素最有效的生物催化劑。
[0003] 酶解法的高成本是生物質能源工業化的主要制約因素之一。降低纖維素酶成本主 要涉及降低纖維素酶產生菌培養基及發酵成本、提高纖維素酶活性等問題。因此，提供能夠 利用廉價原料，發酵周期短和耐受能力強的菌株產生高活性纖維素酶對木質纖維素轉化為 生物質能源具有重要意義。
[0004] 許多細菌、放線菌和真菌都能產生纖維素酶，其中真菌類是研究和應用最 廣的纖維素酶生產菌。生產纖維素酶的真菌主要有木霉屬曲霉屬 iAsperigillus')、著霉M (Penicillium)、敏霉Μ 私燦嚴霉M Qfyrotheeium) 等，尤以木霉屬類菌種居多。
[0005] CN201210408018. 6 公開了一株深綠木霉 B-8-1-34 (7-ricAocfeiis airoK/riofe)及 其在制備纖維素酶方面的應用，該菌株能夠利用含有木質纖維素的工農業生產廢棄物，配 合麩皮、玉米漿、豆餅粉等廉價原料，通過液態或固態發酵生產纖維素酶。其液態產酶發酵 培養基中當以2. 5%木糖渣為碳源時，發酵66h得到粗酶液，然后用粗酶液糖化木糖渣和玉 米芯48h，還原糖濃度分別達3. 7%和4. 4%。
[0006] CN201210295819. 6公開了一種可分泌纖維素酶的菌株及其纖維素酶提取 方法與應用，解決了現有產纖維素酶菌株酶活產量低的問題，該菌株為綠木霉ZY-01 (TricAocferaza Kireas ZY-01)，該菌株可以用于甘鹿漁及結桿的高效降解，分泌的纖維素 酶具有較高的纖維素降解活性。
[0007] Krisztina Kovacs ^(Trichoderma atroviride mutants with enhanced productionof cellulase and β -glucosidase on pretreated willow[J], Enzyme and Microbial Technology, 2008(43) :48-55)報道了通過誘變獲得的三株深綠木霉TUB F-1721、TUB F-1741 和 TUB F-1753,濾紙酶活分別達 1. 14 FPU/mL、l. 18 FPU/mL 和 1. 14 FPU/mL〇
[0008] 林英等(產纖維素酶綠色木霉F_UV264產酶條件優化，安徽農業科學，2006, 34 (11): 2312-2314)對誘變菌株綠色木霉F-UV264的產纖維素酶條件進行了研究，結果表明：以 1%(NH4) 2S04和2%酵母膏為氮源，并加入3%表面活性劑，2%的Mandels營養鹽，麩皮與稻草 粉比例為1:3,30°C發酵130h可達到最高酶活。
[0009] 目前獲得的產纖維素酶的菌株，大多數是直接采用木質纖維素原料為碳源和酶蛋 白誘導物，酶蛋白產量少，分泌的纖維素酶對預處理木質纖維素底物酶解適應性不強，用于 預處理木質纖維素原料的酶解，葡萄糖得率不高。為了提高產纖維素酶對預處理木質纖維 素的酶解效果，可以利用預處理木質纖維素原料作為碳源和誘導物，但是，木質纖維素在預 處理過程中由于糖類及木質素的降解，會釋放一些微生物生長的抑制劑，有弱酸類抑制物 (甲酸，乙酸，乙酰丙酸等)，糠醛類抑制物(糠醛、5-羥甲基糠醛）以及酚類抑制物(香草醛， 對苯二酚，4-羥基苯甲酸)等，這些抑制物尤其是酚類對菌株產纖維素酶及纖維素酶解都有 一定的抑制作用，因此需要進行中和、水洗等脫毒處理，操作繁瑣。如果直接采用預處理后 木質纖維素原料，則由于菌體耐受能力有限，纖維素酶的產量和活性不高。
【發明內容】
[0010] 針對現有技術的不足，本發明提供了 一株綠色木霉F4 Kiriofe F4) 及其應用。該菌株在以預處理木質纖維素作為碳源和誘導物生產纖維素酶的過程中，能夠 耐受預處理木質纖維素引入的多種抑制物，仍然可以高效產酶，分泌的纖維素酶成分全，酶 活性高，用于酶解預處理木質纖維素時的耐受性強。
[0011] 本發明所述的綠色木霉F4，其分類命名為綠色木霉（Kiriofe )，已于 2008年11月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 2736。
[0012] 本發明所述的綠色木霉F4的分生孢子梗形成金字塔式的分枝輪廓，分枝末 端的小梗束生、對生、互生或單生，瓶形，8-12X2. 5-3. 5μηι ;分生孢子卵形、寬橢圓形， 4-5 X 3. 5-4 μ m，或近球形，直徑3. 5-4. 5 μ m ;單個近無色，聚集時呈淡綠色，壁粗糙。
[0013] 本發明所述的綠色木霉F4菌落在PDA平板上25°C培養4天擴展5-lOcm，初期白 色稀疏，后形成綠色產孢區，反面無色。該菌株可以在腐木，秸桿，有纖維素的土壤，馬鈴薯， 玉米粉等上生長，生長最適pH值為5. 0-5. 5,生長最適溫度為25-35°C。
[0014] 本發明所述的綠色木霉F4是通過富集，木塊涂布篩選，濾紙涂布篩選，剛果 紅-CMC雙層平板篩選得到的一株耐受抑制物能力強，纖維素酶成分全，酶活性高的綠色木 霉菌株。
[0015] 本發明所述的綠色木霉F4在生產纖維素酶方面的應用。所述綠色木霉F4發酵生 產纖維素酶的pH值為3. 0-6. 0,發酵溫度為23-35°C，發酵時間為48-120h。
[0016] 本發明所述的綠色木霉F4在以預處理木質纖維素為培養基碳源和誘導物發酵生 產纖維素酶方面的應用，具有耐受抑制物能力強，纖維素酶成分全，酶活性高的特點。所 述的發酵培養基為：麥麩10-50g/L，預處理木質纖維素10-60g/L，微晶纖維素5-30g/ L,酵母膏 5-30g/L，ΚΗ2Ρ04 0· l-10g/L，CaCl2 0· 01-3g/L，MgS04 0· 01-3g/L，ZnS04 · 7H20 0.01-50mg/L，MnS04.4H20 0.01-20mg/L，CoCl2 0.01-50 mg/L。發酵結束后，經檢測發酵液 中的濾紙酶活為5-15IU/ml，CMC酶活為10-20IU/ml，β-葡萄糖苷酶活為l-5IU/ml，酶產 量及酶活穩定。
[0017] 本發明所述的木質纖維素原料包括一切含纖維素的生物質原料，如秸桿、木屑、能 源植物(如柳枝稷）和廢紙等，優選為玉米秸桿。采用稀酸預處理、稀酸蒸汽爆破預處理， 或其它一切可用于木質纖維素預處理過程中，提高木質纖維素酶解效果的預處理技術。稀 酸預處理的條件為：酸濃度為〇. 5wt%_2. 5wt%，干物質濃度為（可溶性固體和不可溶性固 體質量之和與體系總質量的百分比，下同）l〇wt%-20wt%，溫度115-180°C，時間5-120min。 稀酸蒸汽爆破預處理的條件為：酸濃度〇. 5wt%-2. 5wt%，干物質濃度25wt%-40wt%，溫度 150-180°C，時間5-20min。預處理木質纖維素擠壓脫水后直接加入到發酵培養基中，擠壓脫 水后干物質中，木糖含量lwt%-10wt%,纖維素含量30wt%-40wt%,木質素含量15wt%-18wt%, 乙酸含量〇· 5wt%-2wt%，甲酸含量(λ lwt%-〇. 5wt%，5-羥甲基糠醛含量(λ 01wt%-0. 05wt%，糠 醛含量 〇· 02wt%-0. 08wt%，總酚含量 0· 005wt%-0. 015wt%。
[0018] 本發明所述的綠色木霉F4在以預處理木質纖維素為培養基碳源和誘導物，發酵 生產纖維素酶的過程中，當發酵l〇_24h后，加入山梨糖、纖維二糖、槐樹粉、異麥芽糖、葡糖 酸內脂等的一種或幾種，再發酵48-120小時。
[0019] 本發明采用綠色木霉F4生產的纖維素酶在酶解預處理木質纖維素方面的應 用，將發酵后粗酶液采用2-50 KD超濾膜進行濃縮，濃縮10-200倍；采用濃縮的酶液對 預處理木質纖維素原料進行酶解，酶加入量為0. 01-0. lg/g纖維素。控制酶解體系的 pH為4. 8-5. 2,溫度為48-52°C，干物質濃度為5wt%-30wt%。酶解結束后，葡萄糖濃度為 4. 5wt%-15. 8wt%，葡萄糖得率為 83. 4%-99· 5%。
[0020] 本發明篩選獲得的綠色木霉F4在以預處理木質纖維素作為碳源和誘導物生產纖 維素酶過程中，能夠耐受預處理木質纖維素(硒酸預處理或稀酸蒸汽爆破預處理）引入的多 種抑制物（乙酸、甲酸、5_羥甲基糠醛、糠醛和酚等)，在這些抑制物存在下仍然可以高效產 酶，分泌的纖維素酶成分全，酶活性高，產生的纖維素酶用于酶解預處理木質纖維素時，具 有耐受性強，酶解活性高。
[0021] 生物材料保藏說明 本發明的綠色木霉F4 Kiriofe F4)菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研 究所；保藏號：CGMCC No. 2736 ;保藏日期：2008年11月10日。
【具體實施方式】
[0022] 下面通過實施例對本發明進行詳細說明。本發明中，wt%為質量分數。
[0023] 實施例1綠色木霉F4的分離篩選 本發明綠色木霉F4 Kiriofe F4)是從遼寧省撫順市山頂松樹根部的泥 土中篩選獲得的，是通過富集，木塊涂布篩選，濾紙涂布篩選，剛果紅-CMC雙層平板篩選得 到的。具體篩選過程為： (1) 將取得的泥土樣品稀釋，混懸于無菌水中，加入到發酵培養基中，于30°C培養 7