本發明屬于醫藥
技術領域：
，尤其涉及取代的二氨基嘧啶類化合物及包含該化合物的組合物及其用途。
背景技術：
：表皮生長因子受體即EGFR、ErbB-1、HER1是ErbB受體家族的成員，ErbB受體家族是四種密切相關的受體酪氨酸激酶EGFR(ErbB-1)，HER2/c-neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)的亞家族。EGFR是胞外蛋白配體表皮生長因子家族(EGF家族)成員的細胞表面受體。影響EGFR表達或活性的突變可能導致癌癥。據報道，在大多數實體瘤如肺癌、乳腺癌和腦瘤中EGFR處于無管制狀態。據估計30％的上皮癌與EGFR或家族成員的突變、擴增或失調有關聯。基于通過抗體藥或小分子抑制劑藥物，例如吉非替尼和厄洛替尼，對EGFR的抑制的治療方法已被研發出來。非小細胞肺癌的情況下，吉非替尼和厄洛替尼對10％～40％的病人有益處。然而，治療一段時間后對吉非替尼或厄洛替尼的獲得性耐藥性成為主要的臨床問題。研究證實，產生耐藥性的一個主要原因是由于T790M的新突變，T790M是EGFR的“門衛”。然后，研發人員又研發了能T790M的抑制劑，如BIBW2992，并在臨床試驗中表現出優勢。但是，這些以EGFR抑制劑為靶標的T790M對野生型EGFR也具有相對的抑制活性，這就限制了臨床應用。所以，有必要進一步研發出更多僅靶向突變蛋白而非野生型蛋白的EGFR抑制劑的有效類型。另外，吉非替尼、厄洛替尼等EGFR抑制劑(EGFR-TKI)針對EGFR突變晚期NSCLC雖然取得了令人矚目的療效，但是隨后發現EGFR-TKI在治療NSCLC時的原發性耐藥或繼發性耐藥，是我們在治療晚期NSCLC面臨新的挑戰，繼而開展新的探索，尋找對策。技術實現要素：針對以上技術問題，本發明公開了一種取代的二氨基嘧啶類化合物及包含該化合物的組合物及其用途，其具有更好的EGFR激酶抑制活性和/或具有更好藥效學/藥代動力學性能，可用于治療、預防以及緩解由對EGFR激酶介導的疾病。對此，本發明的技術方案為：一種取代的二氨基嘧啶類化合物，如式(I)所示的二氨基嘧啶化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化合物，其中，R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b各自獨立地為氫、氘、鹵素或三氟甲基；附加條件為：R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b中至少一個是氘代的或氘。作為本發明的進一步改進，R11為三氟甲基。作為本發明的進一步改進，所述化合物選自下組化合物或其藥學上可接受的鹽：作為本發明的進一步改進，所述取代的二氨基嘧啶類化合物采用反應路線一或反應路線二制備得到，所述反應路線一為：2,4-二鹵代嘧啶類化合物和間-N-Boc苯胺在堿性條件下反應生2-鹵代嘧啶化合物，2-鹵代嘧啶化合物經Boc保護得到氨基化合物，所述氨基化合物與氘代或未氘代丙烯酸、或氘代或未氘代丙烯酰鹵反應得到酰胺合物VI；酚類化合物在堿性條件下與烷基鹵反應得到烷氧代化合物，所述烷氧代化合物在堿性條件下，4-F被脂肪胺取代得硝基化合物，所述硝基化合物被還原成苯胺，苯胺與所述2-鹵代嘧啶類化合物反應得到式(1)所述的取代的二氨基嘧啶類化合物；所述反應路線二為：烷氧代化合物與N-Boc保護的哌嗪類化合物在堿性條件下反應得到XI，硝基被還原成胺基成化合物XII，并與2-鹵代嘧啶類化合物VI反應得到對接化合物XIII，該化合物在酸性條件下脫Boc得到哌嗪類化合物XIV，并與酸酐反應得到式(1)所述的取代的二氨基嘧啶類化合物。作為本發明的進一步改進，所述反應路線一或者反應路線二所用的溶劑為二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸異丙酯、正己烷、正庚烷、石油醚、正丁醇、乙醇、異丁醇、叔丁醇、異丙醇、正丙醇、正戊醇、異戊醇、丙酮、乙腈、正己烷、甲苯、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、1,4-二氧六環、乙二醇單甲醚、乙二醇雙甲醚、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或二甲基亞砜中的至少一種；所述反應路線一或者反應路線二的堿性條件所用的堿為碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銫、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、三乙胺、二異丙基乙基胺、4-N，N-二甲基吡啶或吡啶中的至少一種；所述反應路線二的酸性條件所用的酸為三氟醋酸、醋酸、濃鹽酸、稀鹽酸、濃硫酸、稀硫酸、濃硝酸、稀硝酸、鹽酸二氧六環溶液、鹽酸乙醇溶液、對甲苯磺酸或苯磺酸中的至少一種。其中，上述反應溫度為-30℃-200℃，更佳地為-10℃-100℃。其中，上述反應時間為0-48h，更佳地0-24h，更佳地為0-6h。作為本發明的進一步改進，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量0.015％，較佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。在另一優選例中，氘在各氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量(0.015％)，較佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。具體地說，在本發明中R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b各氘代位置中氘同位素含量至少是5％，較佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。在另一選例中，式(I)中化合物的R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7、R8、R9a、R9b、R9c、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17a和R17b，至少其中一個R含氘，更佳地兩個R含氘，更佳地三個R含氘，更佳地四個R含氘，更佳地五個R含氘，更佳地六個R含氘，更佳地七個R含氘，更佳地八個R含氘，更佳地九個R含氘，更佳地十個R含氘，更佳地十一個R含氘，更佳地十二個R含氘，更佳地十三個R含氘，更佳地十四個R含氘，更佳地十五個R含氘，更佳地十六個R含氘，更佳地十七個R含氘，更佳地十八個R含氘，更佳地十九個R含氘，更佳地二十個R含氘，更佳地二十一個R含氘，更佳地二十二個R含氘，更佳地二十三個R含氘，更佳地二十四個R含氘，更佳地二十五個R含氘，更佳地二十六個R含氘。本發明還包括同位素標記的化合物，等同于原始化合物在此公開。可以列為本發明的化合物同位素的例子包括氫，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯同位素，分別如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F以及36Cl。本發明中的化合物，或對映體，非對映體，異構體，或藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中含有上述化合物的同位素或其他其他同位素原子都在本發明的范圍之內。本發明中某些同位素標記化合物，例如3H和14C的放射性同位素也在其中，在藥物和底物的組織分布實驗中是有用的。氚，即3H和碳-14，即14C，它們的制備和檢測比較容易，是同位素中的首選。同位素標記的化合物可以用一般的方法，通過用易得的同位素標記試劑替換為非同位素的試劑，用示例中的方案可以制備。作為本發明的進一步改進，將藥學上可接受的載體與如上所述的取代的二氨基嘧啶類化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、前藥，立體異構體、同位素變體水合物或溶劑合物進行混合，從而形成藥物組合物。本發明還公開了一種藥物組合物，其含有藥學上可接受的載體和如上所述的取代的二氨基嘧啶化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物、立體異構體、前藥或同位素變體的藥物組合物。作為本發明的進一步改進，所述藥物組合物還包含其他治療藥物，所述治療藥物為癌癥、細胞增殖性疾病、炎癥、感染、免疫性疾病、器官移植、病毒性疾病、心血管疾病或代謝性疾病的藥物。本發明的藥物組合物包含安全有效量范圍內的本發明化合物或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產生嚴重的副作用。通常，藥物組合物含有1-2000mg本發明化合物/劑，更佳地，含有10-1000mg本發明化合物/劑。較佳地，所述的“一劑”為一個膠囊或藥片。本發明還公開了如上所述的取代的二氨基嘧啶化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化合物的用途，用于制備治療、預防以及緩解由對蛋白激酶介導的疾病的藥物組合物。由于本發明化合物具有優異的對蛋白激酶(Kinase)的抑制活性，特別是針對EGFR激酶具有很好的抑制活性，因此本發明化合物及其各種晶型，藥學上可接受的無機或有機鹽，水合物或溶劑合物，以及含有本發明化合物為主要活性成分的藥物組合物可用于治療、預防以及緩解由對蛋白激酶(Kinase)，特別是針對EGFR激酶介導的疾病。根據現有技術，本發明化合物可用于治療以下疾病：癌癥、細胞增殖性疾病、炎癥、感染、免疫性疾病、器官移植、病毒性疾病、心血管疾病或代謝性疾病等。本發明的有益效果為：本發明公開的取代的二氨基嘧啶類化合物及包含該化合物的組合物對EGFR激酶具有優異的抑制性，同時具有更好的藥代動力學參數特性，能夠提高化合物在動物體內的藥物濃度，以提高藥物療效和安全性；本發明公開的取代的二氨基嘧啶類化合物及包含該化合物的組合物可用于治療、預防以及緩解由對蛋白激酶(Kinase)，特別是針對EGFR激酶介導的疾病。具體實施方式下面結合本發明的較優的實施例作進一步的詳細說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則份數和百分比為重量份和重量百分比。實施例1按照以下合成路線制備N-(3-(2-(4-乙酰哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺，即以下合成路線中的化合物11，即合成式(2)的化合物；采用以下步驟：步驟1：制備3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基叔丁酯(化合物3)；向配有磁力攪拌、N2球、溫度計的50mL三口瓶中加入正丁醇(9mL)，冰水浴冷卻，保持內溫不超過5℃，加入3-N-Boc-苯胺(0.96g，4.6mmol)，緩慢滴加入2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶(1.0g,4.6mmol)，然后N，N-二異丙基乙基胺(0.67g，5.5mmol)緩慢滴入反應液，加畢，混合液冰水浴攪拌1h，常溫下攪拌4h，生成的大量白色固體過濾，正丁醇(2mL)洗滌，抽干，50℃真空干燥得該白色固體1.4g，收率78.3％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.53(s，1H)，9.46(s，1H)，8.57(s，1H)，7.58(s，1H)，7.28-7.26(m，2H)，7.04-7.01(m，1H)，1.48(s，9H)，LC-MS(APCI):m/z＝389.1(M+1)+，purity:97％。步驟2：制備3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基丙烯酰胺(化合物5)；向100mL三口燒瓶中加入二氯甲烷(15mL)，攪拌下加入3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基叔丁酯(1.0g，2.57mmol)，冰水浴冷卻，滴加入三氟醋酸(3mL)，拆去冰浴，N2氛下常溫攪拌反應1h。再次加入二氯甲烷(50mL)，冰鹽浴冷卻下滴加入三乙胺(5.6mL，40.4mmol)中和三氟醋酸，混合物冷卻到-10℃，N2氛下緩慢滴加入丙烯酰氯(0.27g，3mmol)，保溫攪拌5min。加入H2O(100mL)淬滅反應，分出有機層，依次用水(100mLx2)、0.5MHCl(aq.,15mL)、飽和碳酸氫鈉水液(15mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮，殘留物過硅膠柱(100-200目，石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得標題化合物0.6g，兩步收率68.1％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.25(s,1H),9.59(s,1H),8.59(s,1H),7.80-1.79(m,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(d,J＝7.8Hz,1H),6.50-6.41(m,1H),6.30-6.23(m,1H),5.77(dd,J＝9.3Hz,2.1Hz,1H).LC-MS(APCI):m/z＝343.1(M+1)+,purity:98％。步驟3：制備4-氟-2-d3-甲氧基硝基苯(化合物7)；向100mL單口瓶中加入丙酮(30mL)，攪拌下依次加入5-氟-2-硝基苯酚(2.0g，12.7mmol)、無水碳酸鉀(3.5g，25.4mmol)、氘代碘甲烷(2.4g，16.5mmol)，升溫到60℃并保溫攪拌2h。冷卻到室溫，旋轉蒸發掉丙酮，殘留物加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取(30mLx3)，合并有機層，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體2.0g，收率90％。1HNMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):8.00-7.95(m,1H),6.83-6.71(m,2H)，LC-MS(APCI):m/z＝175.2(M+1)+；95％。步驟4：制備1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪(化合物9)；向25mL單口燒瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺(4mL)，攪拌下依次加入4-氟-2-d3-甲氧基硝基苯(0.4g，2.3mmol)、無水碳酸鉀(0.64g，4.6mmol)、1-乙酰哌嗪(0.38g，3.0mmol)，反應混合物升溫到80℃，N2酚下反應過夜。冷卻到室溫，加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取(30mLx2)，有機層水洗(40mLx3)、飽和食鹽水洗(20mL)，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得黃色固體0.5g，收率77.0％。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):8.01(d,J＝9.6Hz,1H),6.43(dd,J＝9.6Hz,2.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),3.83-3.80(m,2H),3.70-3.67(m,2H),3.49-3.41(m,4H),2.17(s,3H)，LC-MS(APCI):m/z＝283.2(M+1)+，purity:97％。步驟5：制備1-[4-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)]乙酰哌嗪(化合物10)；向25mL單口瓶中加入乙醇(6mL)和水(2mL)，攪拌下依次加入1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪(0.2g，0.71mmol)、還原鐵粉(0.24g，4.26mmol)、氯化銨(19mg，0.35mmol)，反應混合物N2氛下升溫到85℃，并保溫攪拌反應1h。冷卻到室溫，濾掉固體物質，濾液濃縮，殘留物中加入水(5mL)，二氯甲烷萃取(15mLx2)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得棕色固體0.15g，收率84.1％，直接投于下一步。步驟6：制備N-(3-(2-(4-乙酰哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物11)；向25mL單口燒瓶中加入1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪(0.15g，0.59mmol)、1,4-二氧六環(4mL)，攪拌下加入3-(2-氯-5-三氟甲基)嘧啶-4-氨基苯基丙烯酰胺(0.2g，0.59mmol)，滴入三滴三氟醋酸，N2氛下60℃攪拌反應3h。冷卻到室溫，滴入五滴三乙胺中和三氟醋酸，旋干，殘留物硅膠柱層析得到類白色固體180mg，收率54％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.22(s,1H),8.65(brs,1H),8.29(s,1H),8.10(s,1H),7.76(brs,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.26(t,J＝8.1Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),6.60(d,J＝2.7Hz,1H),6.51-6.42(m,1H),6.29-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.57-3.55(m,4H),3.08-3.00(m,4H),2.05(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝559.2(M+1)+,purity:97.5％。實施例2采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-d3-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物15)，即合成式(3)的化合物；采用以下步驟：步驟1：化合物12、13、14的合成參照實施例1的化合物9、10、11合成，其中化合物14的譜圖為：1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.16(s,1H),8.65(brs,1H),8.29(s,1H),8.08(s,1H),7.76(brs,1H),7.55-7.48(m,2H),7.27(t,J＝8.1Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),6.60(d,J＝2.7Hz,1H),6.49-6.40(m,1H),6.28-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.77(s,3H),3.44(t,J＝4.8Hz,4H),3.00(t,J＝4.8Hz,4H),1.43(s,9H).LC-MS(APCI):m/z＝614.2(M+1)+,purity:96.1％。步驟2：制備N-(3-(2-(4-d3-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物15)向25mL單口燒瓶中加入叔丁基-4-(4-(4-(3-丙烯酰胺苯基胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-2-胺)-3-甲氧苯基)哌嗪-1-碳酸酯(100mg)及二氯甲烷(10mL)，攪拌溶清，緩慢滴加入三氟醋酸(1mL)，氮氣氛下攪拌反應1h，監測脫Boc反應完全，冰水浴冷卻下緩慢滴加入三乙胺(2mL)中和三氟醋酸，并緩慢滴加入氘代醋酸酐(0.1mL)，冰水浴下攪拌反應10分鐘，反應完畢，加入水(10mL)淬滅反應，分出有機層，依次用水(10mL)、1MHCl(5mL)、飽和碳酸氫鈉(5mL)洗滌，干燥，過濾，濃縮并過硅膠柱得白色粉末70mg。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.22(s,1H),8.65(brs,1H),8.29(s,1H),8.10(s,1H),7.76(brs,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.26(t,J＝8.1Hz,1H),7.17-7.14(m,1H),6.60(d,J＝2.7Hz,1H),6.51-6.42(m,1H),6.29-6.21(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.77(s,3H),3.57-3.55(m,4H),3.08-3.00(m,4H).LC-MS(APCI):m/z＝559.2(M+1)+,purity:98.0％。實施例3采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物19)，即合成式(4)的化合物；按實施案例1所述方法，不同點在于，本例使用N-乙酰-d8-哌嗪代替N-乙酰哌嗪，從而制得目標化合物19，1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.52(s,1H),9.79(brs,1H),9.33(brs,1H),8.51(brs,1H),7.85(s,1H),7.62(d,J＝8.1Hz,1H),7.45-7.42(m,1H),7.36(t,J＝8.1Hz,1H),7.13-7.10(m,1H),6.77(s,1H),6.58-6.49(m,1H),6.47-6.22(m,2H),5.78-5.74(m,1H),3.80(s,3H),2.06(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝564.2(M+1)+,purity:97.2％。實施例4采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基-3，5，6-d3-苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物24)，即合成式(16)的化合物；采用以下步驟：步驟1按實施案例1步驟4、步驟5所述方法，不同點在于，本例使用4-氟-2-甲氧基硝基苯代替4-氟-2-d3-甲氧基硝基苯，從而制得1-[4-(3-甲氧基-4-胺基苯基)]乙酰哌嗪(化合物22)，LC-MS(APCI):m/z＝253.3(M+1)+,purity:96.2％。步驟2將氘代鹽酸(122mmL,1.47mmol)溶液加入至1-[4-(3-甲氧基-4-胺基苯基)]乙酰哌嗪(400mg,1.61mmol)的氘水(5mL)溶液中，在140℃下微波反應50分鐘。待反應液冷卻至室溫后，加入2M氫氧化鈉溶液調節pH至10。依次加入丙酮，乙酸酐，在室溫下攪拌10分鐘，移除丙酮，用乙酸乙酯萃取，收集有機相并用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥后過濾，干燥得目標產物1-[4-(3-甲氧基-4-胺基-2,5,6-d3-苯基)]乙酰哌嗪100mg,收率為54.1％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):4.26(brs,2H),3.73(s,3H),3.58-3.51(m,4H),2.94-2.84(m,4H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝507.3(M+1)+,purity:97.8％。步驟3按實施案例1步驟6所述方法，不同點在于，本例使用1-[4-(3-甲氧基-4-胺基-2,5,6-d3-苯基)]乙酰哌嗪代替1-[4-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)]乙酰哌嗪，從而值得目標化合物24，1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.14(s,1H),8.65(brs,1H),8.27(s,1H),8.07(s,1H),7.76(brs,1H),7.53(d,J＝7.8Hz,2H),7.25(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(brs,1H),6.48-6.39(m,1H),6.28-6.21(m,1H),5.74(dd,J＝9.9Hz,2.1Hz,1H),3.76(s,3H),3.56-3.50(m,4H),3.05-2.95(m,4H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝559.4(M+1)+,purity:97.5％。實施例5采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-乙酰基哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)-2,4,6-d3-苯基丙烯酰胺(化合物30)，即合成式(15)的化合物；采用以下步驟：步驟1依次將2,4,6-d3-1,3-苯二胺(111mg,11mmol)、MeOD(5ml)、二氯甲烷(40ml)加入至一個250mL的兩頸燒瓶中，在加入三乙胺(1.8g,18mmol)和2,2-二羥甲基丁酸(0.22g,1.8mmol)，在氮氣氛圍下用冰水冷卻反應液，將二碳酸二叔丁酯的二氯甲烷溶液在冰浴下逐滴加入，室溫下攪拌4小時。加水淬滅反應，用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，收集有機相，殘留物過柱分離得黃色固體產物(化合物28)910mg，收率為48％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):8.98(s，1H)，6.82(m，1H),4.95(s，2H)，1.44(s,9H).LC-MS(APCI):m/z＝112(M+1)+,purity:93.5％。步驟2按實施案例1所述方法，不同點在于，本例使用2,4,6-d3-3-N-Boc-苯胺代替3-N-Boc-苯胺，從而制得目標產物(化合物30)80mg，收率為37％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):10.16(s,1H),8.65(br,1H)，8.27(s,1H),8.09(s,1H),7.49(d,J＝2.7Hz,1H),7.25(s,1H),6.59(d,J＝2.7Hz,1H),6.39-6.44(m,1H),6.25(dd,J＝16.8Hz,2.1Hz,2H),5.73-5.77(m,1H)，3.76(s,3H)，3.56(s,4H),3.05(d,J＝18.9Hz,4H),2.04(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝559.2(M+1)+,purity:97.5％。實施例6采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)-苯基丙烯酰胺(化合物34)，即合成式(8)的化合物；采用以下步驟：步驟1將N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪、三乙胺溶于二氯甲烷溶液中，加入乙酸酐，在室溫下攪拌10分鐘，旋干過柱得黃色產物(化合物32)330mg，收率為94％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.89(d,J＝9.3Hz,1H),6.56(dd,J＝9.3Hz,2.7Hz,1H),6.50(d,J＝2.7Hz,1H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝291.5(M+1)+,purity:94.1％。步驟2按實施案例1所述方法，不同點在于，本例使用N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪代替N-乙酰哌嗪，從而制得目標產物(化合物34)150mg，收率為41.9％。1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.15(s,1H),8.63(br,1H),8.27(s,1H),8.08(s,1H),7.74(brs,1H),7.53-7.46(m,2H),7.25(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(br,1H),6.58(d,J＝2.1Hz,1H),6.48-6.39(m,1H),6.27-6.18(m,2H),5.75(dd,J＝9.9Hz,1.5Hz,1H).LC-MS(APCI):m/z＝570.5(M+1)+,purity:97.5％。實施例7采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基-3,5-d2-苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物38)，即合成式(23)的化合物；采用以下步驟：步驟1將氘代鹽酸溶液加入至N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪的氘水溶液中，在140℃下微波反應50分鐘，冷卻至室溫后，加入2M氫氧化鈉溶液中和至pH為10，用乙酸乙酯萃取，收集有機相，得目標產物(化合物35)380mg，收率為94.3％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.87(s,1H).LC-MS(APCI):m/z＝251.3(M+1)+,purity:94.6％。步驟2按實施案例1所述方法，不同點在于，本例使用N-(3-d3-甲氧基-硝基-2,6-d2-苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪代替N-(3-d3-甲氧基-硝基苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪，從未得到目標產物(化合物38)155mg，收率為51.2％。1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.15(s,1H),8.65(brs,1H),8.27(s,1H),8.08(s,1H),7.74(br,1H),7.53-7.47(m,2H),7.25(t,J＝8.4Hz,1H),7.14(brs,1H),6.48-6.39(m,1H),6.28-6.21(m,1H),5.74(dd,J＝9.9Hz,1.8Hz,1H),2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝570.5(M+1)+,purity:97.5.0％。實施例8采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-d3-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-d3-甲氧基-3,5-d2-苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺(化合物48)，即合成式(24)的化合物；按實施案例7所述方法，不同點在于，本例使用N-(3-d3-甲氧基-硝基-2,6-d2-苯基)-d3-乙酰基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪代替N-(3-d3-甲氧基-硝基-2,6-d2-苯基)-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-乙酰基哌嗪，從未得到目標產物(化合物40)190mg，收率為54.8％。1HNMR(300MHz,DMSO-D6)δ(ppm):10.14(s,1H),8.64(brs,1H),8.27(s,1H),8.07(s,1H),7.74(brs,1H),7.53-7.48(m,2H),7.25(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(brs,1H),6.47-6.39(m,1H),6.28-6.21(m,1H),5.74(dd,J＝9.9Hz,2.1Hz,1H).LC-MS(APCI):m/z＝570.5(M+1)+,purity:97.5％。實施例9采用以下合成路線制備N-(3-(2-(4-乙酰基-d8-哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)-2,4,6-d3-苯基丙烯酰胺(化合物41)，即所述式(27)的結構式；按實施案例3所述方法，不同點在于，本例使用化合物29代替化合物5，從而制得目標化合物41,83mg，收率為37％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):10.15(s，1H),8.64(br,1H)，8.27(s,1H)，8.09(s，1H)，7.48(d,J＝3.0Hz,1H)，7.25(s,1H)，6.58(d,J＝1.2Hz,1H)，6.38-6.44(m,1H),6.25(dd,J＝17.1Hz,2.1Hz,2H),5.73-5.77(m,1H)，3.76(s,3H)，2.03(s,3H).LC-MS(APCI):m/z＝567.1(M+1)+,purity:95.6％。實施例10對實施例1～9得到的化合物進行化合物的生物活性測試。化合物的生物評價是采用將本發明的化合物在多個測試中進行評價以確定它們的生物學活性。例如，可測試本發明化合物抑制多種關注的蛋白激酶的能力。一些測試的化合物對EGFR激酶顯示出強效的抑制活性。此外，在人A431皮膚癌細胞及人NCI-H1975和HCC827肺癌細胞細胞系中，篩選一些這些化合物中的抗增殖活性，且證明活性在1-50nM范圍。評價所述化合物在關注的腫瘤細胞上的細胞毒性或生長抑制作用。(1)激酶抑制作用化合物配制：受試化合物溶于DMSO配成20mM母液。在DMSO中梯度稀釋成100倍終濃度的稀釋液。加藥時用緩沖液稀釋成10倍終濃度的稀釋液。EGFR及EGFR[T790M/L858R]激酶檢測：配制緩沖液后，將酶與預先稀釋配制的不同濃度化合物混合10分鐘，每個濃度雙復孔。加入對應底物及ATP，室溫反應20分鐘(其中設置陰陽性對照)。反應完畢加入檢測試劑，室溫孵育30分鐘后上機檢測，采集數據。根據Graphpad5.0軟件進行數據分析及擬圖。EGFR[d746-750]激酶檢測：配制緩沖液后，將酶和抗體的混合溶液與預先稀釋配制的不同濃度化合物混合10分鐘，每個濃度雙復孔。加入Kinasetracer199，室溫孵育60分鐘(其中設置陰陽性對照)。反應完畢后上機檢測，采集數據，按照下式進行分析及擬圖。IC50＝[(ABS測試-ABS開始)/(ABS對照-ABS開始)]x100實施例1～9合成得到的取代的二氨基嘧啶類化合物的激酶抑制作用歸納于如下表1所示：表1實施例1～9的取代的二氨基嘧啶類化合物的激酶抑制作用分析表如表1所示，實施例1～9的取代的二氨基嘧啶類化合物與不良反應相關的EGFRWT表現出相對低的抑制活性(IC50大于60)，而對EGFRL858R/T790M突變體(其對可商購的EGFR抑制劑具有抗性)表現出優良的抑制活性(IC50小于10)，說明本發明化合物對EGFR具有較強的選擇抑制能力。(2)細胞毒性實驗細胞系：皮膚癌細胞A431；肺癌細胞HCC827；均用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基培養。化合物配制：受試化合物溶于DMSO配成20mM保存液，-20℃保存。用DMSO梯度稀釋成200倍終濃度的保存液。加藥時用再用細胞培養基稀釋成4倍終濃度的工作液。MTS細胞活力檢測：胰酶消化對數生長期細胞，按已優化的密度接種150μl于96孔板，24小時后加入培養基稀釋的4倍濃度化合物50μl/孔(濃度設置見表2.)。以加入同樣體積的0.5％DMSO的孔作為對照。細胞繼續培養72小時后，MTS檢測細胞活力。具體方法如下：貼壁細胞，棄去培養基，每孔加入含20μlMTS和100μl培養基的混合液。放入培養箱繼續培養1-4小時后檢測OD490，以OD650值作為參考。GraphPadPrism軟件制作量效曲線并計算IC50，實施例1～9合成得到的取代的二氨基嘧啶類化合物的細胞毒性實驗結果詳見表2所示。表2實施例1～9的取代的二氨基嘧啶類化合物的細胞毒性實驗數據實施例編號皮膚癌細胞IC50(nM)肺癌細胞IC50(nM)實施例1>1000<60實施例2>1000<60實施例3>1000<60實施例4>1000<60實施例5>1000<60實施例6>1000<60實施例7>1000<60實施例8>1000<60實施例9>1000<60由表2可見，表明實施例1～9的化合物對癌細胞體外增殖的具有抑制效果；其中對肺癌細胞的體外增殖的抑制作用比皮膚癌細胞的體外增殖抑制作用強。(3)大鼠中的藥代動力學評價8只雄性Sprague-Dawley大鼠，7-8周齡，體重約210g，分成2組，每組4只，單次口服給予5mg/kg劑量；(a)對照組：N-(3-(2-(4-乙酰哌嗪-1-基)2-甲氧基苯胺基)-5-三氟甲基嘧啶基-4胺基)苯基丙烯酰胺；(b)試驗組：實施例1-9，比較其藥代動力學差異。大鼠采用標準飼料飼養，給予水。試驗前16小時開始禁食。藥物用PEG400和二甲亞砜溶解。眼眶采血，采血的時間點為給藥后0.083小時，0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時和24小時。大鼠吸入乙醚后短暫麻醉，眼眶采集300μL血樣于試管。試管內有30μL1％肝素鹽溶液。使用前，試管于60℃烘干過夜。在隨后一個時間點血樣采集完成之后，大鼠乙醚麻醉后處死。血樣采集后，立即溫和地顛倒試管至少5次，保證混合充分后放置于冰上。血樣在4℃5000rpm離心5分鐘，將血漿與紅細胞分離。用移液器吸出100μL血漿到干凈的塑料離心管中，表明化合物的名稱和時間點。血漿在進行分析前保存在-80℃。用LC-MS/MS測定血漿中本發明化合物的濃度。藥代動力學參數基于每只動物在不同時間點的血藥濃度進計算。實驗結果表明，相對于對照化合物，實施例1-9的化合物在動物體內具有更好的藥物動力學，因而具有更好的藥效學和治療效果。(4)代謝穩定性評價微粒體實驗：人肝微粒體：0.5mg/mL，Xenotech；大鼠肝微粒體：0.5mg/mL，Xenotech；輔酶(NADPH/NADH)：1mM，SigmaLifeScience；氯化鎂：5mM，100mM磷酸鹽緩沖劑(pH為7.4)。儲備液的配制：精密稱取一定量的化合物實施例的粉末，并用DMSO分別溶解至5mM。磷酸鹽緩沖液(100mM，pH7.4)的配制：取預先配好的0.5M磷酸二氫鉀150mL和700mL的0.5M磷酸氫二鉀溶液混合，再用0.5M磷酸氫二鉀溶液調節混合液pH值至7.4，使用前用超純水稀釋5倍，加入氯化鎂，得到磷酸鹽緩沖液(100mM)，其中含100mM磷酸鉀，3.3mM氯化鎂，pH為7.4。配制NADPH再生系統溶液(含有6.5mMNADP，16.5mMG-6-P，3U/mLG-6-PD，3.3mM氯化鎂)，使用前置于濕冰上。配制終止液：含有50ng/mL鹽酸普萘洛爾和200ng/mL甲苯磺丁脲(內標)的乙腈溶液。取25057.5μL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至50mL離心管中，分別加入812.5μL人肝微粒體，混勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝微粒體稀釋液。取25057.5μL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至50mL離心管中，分別加入812.5μLSD大鼠肝微粒體，混勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝微粒體稀釋液。樣品的孵育：用含70％乙腈的水溶液將相應化合物的儲備液分別稀釋至0.25mM，作為工作液，備用。分別取398μL的人肝微粒體或者大鼠肝微粒體稀釋液加入96孔孵育板中(N＝2)，分別加入2μL0.25mM的的工作液中，混勻。代謝穩定性的測定：在96孔深孔板的每孔中加入300μL預冷的終止液，并置于冰上，作為終止板。將96孔孵育板和NADPH再生系統置于37℃水浴箱中，100轉/分鐘震蕩，預孵5min。從孵育板每孔取出80μL孵育液加入終止板，混勻，補充20μLNADPH再生系統溶液，作為0min樣品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生系統溶液，啟動反應，開始計時。相應化合物的反應濃度為1μM，蛋白濃度為0.5mg/mL。分別于反應10、30、90min時，各取100μL反應液，加入終止板中，渦旋3min終止反應。將終止板于5000×g，4℃條件下離心10min。取100μL上清液至預先加入100μL蒸餾水的96孔板中，混勻，采用LC-MS/MS進行樣品分析。數據分析：通過LC-MS/MS系統檢測相應化合物及內標的峰面積，計算化合物與內標峰面積比值。通過化合物剩余量的百分率的自然對數與時間作圖測得斜率，并根據以下公式計算t1/2和CLint，其中V/M即等于1/蛋白濃度。CLint=0.693t1/2·VM]]>對實施例1-9的化合物按照上述步驟進行分析，結果如表3所示。表3實施例1～9的取代的二氨基嘧啶類化合物的代謝穩定性的實驗結果如表3所示，通過與未經氘代的化合物CO-1686對照，實施例1～9的氘代的二氨基嘧啶類化合物可以改善代謝穩定性。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3