本發明涉及生物醫藥領域，特別是涉及一種多肽化合物分子，及該化合物的制備方法與其在制備用于提升動物機體的免疫能力及對疫苗的免疫應答能力的藥物中的應用。
背景技術：
：生物體的遺傳基因被存儲在多聚脫氧核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執行生物學功能的蛋白質。生物體內的蛋白質多種多樣，它們行使著各種生物學功能維持生命活動。蛋白質的種類雖然多不勝舉，但它們基本上都是由20個自然界存在的天然氨基酸組成。由于氨基酸的組成和排列順序的差異導致了蛋白質的千差萬別。一般來說，含有50個以上氨基酸的分子被稱為蛋白質，一般超過10個氨基酸的肽鏈被稱為多肽，少于10個氨基酸的肽鏈被稱做寡肽。目前發現最小的功能小肽只有2個氨基酸，通常較為常見的是4個以上的功能小肽。由于人類基因組計劃的完成和人類蛋白組計劃的開展，將會有越來越多的蛋白質功能片段被發現并被作為藥物應用到生物醫藥領域中來。蛋白質的功能片段通常是指被發現具備某種特定生物學功能的直鏈多肽片段，它們通常是幾十個至兩個氨基酸組成的肽類片段，被鑒定和發現的蛋白質功能片段可通過人工合成的途徑制備。現已開發并在臨床上得到應用的多肽藥物有“催產素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽鏈的基礎上進行人工改構制備成為用于治療消化道出血和肢端肥大癥的多肽藥物“奧曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白質中的功能片段常常能篩選到含有幾十個或小到只有二個氨基酸組成的多肽片段，它們為人工合成多肽功能片段并將它們投入應用奠定了基礎。在蛋白質、多肽或寡肽中，單一氨基酸的缺失、增加或被替換；氨基端(N端)或羧基端(C端)被封閉；序列中或游離端被添加化學基團都會使得蛋白質、多肽或寡肽原有的生物學活性發生改變。設計、篩選和發現具有新的功能肽段或尋找高效肽段是藥物開發的一個重要環節。技術實現要素：本發明的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，一方面，提供一種多分支的多肽化合物，其結構式為：(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY，或{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY，或{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY；XA、XB、XD、XE和XG分別為脂肪族氨基酸分子中的一種(可相同也可不相同)，XC和XF為脂肪族氨基酸分子或雜環族氨基酸分子(可相同也可不相同)，K為賴氨酸(Lys,K)，X和Y為空或任意一個或多個氨基酸或化學基團；(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY結構見式4：{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY結構見式5：{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY結構見式6：X和Y為空、或任意一種氨基酸，或任意個氨基酸組成的肽片段，或能將氨基酸或肽片段連接起來的化學基團，X和Y可相同，可不同；例如X為空，Y為甘氨酸(Gly，G)XA、XB、XD、XE和XG分別選自丙氨酸(Ala,A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)或谷氨酰胺(Gln，Q)，XA、XB、XD、XE和XG可相同也可不相同；XA優選甘氨酸(Gly，G)、蘇氨酸(Thr，T)、精氨酸(Arg，R)、谷氨酸(Glu,E)、丙氨酸(Ala,A)、賴氨酸(Lys，K)、亮氨酸(Leu，L)或絲氨酸(Ser，S)，更優選甘氨酸(Gly，G)、蘇氨酸(Thr，T)或精氨酸(Arg，R)；XB優選谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu,E)、精氨酸(Arg，R)、丙氨酸(Ala,A)、蘇氨酸(Thr，T)、亮氨酸(Leu，L)或賴氨酸(Lys，K)，更優選谷氨酰胺(Gln，Q)、精氨酸(Arg，R)或賴氨酸(Lys，K)；XD優選精氨酸(Arg，R)、絲氨酸(Ser，S)、亮氨酸(Leu，L)、賴氨酸(Lys，K)、天冬氨酸(Asp,D)、甘氨酸(Gly，G)或谷氨酸(Glu,E)，更優選精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)或甘氨酸(Gly，G)；XE優選精氨酸(Arg，R)賴氨酸(Lys，K)、亮氨酸(Leu，L)或谷氨酰胺(Gln，Q)，更優選精氨酸(Arg，R)或賴氨酸(Lys，K)；XG優選精氨酸(Arg，R)、甘氨酸(Gly，G)、纈氨酸(Val，V)、賴氨酸(Lys，K)、亮氨酸(Leu，L)或谷氨酸(Glu,E)，更優選精氨酸(Arg，R)、甘氨酸(Gly，G)、纈氨酸(Val，V)或谷氨酸(Glu,E)。XC和XF分別選自丙氨酸(Ala,A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)或脯氨酸(Pro,P)，XC和XF可相同也可不相同；XC優選賴氨酸(Lys，K)、脯氨酸(Pro,P)、色氨酸(Trp,W)、丙氨酸(Ala,A)、亮氨酸(Leu，L)、組氨酸(His,H)或天冬氨酸(Asp,D)，更優選脯氨酸(Pro,P)、亮氨酸(Leu，L)或組氨酸(His,H)；XF優選脯氨酸(Pro,P)、谷氨酸(Glu,E)、天冬氨酸(Asp,D)、組氨酸(His,H)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala,A)或賴氨酸(Lys，K)，更優選脯氨酸(Pro,P)、谷氨酸(Glu,E)、天冬氨酸(Asp,D)、組氨酸(His,H)或賴氨酸(Lys，K)。X優選酪氨酸(Tyr，Y)、精氨酸(Arg，R)、絲氨酸(Ser，S)、天冬酰胺(Asn，N)、甘氨酸(Gly，G)、谷氨酸(Glu,E)或空，更優選酪氨酸(Tyr，Y)、精氨酸(Arg，R)或空；Y優選甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala,A)、半胱氨酸(Cys，C)或空，更優選甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala,A)或半胱氨酸(Cys，C)。本發明還包括在所述多肽化合物基礎之上通過在氨基酸的側鏈基團或序列末端化學修飾、改造而產生的衍生物，如：所述多肽化合物與有機酸或無機酸形成的鹽類化合物；所述的多肽化合物所帶有的羥基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物；所述的多肽化合物所帶有的巰基可形成但不限于所形成的硫醚、硫苷，或與半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫鍵的化合物；所述的多肽化合物所帶有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物、烴化物、與糖類物質所形成的苷類物質等；所述的多肽化合物所帶有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺類化合物等；所述的多肽化合物所帶有的亞氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烴化物等；所述的多肽化合物所帶有的酚羥基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙類化合物，與有機堿或無機堿所形成的鹽類化合物；所述的多肽化合物與金屬離子所形成的配合物、絡和物或螯合物；所述的多肽化合物所形成的水合物或溶劑物。第二方面，本發明提供一種藥物組合物，其含有上述的多肽化合物、其幾何異構體、其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物以及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。第三方面，本發明提供制備上述多肽化合物的方法，(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY合成路線見式1，先把Y固定在WANG固相樹脂上，再通過縮合連接賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(Lys,K),形成具有一個分支節點的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；進而在“>KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端與XAXBXCXDXEXFXG-X片段連接，形成兩分支肽(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY-WANG固相樹脂；或在“>KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端逐一縮合連接氨基酸X、XG、XF、XE、XD、XC、XB、XA，得到(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY-WANG固相樹脂；最后將兩分支肽從WANG固相樹脂上裂解下來，通過純化得到二拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY；{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY合成路線見式2，把Y固定在WANG固相樹脂上，再通過縮合連接賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH形成具有一個分支節點的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”。繼續將“>KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端與賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的羧基端縮合連接，形成具有兩個分支節點的四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”；進而將“>K2KY-WANG固相樹脂”的每個賴氨酸K的兩個活性氨基末端與XAXBXCXDXEXFXG-X片段連接，形成四分支肽(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY-WANG固相樹脂；或將“>K2KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端逐一縮合連接氨基酸X、XG、XF、XE、XD、XC、XB、XA，得到(XAXBXCXDXEXFXG-X)4K2KY-WANG固相樹脂；最后將四分支肽從WANG固相樹脂上裂解下來，通過純化得到四拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY；{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY合成路線見式3，把Y固定在WANG固相樹脂上，再通過縮合連接賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH,形成具有一個分支節點的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；繼續將K的兩個活性氨基末端與賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的羧基端縮合連接，形成四分支骨架“K2KY-WANG固相樹脂”；再繼續將四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端與賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的羧基端縮合連接，形成具有四個分支節點的八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相樹脂”；進而在“>K4K2KY-WANG固相樹脂”的每個賴氨酸K的兩個活性氨基末端與XAXBXCXDXEXFXG-X片段連接，形成八分支肽(XAXBXCXDXEXFXG-X)8K4K2KY-WANG固相樹脂；或在“>K4K2KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端逐一縮合連接氨基酸X、XG、XF、XE、XD、XC、XB、XA，得到(XAXBXCXDXEXFXG-X)8K4K2KY-WANG固相樹脂；最后將八分支肽從WANG固相樹脂上裂解下來，通過純化得到八拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY。在將K的羧基端與Y-WANG固相樹脂縮合前，需要先將K的兩個氨基保護起來，優選叔丁氧羰基(Boc)保護法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護法；所述另外兩個賴氨酸的羧基與KY中K的兩個氨基縮合前，先將該每個賴氨酸的兩個氨基保護起來；XAXBXCXDXEXFXG-X的羧基與該每個賴氨酸的氨基縮合前，先將XAXBXCXDXEXFXG-X中的氨基保護起來；保護方法優選叔丁氧羰基(Boc)保護法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護法。具體步驟為：步驟一：用Fmoc保護法將賴氨酸K中的兩個氨基保護起來；步驟二：用多肽自動合成儀，將KY固定在WANG固相樹脂上，連接順序為：KY-WANG固相樹脂；制備二拷貝的多肽化合物時，在KY的賴氨酸活化后的兩個氨基端上繼續縮合連接另外兩個XAXBXCXDXEXFXG-X，得到固定在WANG固相樹脂上的二拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY；或在KY的賴氨酸活化后的兩個氨基端上繼續縮合連接另外兩個賴氨酸K，且該每個賴氨酸K上的兩個氨基已被Fmoc保護，制備得到兩分支骨架K2KY-WANG固相樹脂；制備四拷貝的多肽化合物時，在兩分支骨架“K2”的每個賴氨酸K活化后的兩個氨基末端繼續進行兩個XAXBXCXDXEXFXG-X的縮合，得到固定在WANG固相樹脂上的四拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY；或在兩分支骨架“K2”的每個賴氨酸K活化后的兩個氨基末端繼續進行兩個賴氨酸K的縮合，該每個賴氨酸K上的兩個氨基已被Fmoc保護，制備得到四分支骨架K4K2KY-WANG固相樹脂；制備八拷貝的多肽化合物時，在四分支骨架“K4”的每個賴氨酸K活化后的兩個氨基末端繼續進行兩個XAXBXCXDXEXFXG-X的縮合，得到固定在WANG固相樹脂上的八拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY；最后用TFA法將多肽化合物從WANG固相樹脂上裂解下來，得到了多肽化合物粗品；步驟三：用色譜柱(型號為DaisoC18，10μm,50x250mm)純化多肽化合物粗品，流動相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測波長220納米；收集流出峰溶液，再經過冷凍干燥，得到呈白色絮狀的多肽化合物。第四方面，本發明提供上述多肽化合物或上述方法制備得到的多肽化合物在制備人或動物用免疫藥物或增強免疫功能藥物中的應用。本發明提供的多肽化合物將多拷貝的共七個氨基酸分子共價連接，形成分支狀的多肽化合物。該多肽化合物有望成為多種藥物的有效成分，在制備預防、治療多種病癥的藥物用都會有所應用，特別是在制備增強免疫能力藥物中會廣泛應用，還可以作為分子示蹤劑使用，抑制血管新生的使用，當XAXBXCXDXEXFXG片段之中的XC、XF為雜環氨基酸，如為組氨酸(His)時，形成的化合物提供了可被同位素碘(I125或I131)標記的位點，由于是分支肽，在生理環境下對氨肽酶或羧肽酶均具有較好的抵抗，使肽分子更夠較為穩定地攜帶標記物被追蹤，更好地規避了因肽分子失去標記物難以獲得有效追蹤的后果風險。本發明闡述的多肽化合物由于是非天然分子結構，對生理環境下的降解酶不敏感，因此能有效延長該多肽化合物在生物體內的作用半衰期，使其生物學作用在體內更加持久。具體實施方式本發明涉及設計和制備出一種含有多拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的分支狀多肽分子(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY，或{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY，或{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY，其中，XA、XB、XD、XE和XG為脂肪族氨基酸分子，分別選自丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中一種，可相同或不同；XC、XF可為脂肪族氨基酸分子，也可為雜環族氨基酸分子(包括：色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P))，分別選自丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中一種，可相同或不同；K為含有兩個活性氨基的賴氨酸FmocLys-(Fmoc)-OH，X和Y為空或任意一個氨基酸或任意多個氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來的化學基團。本發明闡述的多肽化合物通過變化XA、XB、XC、XD、XE、XF、XG的種類用以適應治療多種疾病，尤其是提高人或動物機體的體液免疫及細胞免疫能力，從而開發出一種可在臨床應用(人用或動物用)涉及增強免疫功能的藥物。1963年美國科學家R.B.Merrifield發明創立了將目的肽的氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性樹脂上，樹脂上結合的氨基酸的氨基端(N端)與有待連接的氨基酸的羧基端進行縮合反應達到延長肽鏈的固相合成法；也就是從多肽的羧基端(C端)開始逐個氨基酸縮合并向多肽段的氨基端(N端)方向不斷延伸。因此，在進行氨基酸的縮合反應時，要將有待連接的氨基酸上的氨基及側鏈基團保護起來避免發生反應。目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保護法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護法，因此每連接上一個氨基酸就要經歷一次脫保護的過程(即固相載體上的氨基先脫保護，再同過量的有待連接的下一個目標氨基酸的羧基發生縮合反應以延長肽鏈)。通過這樣的步驟反復多次地進行下去，即：縮合、洗滌、脫保護、中和、洗滌，再進入下一輪縮合(連接目標氨基酸)，直至達到所需要合成的目標肽鏈長度。合成完成后采用TFA法將目的多肽從樹脂上裂解下來，得到目的肽的粗品。純化過程如下：一般情況下，合成直鏈多肽時，使用的是帶有一個活性氨基的賴氨酸(Lys，K)Fmoc-Lys(Boc)-OH，其側鏈的氨基被BOC-OH保護不參與縮合反應。因此賴氨酸(Lys，K)中只有一個氨基可以發生縮合反應，氨基酸被逐一連接肽鏈得以沿直鏈延長。然而，合成本發明闡述的分支骨架時，分支點是一個帶有兩個活性氨基的賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，賴氨酸的側鏈氨基也參與縮合反應，因此從該賴氨酸(Lys，K)處繼續進行氨基酸縮合反應就會形成分支鏈，形成分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”，在此基礎上繼續進行下一循環的賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH縮合，就形成四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”；再繼續進行Fmoc-Lys(Fmoc)-OH縮合，形成八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相樹脂”。本發明是以KY帶有兩個活性氨基的賴氨酸(Lys，K，Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)為分支點，同時縮合連接兩個用于下一步的氨基酸。若連接的是XAXBXCXDXEXFXG-X，則形成的是含二拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的兩分支(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY肽分子。或者先連接兩個K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成兩分支骨架，且“K2”的兩個用于下一步的氨基酸K各自帶兩個活性氨基，就形成了帶有四個活性氨基的分支點供下一步縮合氨基酸(XAXBXCXDXEXFXG-X)。如此按照XAXBXCXDXEXFXG-X的序列進行縮合延長肽鏈即形成了含有四拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的四分支{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY肽分子。還可以先連接兩個K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成兩分支骨架，再連接四個K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成四分支骨架，且“K4”的四個用于下一步的氨基酸K各自帶兩個活性氨基，就形成了帶有八個活性氨基的分支點供下一步縮合氨基酸(XAXBXCXDXEXFXG-X)。如此按照XAXBXCXDXEXFXG-X的序列進行縮合延長肽鏈即形成了含有八拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的八分支{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY肽分子。以此類推，可以形成含有十六拷貝、三十二拷貝、……XAXBXCXDXEXFXG-X的多分支肽分子。使用WANG固相樹脂合成完成后，采用TFA法將肽鏈從WANG固相樹脂上裂解下來得到以上的兩分支、四分支、八分支、……的肽分子。多肽合成目前成為常規技術。多肽合成及純化的原理和操作參見由盛樹力主編，科學技術文獻出版社(1998年)出版的“多肽激素的當代理論和應用”一書的第三章“多肽的化學合成和純化”。本發明合成制備多肽化合物的方式可以參照以上固相合成方式，但并不局限于此合成方式。以下結合具體實施例，更具體地說明本發明的內容，并對本發明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發明有任何限制。本領域技術人員在本說明書的啟示下對本發明實施例中所作的任何變動都將屬于本發明。實施例1：拷貝肽片段的合成本發明的多肽化合物不論是兩分支、還是四分支、八分支，都具有相同的拷貝肽片段XAXBXCXDXEXFXG-X片段。該拷貝肽片段中XA、XB、XD、XE和XG為脂肪族氨基酸分子(可相同也可不相同)，選自丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的一種或幾種；XC和XF為脂肪族氨基酸分子，還可為雜環氨基酸(可相同也可不相同)，選自脂肪族氨基酸分子、色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的一種或兩種；X、Y為空或任意一個氨基酸或任意多個氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來的化學基團，組合方式見表2-4，但不限于此。合成時，可采用有機化學Fmoc保護的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：選擇商業原料“X-WANG固相樹脂”或“XG-WANG固相樹脂”作為起始，保護基團采用Fmoc保護法將X或XG末端的氨基保護起來；步驟二：選用XG或XF進行氨基酸的逐一縮合延長肽鏈，合成XAXBXCXDXEXFXG-X拷貝肽片段:本實施例中拷貝肽片段的合成是在多肽自動合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動合成儀(ABI433A型)，先把X或XG固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護方式載體)上，再通過縮合連接氨基酸(XG、XF、XE、XD、XC、XB、XA或XF、XE、XD、XC、XB、XA)，實際的連接順序為：XAXBXCXDXEXFXG-X-WANG固相樹脂從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了XAXBXCXDXEXFXG-X拷貝肽片段粗品。步驟三：純化XAXBXCXDXEXFXG-X拷貝肽片段采用色譜柱(型號為DaisoC18，10μm,50×250mm)，色譜操作流動相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測波長220納米。收集流出峰溶液，再經過冷凍干燥。得到呈白色絮狀的XAXBXCXDXEXFXG-X拷貝肽片段，經密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。XA、XB、XC、XD、XE、XF、XG合成原料均可通過商業途經采購獲得。在制備本發明的多肽化合物時，也可外購的X-固相樹脂或XG-固相樹脂為原料，按照上述方法在X或XG的氨基末端繼續縮合氨基酸，得到本發明的肽片段，表1中列出部分合成得到的肽片段，并測得其質譜分子量。表1拷貝肽片段XAXBXCXDXEXFXG-X的各基團列表表1結果表明，本發明合成出的拷貝肽片段質譜分子量與理論分子量的差距不到1％，說明該拷貝肽片段確證為對應實施例的拷貝肽片段。此實施例部分是為了公開拷貝肽片段的內容，并不是對本發明的限制，實際合成時可按以下實施例中的說明進行。按照本發明闡述的方式制備分支骨架，其分支節點的氨基酸選取Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，其攜帶的兩個活性氨基為后續的氨基酸縮合連接反應提供了分支的位點，可完成兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”、四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”或八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相樹脂”、……的合成。再按常規肽鏈延長反應選取胺基被保護起來的氨基酸，進行分支節點后的肽鏈延長從而制備出本發明的兩分支肽類分子(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY、四分支肽類分子{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY或八分支肽類分子{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY。鑒于肽鏈的延長過程已是成熟技術，合成步驟的繁復細節在此不再贅述。實施例2：兩分支肽(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY的合成本發明提供的二拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X多肽化合物(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY的結構與合成線路見式1，其中，XA、XB、XC、XD、XE、XF和XG分別為丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)和谷氨酰胺(Gln，Q)中的任意一種，可相同或不同；其中XC、XF還可選自雜環氨基酸，分別為色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His,H)和脯氨酸(Pro,P)中的任意一種，K為含有兩個活性氨基的賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，X或Y可為空或任意一種氨基酸或由多個氨基酸組成的片段，或具有連接氨基酸功能的化學基團：本實施例采用有機化學Fmoc保護的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：保護基團采用Fmoc保護法將賴氨酸的氨基保護起來；步驟二：合成(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY多肽化合物:本實施例中多肽的合成是在多肽自動合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動合成儀(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護方式載體)上，再通過縮合連接賴氨酸(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)，實際的連接順序為：Lys-Y-WANG固相樹脂,形成具有分支節點的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；由于其末端的賴氨酸具有雙活化的氨基，進而在“>KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端與另外兩個XAXBXCXDXEXFXG-X片段發生反應，就會得到兩分支肽的延伸(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY-WANG固相樹脂，即固定在WANG固相樹脂上的二拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY-WANG固相樹脂。此步驟中，合成時可以按照實施例1先合成好XAXBXCXDXEXFXG-X片段，再與Lys-Y-WANG固相樹脂縮合；或者，在“>KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端依次連接X、XG、XF、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法將目的多肽化合物從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY多肽化合物粗品。步驟三：純化(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY多肽化合物采用色譜柱(型號為DaisoC18，10μm,50×250mm)，色譜操作流動相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測波長220納米。收集流出峰溶液，再經過冷凍干燥。得到呈白色絮狀的(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY多肽化合物，經密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。XA、XB、XC、XD、XE、XF、XG均可通過商業途經采購獲得。在制備本發明的多肽化合物時，也可以用可外購的WANG固相樹脂-Y為原料，按照上述方法在Y的末端縮合氨基酸，得到本發明的多肽化合物。按照本實施例指導的方法合成的系列兩分支肽(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY，其片段的選擇見表2。表2兩分支肽(XAXBXCXDXEXFXG-X)2KY的片段列表實施例XAXBXCXDXEXFXGXY實施例XAXBXCXDXEXFXGXY2-1GQPRRPRRG2-9TKLKKHG空C2-2TEPRKEG空A2-10RRHGRHG空G2-3RRPRKDVYA2-11KEKERHG空空2-4TRPRRHG空G2-12TKDLKEK空G2-5EAKSQGGSN空2-13RLPRRPL空C2-6ATWLRPRRG2-14TKLRRKE空G2-7KLAKLAK空C2-15SRPRRGGE空2-8LKADKAKGA2-16GQPRKEVYG實施例3：四分支肽{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY的合成本發明提供的四拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY的結構與合成線路見式2，各片段的定義同實施例2:本實施例采用有機化學Fmoc保護的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：保護基團采用Fmoc保護法將賴氨酸的氨基保護起來；步驟二：合成{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY多肽化合物:本實施例中多肽的合成是在多肽自動合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動合成儀(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護方式載體)上，再通過縮合連接賴氨酸(賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)，實際的連接順序為：Lys-Y-WANG固相樹脂,形成具有分支節點的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；由于其末端的賴氨酸具有雙活化的氨基，與另外兩個賴氨酸(K，此時其兩個氨基被保護)的羧基發生縮合反應就會得到兩分支骨架的延伸K2KY-WANG固相樹脂，此時在KY的賴氨酸氨基端上連接有兩個具有雙活化氨基的賴氨酸(K)，形成具有分支節點的四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”；在“K2”的每個具有雙活化氨基的賴氨酸(K)上繼續進行與兩個XAXBXCXDXEXFXG-X片段的縮合，就得到了固定在WANG固相樹脂上的四拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY-WANG固相樹脂。此步驟中，合成時可以按實施例1先合成好XAXBXCXDXEXFXG-X片段，再與K2KY-WANG固相樹脂縮合；或者在“>K2KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端依次連接X、XG、XF、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法將目的多肽化合物從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY多肽化合物粗品。步驟三：純化{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY多肽化合物同實施例2。最終得到呈白色絮狀的{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY多肽化合物，經密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。按照本實施例方法合成系列四分支肽{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY，具體基團的選擇見表3。表3四分支肽{(XAXBXCXDXEXFXG-X)2K}2KY的各片段列表實施例XAXBXCXDXEXFXGXY實施例XAXBXCXDXEXFXGXY4-1GQPRRPRRG4-9TKLKKHG空C4-2TEPRKEG空A4-10RRHGRHG空G4-3RRPRKDVYA4-11KEKERHG空空4-4TRPRRHG空G4-12TKDLKEK空G4-5EAKSQGGSN空4-13RLPRRPL空C4-6ATWLRPRRG4-14TKLRRKE空G4-7KLAKLAK空C4-15SRPRRGGE空4-8LKADKAKGA4-16GQPRKEVYG實施例4：八分支肽{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY的合成本發明提供的八拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY的結構與合成線路見式3，各片段的定義同實施例2:本實施例采用有機化學Fmoc保護的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：保護基團采用Fmoc保護法將賴氨酸的氨基保護起來；步驟二：合成{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY多肽化合物:本實施例中多肽的合成是在多肽自動合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動合成儀(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護方式載體)上，再通過縮合連接賴氨酸(Lys,K)，實際的連接順序為：Lys-Y-WANG固相樹脂,形成具有分支節點的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；由于其末端的賴氨酸具有雙活化的氨基，與另外兩個賴氨酸(K，此時其兩個氨基被保護)的羧基發生縮合反應就會得到兩分支骨架的延伸K2KY-WANG固相樹脂，此時在KY的賴氨酸氨基端上連接有兩個具有單活化氨基的賴氨酸(K，此時其兩個氨基被保護)，形成四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”；在“K2”的兩個具有單活化氨基的賴氨酸末端再分別與另外兩個賴氨酸(K，此時其兩個氨基被保護)的羧基發生縮合反應就會得到四分支骨架的延伸K4K2KY-WANG固相樹脂，此時在K2KY的末端賴氨酸氨基端上連接有四個具有雙活化氨基的賴氨酸(K)，形成具有分支節點的八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相樹脂”；在“>K4K2KY-WANG固相樹脂”的“K4”每個具有雙活化氨基的賴氨酸(K)上繼續進行與兩個XAXBXCXDXEXFXG-X片段的縮合，就得到了固定在WANG固相樹脂上的八拷貝XAXBXCXDXEXFXG-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY-WANG固相樹脂。此步驟中，合成時可以先合成好XAXBXCXDXEXFXG-X片段，再與{(K)2K}2KY-WANG固相樹脂縮合；或者在“>K4K2KY-WANG固相樹脂”中K的兩個活性氨基末端依次連接X、XG、XF、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法將目的多肽化合物從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY多肽化合物粗品。步驟三：純化{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY多肽化合物同實施例2。最終得到呈白色絮狀的{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY多肽化合物，經密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。按照本實施例方法合成系列八分支肽{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY，其片段的選擇見表4。表4八分支肽{({XAXBXCXDXEXFXG-X}2K)2K}2KY的各片段列表實施例XAXBXCXDXEXFXGXY實施例XAXBXCXDXEXFXGXY8-1GQPRRPRRG8-9TKLKKHG空C8-2TEPRKEG空A8-10RRHGRHG空G8-3RRPRKDVYA8-11KEKERHG空空8-4TRPRRHG空G8-12TKDLKEK空G8-5EAKSQGGSN空8-13RLPRRPL空C8-6ATWLRPRRG8-14TKLRRKE空G8-7KLAKLAK空C8-15SRPRRGGE空8-8LKADKAKGA8-16GQPRKEVYG由于本發明的多肽化合物是一類具有生物活性的有機分子，它們的氨基酸序列和結構決定了它們的生物學作用。單一氨基酸在蛋白質或肽序列中的改變都有可能導致其生物學活性的改變，下面通過具體實驗例來對本發明提供的多肽化合物的生物活性及其功效進行闡述。實驗例一：本發明多肽化合物在禽類動物(雞)中的免疫效果實驗新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)能夠與雞紅細胞發生凝集現象，這是一種特異性的抗體中和反應，其原理是根據病毒的血凝素可凝集紅細胞，但若先用特異性抗體與病毒作用，然后再加入紅細胞后則不出現紅細胞凝集，稱為血凝抑制試驗(HemagglutinationInhibitiontest,HI),檢測所用的抗血清稀釋的最高倍數即是抗體的滴度。待測抗體的滴度越高，說明免疫的效果越好。HI方法具有以下優點：1.敏感性強，可以檢測到微量的抗體，結果也較為準確，是較敏感的血清學檢測反應之一；2.特異性強，病毒凝集紅細胞只能被特異性的抗體所抑制；3.檢測速度快，1次HI試驗只需2小時左右即可判定結果；4.HI試驗對環境要求不高，操作簡單快捷，一次可檢測大量的樣品。將本發明實施例2-1至實施例2-16、實施例4-1至實施例4-16、實施例8-1至實施例8-16的多肽化合物在雛雞中進行抗體滴度的檢測：給SPF雛雞接種雞新城疫活疫苗(CS2株，成都天邦生物制品有限公司出品)和本發明的多肽化合物，然后檢測多肽化合物在SPF雛雞體內對新城疫活疫苗的HI抗體生成效果，從而得到本發明多肽化合物對新城疫活疫苗(抗原)的免疫效果。實驗方法為：選取7日齡無特定病原(SpecificPathogenFree)雞(簡稱為SPF雛雞)。將SPF雛雞分為8組，每組12只。在SPF雛雞的翅膀腋部皮下按以下組別接種。然后各組同時飼養在隔離器內。接種后第14天翅下靜脈采血約1ml，分離血清進行HI檢測，以實施例2-1、2-3、4-9、4-10、8-14和8-16(依序對應表5中實驗組1-實驗組6)為例，檢測結果見表5(僅列出部分多肽化合物的檢測結果)，其它實施例結果與表5差別不大，不一一贅述。具體操作參見由郭鑫主編，中國農業大學出版社2007年出版的《動物免疫學實驗教程》。空白組：注射0.3ml生理鹽水；對照組：接種0.3ml雞新城疫活疫苗(簡稱“疫苗”，CS2株)；實驗組：接種混合有0.2μg本發明多肽化合物的疫苗0.3ml。表5SPF雛雞免疫實驗結果注：陰性是指HI的抗體滴度為零；實驗期間各組SPF雛雞飲食活動未見異常，未見不良反應，未發生SPF雛雞死亡，表明本發明的多肽化合物使用安全。表5結果表明疫苗中添加了本發明多肽化合物(實驗組1-8)后，HI的抗體滴度均值比空白組和對照組(僅有疫苗)有所提高，說明本發明多肽化合物與疫苗聯用具有良好的免疫增強效果，與對照組相比平均提高HI抗體滴度1以上。實驗例二：本發明多肽化合物在多拷貝基團相同的情況下，不同分支對免疫效果的影響實驗按實驗例一方法對兩組本發明的多肽化合物(組Ⅰ和組Ⅱ)進行免疫效果的實驗，這兩組多肽化合物中同一組的多肽化合物多拷貝基團相同，僅是分支數量不同，這兩組化合物是從實施例中隨機選取的。以實施例2-1、2-14、4-1、4-14、8-1和8-14為例，檢測結果見表6，其它實施例結果與表5差別不大，不一一贅述。實驗分組：空白組：注射0.3ml生理鹽水；對照組：接種0.3ml雞新城疫活疫苗(簡寫“疫苗”，CS2株)；實驗組：接種混合有0.2μg實施例的疫苗0.3ml；實驗期間各組SPF雛雞飲食活動未見異常，未見不良反應，未發生SPF雛雞死亡，表明本發明的多肽化合物使用安全。表6SPF雛雞免疫實驗結果注：陰性是指HI的抗體滴度為零。表6結果表明，隨著多肽片段拷貝數量的增加，也就是分支數量的增多，對雛雞的免疫應答效果有所增強，免疫增強效果得到進一步提升，意味著生物學效果與肽片段拷貝數量呈正相關的作用機制。以上所述僅是本發明的優選實施方式，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下所做出的若干改進和潤飾也應視為本
發明內容。當前第1頁1 2 3