技術領域：
：本發明屬于生物催化
技術領域：
，具體涉及一種真菌催化甾體生物轉化的方法。
背景技術：
：：甾體化合物作為僅次于抗生素的第二大類藥物，其在生命體內具有調控各種物質代謝及生理作用的功能。甾體的工業化生產主要是改造天然甾體化合物的結構，與傳統化學方法合成相比，微生物轉化的方法可以形成多種甾體活性中間體且產物純度高。環糊精作為增溶劑能增加疏水性甾體的溶解度，其特殊空腔結構可以包結甾體底物，從而提高甾體化合物的生物利用度和產率。但是環糊精的價格較高，制約了其在生物催化領域中的大范圍應用；同時微生物轉化過程中大量反應溶液的使用造成浪費，并且污染環境，如tris-hcl緩沖液，pbs緩沖液等。采用合適的方法擴大環糊精在生物轉化反應中的應用以及減少反應溶液的浪費、降低環境污染是亟待解決的重要問題。通過接枝技術將環糊精固載到殼聚糖、海藻酸鈉等高分子載體上，可以把β-環糊精從溶于水的粉體材料制備成不溶于水的高分子材料，克服環糊精難回收的缺陷，使其能夠循環利用，降低工業使用的成本。接枝后的環糊精仍保留獨特的空腔結構及其它優良性質，同時還擁有了高分子載體良好的機械性能、穩定性等特征，這大大拓寬了環糊精的應用空間，提升了它的應用價值。通過將轉化液過濾，有機溶劑萃取后除去產物，所得的含有緩沖液的萃余相進行回收，可以有效實現反應溶液的重復利用，實現清潔生產，節約成本。中國專利cn105754984-a公布了海藻酸鈉復合固定化菌劑及其制備方法以及用途，公開了海藻酸鈉復合固定化菌劑及其制備方法，解決了現有技術中并沒有適用于二氯喹啉酸降解用假單胞菌的固定化方式的問題。本發明包括將具有假單胞菌的載體培養基和海藻酸鈉混合后，滴入濃度為1～4％的氯化鈣中靜置2～4h制成的顆粒劑；所述海藻酸鈉的質量濃度為2～6％；所述載體培養基包括吸附載體和無機鹽液體培養基；該吸附載體與海藻酸鈉的重量比為1～3:1，該吸附載體由重量比為1:1～2:1的玉米芯、竹炭和油枯組成。本發明通過有效提高菌體的降解效率；且本發明固定化菌劑的降解率遠遠高于空白小球物理吸附效率和游離菌株的生物降解效率之和,能有效達到相互促進的效果。海藻酸鈉作為天然高分子載體，分子中含有-cooh和-oh兩種親水基團，具有較強的親水性，并且可以環氧氯丙烷為交聯劑與環糊精進行接枝，形成的環糊精-海藻酸鈉接枝物可以固定化細胞。將轉化液進行過濾，濾液經離心過濾、有機溶劑萃取后，所得的含有反應溶液的萃余相除去殘留有機溶劑后，將其和環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠重新投入甾體生物催化反應，實現環糊精、真菌細胞和反應溶液的共循環。目前關于以海藻酸鈉作為載體，以天然高分子材料接枝環糊精的形式作為促溶劑運用于難溶化合物的生物轉化，并對環糊精、真菌細胞和反應溶液進行共循環利用的技術尚未可見。技術實現要素：：為了解決上述技術問題，本發明提供一種真菌催化甾體生物轉化的方法，具體如下：在真菌催化的甾體生物轉化反應中，以環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠作催化劑，反應結束后進行過濾，分別得濾液和過濾物，濾液經離心、有機溶劑萃取后，所得的含有反應溶液的萃余相除去殘留有機溶劑后備用，過濾物使用反應溶液洗滌1-6次后，重新用于甾體生物催化反應，從而實現環糊精介質、真菌細胞和反應溶液的循環利用；所述濾液的處理方法具體如下：(1)濾液經5000r/min離心10min后得二次濾液；(2)按照有機溶劑與二次濾液體積比為1-10:1加入有機溶劑萃取，收集萃余相；所述的有機溶劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、二氯甲烷或三氯甲烷；(3)萃余相30-45℃真空旋蒸除去殘留有機溶劑后，將回收的反應溶液重新用于甾體生物催化反應；所述的回收的反應溶液可循環利用6次以上；所述的真菌可以是赭曲霉、雅致小克銀漢霉、黑根霉、綠僵菌等甾體催化反應常用真菌菌株；所述反應溶液為tris-hcl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、生理鹽水，ph5.0-ph7.0；所述洗滌過濾物的反應溶液的用量為每克細胞膠珠10-100ml；所述環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠的制備方法如下：(1)海藻酸鈉接枝環糊精按海藻酸鈉和環糊精按摩爾比1:0.5-1:1.5稱取海藻酸鈉和環糊精，并加入海藻酸鈉質量30倍(v：m)的蒸餾水，70℃水浴中攪拌使之完全溶解；按環氧氯丙烷與蒸餾水體積比0.1:30加入環氧氯丙烷，同時按環氧氯丙烷與naoh溶液體積比0.1:10滴加0.5mol/l的naoh溶液，之后反應0.5-2h；(2)固定化細胞膠珠的制備待步驟(1)的反應液冷卻后，調節反應液的ph至5.0-6.0，加入終濃度為50-100g/l的真菌菌體靜息細胞，攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續浸泡0.5-2h，過濾，用反應溶液洗滌1-6次，即得環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠。所述的環糊精，具體為羥丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、磺丁基-β-環糊精、羧甲基-β-環糊精、羥乙基-β-環糊精、磺酸基-β-環糊精、羥丙基-γ-環糊精或甲基-γ-環糊精等；所述環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠可在不補加環糊精及微生物細胞的條件下循環使用6次以上；所述環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠可通過活化延長循環利用的次數，所述的活化方法具體如下：(1)將催化效率降低的環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠20-40g，投入到50ml發酵培養基進行活化，150-200r/min，28℃的搖床下振蕩培養18-24h；所述的發酵培養基為發酵培養菌體時使用的培養基；(2)培養結束后將發酵液過濾得到膠珠，用反應溶液將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定1-2h，反應溶液洗滌收集膠珠1-6次，置于4℃冰箱中保存備用。有益效果：(1)本發明首次實現環糊精介質、真菌細胞及反應溶液的循環利用，在提高甾體催化反應效率的同時降低生產成本、減少環境污染，達到用綠色方法進行生物轉化的目的，具有很好的應用價值和推廣前景。(2)本發明可以提高甾體底物生物催化初始轉化速率，提高最終轉化率。(3)本發明所述的環糊精循環利用工藝方法簡單便捷，便于實現，成本節約。具體實施方式：以下實施例僅用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1：環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠及其在17α羥基黃體酮羥基化反應中的應用微生物菌種采用赭曲霉(aspergillusochraceus)cicc41473，它能實現甾體化合物的c11位羥基化，將17α羥基黃體酮轉化為11，17α二羥基黃體酮；斜面培養基(g/l)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20；發酵培養基(g/l)：葡萄糖15，玉米漿40，蠶蛹粉2，硫酸銨1.5，ph4.5；赭曲霉靜息細胞的制備：赭曲霉經斜面活化后制備赭曲霉孢子懸浮液，并將其接入發酵培養基(50ml培養基/250ml三角瓶)中，使得三角瓶中的孢子的終濃度為106個/ml，28℃，200r/min培養18h后加入終濃度為0.1g/l的底物進行誘導，繼續培養6h后，將發酵液過濾，并用ph7.0的tris-hcl緩沖液洗滌三遍后收集菌體；環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠的制備：準確稱取海藻酸鈉1.0g(約5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:0.5的羥丙基-β-環糊精于100ml三角瓶中，加入約30ml蒸餾水，70℃水浴中電動攪拌使之完全溶解，加入0.1ml的環氧氯丙烷，同時滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，2h后停止反應。待反應液冷卻后，調節反應液的ph至5.5，加入3g菌體靜息細胞。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續浸泡2h，過濾，用tris-hcl洗滌4次。生物轉化：稱取0.06g的17α羥基黃體酮于100ml三角瓶中，加入20ml的tris-hcl(ph7.0)，實驗組加入40g上述步驟制備的環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，對照組加入不接枝環糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠，控制加入的菌體與實驗組等量，28℃、200r/min轉化18h，hplc法測定底物轉化率；環糊精、真菌細胞及反應溶液的循環利用工藝：將環糊精與海藻酸鈉接枝固定細胞后用于上述17α羥基黃體酮的羥基化反應，反應結束后過濾收集環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，將其用tris-hcl(ph7.0)洗滌3次，反應溶液的用量為每次每克細胞膠珠50ml。濾液5000r/min離心10min得二次濾液，加入兩倍于二次濾液量的乙酸乙酯，萃取三次，萃余相45℃真空旋蒸除去殘留的乙酸乙酯，將其和過濾物即環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，重新投入甾體生物催化反應，進行循環利用，hplc法測定每次循環后的底物轉化率；結果表明，對照組的初次轉化率為80％，接枝羥丙基-β-環糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠的初次轉化率是96％，循環利用6次后，17α羥基黃體酮的最終轉化率仍高達92％，見表1。循環使用6次后對環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠進行活化，活化方法具體如下：(1)將催化效率降低的環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠20g，投入到50ml發酵培養基進行活化，150r/min，28℃的搖床下振蕩培養18h；所述的發酵培養基為發酵培養菌體時使用的培養基；(2)培養結束后將發酵液過濾得到膠珠，用tris-hcl將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定1h，反應溶液洗滌收集膠珠3次，置于4℃冰箱中保存并繼續循環使用3次，結果見表1。表1循環次數123456789轉化率96％94％93％92％91％92％95％92％93％實施例2：除以下內容外，其他同實施例1。環糊精-海藻酸鈉固定化細胞的制備：準確稱取海藻酸鈉1.0g(約5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:1.5的羧甲基-β-環糊精于100ml三角瓶中，加入約30ml蒸餾水，70℃水浴中電動攪拌使之完全溶解，加入0.1ml的環氧氯丙烷，同時滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，1.5h后停止反應。待反應液冷卻后，加入3g菌體靜息細胞。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續浸泡1.5h，過濾，用生理鹽水洗滌3次備用。生物轉化：稱取0.06g的17α羥基黃體酮于100ml三角瓶中，加入20ml的生理鹽水，實驗組加入40g上述步驟制備的環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，對照組加入不接枝環糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠，控制加入的菌體與實驗組等量，28℃、200r/min轉化18h，hplc法測定底物轉化率；將環糊精與海藻酸鈉接枝后用于上述17α羥基黃體酮的生物催化反應，反應結束后收集環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，將其用生理鹽水洗滌4次，反應溶液的用量為每次每克細胞膠珠80ml，濾液5000r/min離心10min得二次濾液，加入三倍于二次濾液量的二氯甲烷，萃取三次，萃余相30℃真空旋蒸除去殘留的二氯甲烷。將其和過濾物即環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，重新投入甾體生物催化反應，進行循環利用，hplc法測定每次循環后的底物轉化率；結果表明，接枝羧甲基-β-環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠首次用于17α羥基黃體酮生物催化的初始轉化速率是對照組的1.1倍，循環利用7次后，17α羥基黃體酮的最終轉化率為91％，見表2。循環使用7次后對環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠進行活化，活化方法具體如下：(1)將催化效率降低的環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠40g，投入到50ml發酵培養基進行活化，200r/min，28℃的搖床下振蕩培養24h；所述的發酵培養基為發酵培養菌體時使用的培養基；(2)培養結束后將發酵液過濾得到膠珠，用生理鹽水將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定2h，反應溶液洗滌收集膠珠6次，置于4℃冰箱中保存并繼續循環使用3次，結果見表2。表2循環次數12345678910轉化率93％92％95％91％90％90％91％95％94％90％實施例3：除以下內容外，其他同實施例1。環糊精接枝海藻酸鈉固定化細胞：準確稱取海藻酸鈉1.0g(約5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:1的甲基-β-環糊精于100ml三角瓶中，加入約30ml蒸餾水，70℃水浴中電動攪拌使之完全溶解，加入0.1ml的環氧氯丙烷，同時滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，約1.5h后停止反應。待反應液冷卻后，加入3g菌體靜息細胞。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續浸泡2h，過濾，用乙酸-乙酸鈉(ph5.5)洗滌2次。生物轉化：稱取0.06g的17α羥基黃體酮于100ml三角瓶中，加入20ml的乙酸-乙酸鈉(ph5.5)，再加入30g環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，對照組加入不接枝環糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠，28℃、200r/min轉化18h，hplc法測定底物轉化率；將環糊精與海藻酸鈉接枝后用于上述17α羥基黃體酮的生物催化反應，反應結束后收集環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，將其用乙酸-乙酸鈉(ph5.5)洗滌2次，反應溶液的用量為每次每克細胞膠珠100ml，濾液5000r/min離心10min得二次濾液，加入7倍于二次濾液量的三氯甲烷，萃取三次，萃余相35℃真空旋蒸除去殘留的三氯甲烷。將其和過濾物即環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，重新投入甾體生物催化反應，進行循環利用，hplc法測定每次循環后的底物轉化率；結果表明，接枝甲基-β-環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠首次用于17α羥基黃體酮生物催化的初始轉化速率是對照組的1.4倍，循環利用7次后，17α羥基黃體酮的最終轉化率為92％，見表3。表3循環次數1234567轉化率91％93％93％94％91％94％92％實施例4：環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠及其在17α羥基黃體酮羥基化反應中的應用微生物菌種采用雅致小克銀漢霉(cunningpamyceteselegans)cicc40250，它能實現甾體化合物的c11位羥基化，將17α羥基黃體酮轉化為11，17α二羥基黃體酮；斜面培養基(g/l)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20；發酵培養基(g/l)：葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨5，氯化鈉5，磷酸氫二鉀0.5，ph6.5；雅致小克銀漢霉靜息細胞的制備：雅致小克銀漢霉經斜面活化后，制備孢子懸浮液，并接入發酵培養基(50ml培養基/250ml三角瓶)中，使得三角瓶中的孢子的終濃度為106個/ml，28℃，150r/min培養24h后，將發酵液過濾后用ph5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液洗滌三遍后收集菌體；環糊精-海藻酸鈉固定化細胞的制備：準確稱取海藻酸鈉1.0g(約5.0mmol)，加入與之摩爾比為1:1.2的羥丙基-β-環糊精于100ml三角瓶中，加入約30ml蒸餾水，70℃水浴中電動攪拌使之完全溶解，加入0.1ml的環氧氯丙烷，同時滴加10ml0.5mol/l的naoh溶液，約10min滴完，約1h后停止反應。待反應液冷卻后，調節反應溶液的ph至5.0，加入2.5g菌體靜息細胞。將混懸液攪拌均勻，在磁力攪拌下用注射器滴加到0.5mol/l的cacl2溶液中，將膠珠在cacl2溶液中繼續浸泡2h，過濾，用乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph5.0)洗滌4次。生物轉化：稱取0.06g的17α羥基黃體酮于100ml三角瓶中，加入20ml的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph5.0)，實驗組加入30g上述步驟制備的環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，對照組加入不接枝環糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠，控制加入的菌體與實驗組等量，28℃、150r/min轉化14h，hplc法測定底物轉化率；環糊精、真菌細胞及反應溶液的循環利用工藝：將環糊精與海藻酸鈉接枝固定細胞后用于上述17α羥基黃體酮的羥基化反應，反應結束后過濾收集環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，將其用乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph5.0)洗滌3次，乙酸-乙酸鈉緩沖液的用量為每次每克細胞膠珠50ml。濾液5000r/min離心10min得二次濾液，加入五倍于二次濾液量的乙酸異丁酯，萃取三次，萃余相45℃真空旋蒸除去殘留的乙酸異丁酯。將其和過濾物即環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠，重新投入甾體生物催化反應，進行循環利用，hplc法測定每次循環后的底物轉化率；結果表明，對照組的初次轉化率為76％，接枝羥丙基-β-環糊精的海藻酸鈉固定化細胞膠珠的初次轉化率是95％，循環利用6次后，17α羥基黃體酮的最終轉化率仍高達91％，見表4。循環使用6次后對環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠進行活化，活化方法具體如下：(1)將催化效率降低的環糊精-海藻酸鈉固定化細胞膠珠30g，投入到50ml發酵培養基進行活化，180r/min，28℃的搖床下振蕩培養20h；所述的發酵培養基為發酵培養菌體時使用的培養基；(2)培養結束后將發酵液過濾得到膠珠，用乙酸-乙酸鈉緩沖液將膠珠洗滌干凈后，將其置于cacl2溶液中再次固定1.5h，反應溶液洗滌收集膠珠3次，置于4℃冰箱中保存并繼續循環使用3次。表4循環次數123456789轉化率95％95％93％94％91％91％93％92％90％雖然上文已經用一般性說明、具體實施方式及實驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。當前第1頁12