一種快速提取動物組織和細菌DNA的方法與流程

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種快速提取動物組織和細菌dna的方法。

背景技術：

幽門螺桿菌已證實是胃炎和消化性潰瘍的主要致病菌，是導致胃癌發生的重要危險因素，相關的個體化治療及個體化用藥被認為對提高根除率有積極的意義。個體化治療需要進行胃鏡下胃粘膜組織取樣，從而完成對幽門螺桿菌耐藥性和患者代謝型的分子診斷檢測。而進行分子生物學檢驗的前提是要快速有效地獲得其dna。

目前dna的提取方法主要有物理方式、化學方式和生物酶方式。物理方式有玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法和加熱煮沸法；化學方式包括ctab法、異硫氰酸胍法、堿裂解法；生物方式為酶法。其中以ctab法為最常用的方法。上述方法各有優點，但是也有不足之處。比如ctab法效果較好，但是操作繁瑣復雜，耗時較長。超聲波法需要專門的儀器。加熱煮沸法和堿裂解法雖然簡單快速，但是有雜質較多和提取的dna含量少的問題。生物酶法的酶有容易失活的問題。

當前，在“精準治療”的趨勢下，基因診斷依據其敏感性、準確性以成為幽門螺桿菌耐藥檢測及宿主代謝型判定的重要手段。通常細菌耐藥檢測和宿主代謝型檢測是分開進行的，即細菌耐藥標本取自患者的胃黏膜組織，而宿主代謝型標本取自患者的血液。如此情況下，即給患者帶來了身心的損傷，也造成了不必要的經濟損失。而在胃粘膜組織中，能夠同時高效的提取出宿主和細菌基因組。

技術實現要素：

本發明的主要目的是提供一種可以快速提取動物組織和細菌dna的方法。本發明所要解決的技術問題是要在胃粘膜組織上快速、簡單、有效地提取人和幽門螺桿菌的基因組，便于后續的分子生物學檢驗。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：在蒸餾水中溶解naoh，edta曲拉通(tritonx-100)，np-40和tris-hcl，充分混合混勻，配成裂解提取液。

所述dna裂解提取液，每1000ml含有以下成分：1.0g的naoh固體，1.0ml的edta(0.1m，ph8.0)，10.0ml的曲拉通(tritonx-100)，10.0ml的np-40，10.0ml的tris-hcl(ph8.0)，其余為蒸餾水。

進一步的，所述dna提取方法包括以下步驟：

(1)取豆粒大小的胃粘膜組織約50mg，置于2ml的干凈ep管中；

(2)加入滅菌過的小鋼珠1個(直徑2.5mm)，并使用移液器加入100μl的上述裂解提取液；

(3)使用機械研磨儀50～60hz，研磨時長90～120秒；

(4)簡短離心后，將研磨液轉移到1.5ml的干凈的ep管中，棄小鋼珠；

(5)95℃金屬浴或水浴10分鐘；

(6)在4℃環境內靜置20～30分鐘；

(7)4℃，12000rpm離心5分鐘后取上清，4℃或-20℃貯存備用。

本發明對近1000份胃粘膜和細菌進行提取驗證，可以快速提取dna，操作簡單、實用，在保證基因檢測準確性的前提下，不但大大縮短了基因檢測時間，而且節約了成本。本發明也可以用于其他動物和細菌dna的快速提取。

附圖說明

圖1是提取的胃粘膜組織及細菌的dna的電泳檢測圖；其中m為marker； 1，2，3分別對應樣本1、2、3。

圖2是樣本3號的cyp2c19基因測序峰圖。

圖3是樣本3號的細菌耐藥基因位點測序峰圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述。

本發明的實施例1：

一、dna裂解液的配制

dna裂解提取液制備方法為：

(1)稱量1.0g的naoh固體，置于燒杯中，加入適量的蒸餾水溶解，玻璃棒攪拌混勻；

(2)吸取1.0ml的edta(0.1m，ph8.0)溶液，加入燒杯中，混勻；

(3)向燒杯中加入10.0ml的tris-hcl(ph8.0)溶液混勻；

(4)向燒杯中加入10.0ml曲拉通(tritonx-100)，充分溶解混勻；

(5)然后加入10.0ml的np-40溶液，混勻；

(6)容量瓶定容，加入蒸餾水至1000ml，充分混勻，配制好的裂解提取液-20℃環境密封保存，備用。

二、胃粘膜組織dna的提取

(1)將上述裂解提取液置于室溫溶解，備用；

(2)取豆粒大小的胃粘膜組織約50mg，置于2ml的干凈ep管中；

(3)加入滅菌過的小鋼珠1個(直徑2.5mm)，并使用移液器加入100μl的上述裂解提取液；

(4)使用機械研磨儀50～60hz，研磨時長90～120秒；

(5)簡短離心后，將研磨液轉移到1.5ml的干凈的ep管中，棄小鋼珠；

(6)95℃金屬浴或水浴10分鐘；

(7)在4℃環境內靜置20～30分鐘；

(8)4℃，12000rpm離心5分鐘后取上清，4℃或-20℃貯存備用。

三、本配方適用范圍

上述裂解提取液可用于人和幽門螺桿菌dna的同時提取，也可以用于其他各種動物和細菌的dna的提取。提取的dna產物可以用于pcr反應、人cyp2c19基因檢測和細菌耐藥基因位點檢測等。

上述的具體實施方式只是示例性的，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于

本技術：
所附權利要求書所限定的范圍。

技術特征：

技術總結
本發明涉及一種快速提取動物組織和細菌DNA的方法，所述的DNA提取方法可以從胃黏膜組織上對人和幽門螺桿菌進行快速的提取。DNA裂解提取液含有：NaOH，EDTA曲拉通(Triton?X-100)，NP-40，Tris-HCl和蒸餾水。DNA提取方法包括以下步驟：分別加入樣本、裂解提取液和小鋼珠，經過機械研磨，熱裂解，靜置沉淀和離心，就可得到DNA的澄清溶解液。本發明操作簡單，實用，也可以用于其他動物和細菌DNA的快速提取。

技術研發人員：楊比特;李磊;楊寧敏
受保護的技術使用者：杭州致遠醫學檢驗所有限公司
技術研發日：2016.03.29
技術公布日：2017.10.10