本發明涉及一種靶向抗腫瘤藥物及其合成方法，屬于化學藥物合成技術領域。
背景技術：
目前治療癌癥的手段主要有手術切除，放療和化療。其中化療不僅可以殺死癌細胞，還可以殺死癌細胞周圍的正常細胞，副作用非常大。胞嘧啶核苷類藥物如阿扎胞苷和阿糖胞苷都是比較有效的抑制乳腺腫瘤生長的藥物，但是此類藥物副作用比較強，使用后會引起白細胞減少或肝損害等多種不良反應。有研究表明，含有LTVSPWY序列的多肽具有特異性結合乳腺腫瘤細胞而不與正常細胞相結合的特性(The FASEB Journal,2002,17(2),256)，將胞嘧啶核苷類藥物連接在此類具有乳腺腫瘤靶向的多肽藥物載體上，既可以維持藥物的藥效，又可以使藥物只作用于特定器官的腫瘤細胞而不會對其他細胞造成損傷。
但是，胞嘧啶核苷類藥物以及多肽載體上可用于反應的位點很多，使用常規的化學手段將藥物和載體進行連接勢必會造成大量的副反應發生，導致藥物無法與載體進行特定位點的連接。相比于化學合成而言，酶法合成的條件更加溫和，操作更加簡單，區域選擇性更高，反應中副產物更少，而且很多化學方法難以合成的反應都可以通過一種或多種酶來完成。因此，有必要設計出一種化學/酶法合成路線將胞嘧啶核苷類藥物與靶向多肽載體進行特異性連接。
技術實現要素：
為克服上述現有技術的缺點，本發明提供了一種利用化學手段與多種固定化酶共同作用合成靶向抗腫瘤藥物(結構如式I所示)的方法。該方法條件溫和，合成出的靶向抗腫瘤藥物副產物較少。
為了達到上述目的，本發明按照以下技術方案實現:
(1)向燒瓶中加入Boc-6-氨基己酸，乙酸乙烯酯，乙酸汞以及乙酸銅后，在40-70℃攪拌5-30分鐘，滴加濃硫酸后繼續攪拌24-72小時。之后加入無水乙酸鈉，震蕩靜置后過濾。所得濾液進行硅膠柱(乙酸乙酯/石油醚洗脫)分離得到產物1。
(2)將脂肪酶，產物1和胞嘧啶核苷類藥物加入到溶劑中30-60℃攪拌反應24-120小時。反應結束后，減壓去除有機溶劑。將粗產物進行硅膠柱(乙酸乙酯/甲醇洗脫)分離得到產物2。
(3)將產物2投入到飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液中室溫下攪拌12-36小時。使用離心機(3000-12000rpm)對反應生成的沉淀進行離心，室溫下烘干得到產物3。
(4)將產物3溶解于飽和碳酸氫鈉水溶液中形成溶液A；將靶向肽(序列為LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入緩沖液(pH＝5-9)中形成溶液B。將溶液A與B混合均勻后，加入胰蛋白酶和谷氨酰胺轉氨酶在25-45℃反應6-12小時。反應結束后對溶液通過Welchrom C18柱分離得到靶向抗腫瘤藥物。
進一步，步驟(1)中Boc-6-氨基己酸：乙酸乙烯酯：乙酸汞：無水乙酸鈉：乙酸銅：濃硫酸＝1:5-15:0.005-0.02:0.1-0.3:0.005-0.05:0.005-0.04，質量比。
進一步，步驟(2)中胞嘧啶核苷類藥物為阿扎胞苷或阿糖胞苷。
進一步，步驟(2)中溶劑為吡啶與正己烷的混合溶劑，吡啶:正己烷＝1:0.2-0.5，體積比。
進一步，步驟(2)中脂肪酶：產物3：胞嘧啶核苷類藥物＝1:30-100:5-20，質量比。
進一步，步驟(4)中產物3：靶向肽：胰蛋白酶：谷氨酰胺轉氨酶＝1:1-5:0.5-10:0.5-10，質量比。
進一步，步驟(4)中溶液A：溶液B＝1:0.25-0.5，體積比。
本發明的優點在于:
(1)對阿扎胞苷或阿糖胞苷的羥基進行修飾，可以提高阿扎胞苷或阿糖胞苷的藥效(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006,38,48)。
(2)將阿扎胞苷或阿糖胞苷與含有LTVSPWY序列的靶向多肽進行連接，可以使藥物具有靶向性，作用于乳腺腫瘤細胞的能力增強，對普通細胞的殺傷減弱。
(3)利用酶法對藥物與靶向載體進行連接，反應條件溫和，反應區域選擇性強，反應副產物較少。
附圖說明
圖1：本發明所述的抗腫瘤靶向藥物合成工藝圖。當X為N元素時，為靶向阿扎胞苷藥物合成工藝圖；當X為C元素時，為靶向阿糖胞苷藥物合成工藝圖。
具體實施方式
以下結合實例詳述本發明，但并不構成對本發明的限制。
實施例1:
向250mL圓底燒瓶中加入Boc-6-氨基己酸12g，乙酸乙烯酯100g，乙酸汞0.1g以及0.1g乙酸銅。將此溶液在60℃攪拌6分鐘后，滴加0.25g濃硫酸(質量百分比濃度為98％，以下同，但不局限于此)。反應繼續攪拌24h后，加入2g無水乙酸鈉，震蕩靜置后過濾。所得濾液進行柱層析(乙酸乙酯：石油醚＝1:8)分離。分離組分抽干淋洗劑得到淡黃色液體1。產物1的產率為70％。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):7.29(dd,1H,＝CH-),4.87(d,1H；CH2＝),4.60(d,1H；NH),4.56(d,1H；CH2＝),3.11(d,2H；-CH2-),2.39(t,2H；-CH2-),1.70(dt,2H；-CH2-),1.49(m,2H；-CH2-),1.46(s,9H；-C(CH3)3),1.34(m,2H；-CH2-).
將0.01g脂肪酶，0.5g產物1和0.0976g阿扎胞苷加入到12mL溶劑(吡啶：正己烷＝5:1)中50℃攪拌反應72h。反應結束后真空抽干溶劑后得到粗產物。將粗產物進行柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝10:1)分離。分離組分抽干淋洗劑得到白色固體粉末2。產物2的產率為60％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6,δ):8.31(s,1H；H-6),7.56(d,2H；NH2),6.75(s,1H；-NH-),5.64(d,1H；H-1’),5.47(d,1H；2’-OH),5.20(d,1H；3’OH),4.28(dd,1H；H-2’),4.23-4.15(m,2H；H-4’,H-5’),4.03–3.98(m,2H；H-3’,H-5’),2.88(dd,2H；-CH2-),2.32(t,2H；-CH2-),1.51(dt,2H；-CH2-),1.36(s,9H；-C(CH3)3),1.23(s,4H；-CH2-).
將產物2投入到飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液中室溫下攪拌24小時。使用離心機(8000rpm)對反應生成的沉淀進行離心。使用大量乙酸乙酯對產物進行沖洗以去除未反應的物質。剩余沉淀使用真空干燥箱室溫下烘干得到產物3。產率為85％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,358.2；found,358.3；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,380.2；found,380.3.
將1mg產物3溶解于1mL飽和碳酸氫鈉水溶液中形成溶液A。將4mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到3mL tris-HCl緩沖液(0.1M,pH＝7.0)中形成溶液B。將溶液A與B混合均勻后，投入2mg胰蛋白酶和2mg谷氨酰胺轉氨酶35℃攪拌反應6h。反應結束后對溶液通過Welchrom C18柱分離得到靶向阿扎胞苷藥物。產率18％。MALDI-TOF/MS:calcd for C88H133N25O30,M＝2019.9Da；found,m/z 2020.9[M+H]+.
實施例2：
向200mL圓底燒瓶中加入Boc-6-氨基己酸10g，乙酸乙烯酯120g，乙酸汞0.15g以及0.2g乙酸銅。將此溶液在50℃攪拌15分鐘后，滴加0.2g濃硫酸。反應繼續攪拌48h后，加入2.5g無水乙酸鈉，震蕩靜置后過濾。所得濾液進行柱層析(乙酸乙酯：石油醚＝1:8)分離。分離組分抽干淋洗劑得到淡黃色液體1。產物1的產率為63％。13C NMR(101MHz,CDCl3,δ):170.6(C＝O),156.0(C＝O),141.1(＝CH-),97.5(CH2＝),79.1(-C(CH3)3),40.3(-CH2-),29.7(-CH2-),28.4(-CH2-),26.2(-CH2-),24.2(-C(CH3)3),22.6,(-CH2-)；FTIR(KBr):3370(NH),1725,1714(C＝O),1649(C＝C).
將0.02g脂肪酶，0.7g產物1和0.2g阿扎胞苷加入到15mL溶劑(吡啶：正己烷＝4:1)中45℃攪拌反應68h。反應結束后真空抽干溶劑后得到粗產物。將粗產物進行柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝10:1)分離。分離組分抽干淋洗劑得到白色固體粉末2。產物2的產率為46％。FTIR(KBr):3200-3600(NH,NH2,OH),1703,1693(C＝O).MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C19H31N5O8,458.2；found,458.1；[M+Na]+calcd for C19H31N5O8,480.2；found,480.2.
將產物2投入到飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液中室溫下攪拌18小時。使用離心機(10000rpm)對反應生成的沉淀進行離心。使用大量乙酸乙酯對產物進行沖洗以去除未反應的物質。剩余沉淀使用真空干燥箱室溫下烘干得到產物3。產率為81％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,358.2；found,358.2；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,380.2；found,380.2.
將2mg產物3溶解于2mL飽和碳酸氫鈉水溶液中形成溶液A。將5mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到4mL tris-HCl緩沖液(0.1M,pH＝8.0)中形成溶液B。將溶液A與B混合均勻后，投入3mg胰蛋白酶和5mg谷氨酰胺轉氨酶40℃攪拌反應12h。反應結束后對溶液通過Welchrom C18柱分離得到靶向阿扎胞苷藥物。產率23％。MALDI-TOF/MS:calcd for C88H133N25O30,M＝2019.9Da；found,m/z 2020.7[M+H]+.
實施例3：
向250mL圓底燒瓶中加入Boc-6-氨基己酸15g，乙酸乙烯酯150g，乙酸汞0.2g以及0.3g乙酸銅。將此溶液在55℃攪拌20分鐘后，滴加0.3g濃硫酸。反應繼續攪拌72h后，加入3g無水乙酸鈉，震蕩靜置后過濾。所得濾液進行柱層析(乙酸乙酯：石油醚體積比＝1:8)分離。分離組分抽干淋洗劑得到淡黃色液體1。產物1的產率為71％。
將0.015g脂肪酶，0.6g產物1和0.15g阿糖胞苷加入到13mL溶劑(吡啶：正己烷體積比＝2:1)中55℃攪拌反應100h。反應結束后真空抽干溶劑后得到粗產物。將粗產物進行柱層析(乙酸乙酯：甲醇體積比＝11:1)分離。分離組分抽干淋洗劑得到白色固體粉末2。產物2的產率為66％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.48(d,1H；H-6),7.07(d,2H；NH2),6.75(s,1H；-NH-),6.09(d,1H；H-1’),5.67(d,1H；H-5),5.62–5.48(m,2H；2’-OH,3’-OH),4.24(ddd,2H；H-5’),4.03–3.77(m,3H；H-2’,H-3’,H-4’),2.89(dd,2H；-CH2-),2.33(t,2H；-CH2-),1.65–1.40(m,4H；-CH2-),1.38(s,9H；-C(CH3)3),1.25(m,2H；-CH2-).
將產物2投入到飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液中室溫下攪拌30小時。使用離心機(6000rpm)對反應生成的沉淀進行離心。使用大量乙酸乙酯對產物進行沖洗以去除未反應的物質。剩余沉淀使用真空干燥箱室溫下烘干得到產物3。產率為83％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,357.2；found,357.3；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,379.2；found,379.3.
將1.5mg產物3溶解于1mL飽和碳酸氫鈉水溶液中形成溶液A。將2mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到3.5mL tris-HCl緩沖液(0.01M,pH＝6.0)中形成溶液B。將溶液A與B混合均勻后，投入1.5mg胰蛋白酶和1.8mg谷氨酰胺轉氨酶45℃攪拌反應10h。反應結束后對溶液通過Welchrom C18柱分離得到靶向阿糖胞苷藥物。產率為30％。MALDI-TOF/MS,calcd for C89H133N24O30,M＝2018.9Da；found,m/z 2019.9[M+H]+.
實施例4：
向200mL圓底燒瓶中加入Boc-6-氨基己酸8g，乙酸乙烯酯75g，乙酸汞0.15g以及0.25g乙酸銅。將此溶液在58℃攪拌10分鐘后，滴加0.18g濃硫酸。反應繼續攪拌66h后，加入1.8g無水乙酸鈉，震蕩靜置后過濾。所得濾液進行柱層析(乙酸乙酯：石油醚體積比＝1:8)分離。分離組分抽干淋洗劑得到淡黃色液體1。產物1的產率為69％。
將0.01g脂肪酶，0.45g產物1和0.12g阿糖胞苷加入到12mL溶劑(吡啶：正己烷體積比＝2.5:1)中52℃攪拌反應80h。反應結束后真空抽干溶劑后得到粗產物。將粗產物進行柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝11:1)分離。分離組分抽干淋洗劑得到白色固體粉末2。產物2的產率為63％。FTIR(KBr):3200-3600(NH,NH2,OH),1728,1690(C＝O).MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C20H32N4O8,457.2；found,457.2；[M+Na]+calcd for C20H32N4O8,479.2；found,479.1.
將產物2投入到飽和氯化氫的乙酸乙酯溶液中室溫下攪拌25小時。使用離心機(5000rpm)對反應生成的沉淀進行離心。使用大量乙酸乙酯對產物進行沖洗以去除未反應的物質。剩余沉淀使用真空干燥箱室溫下烘干得到產物3。產率為84％。MS(ES+)m/z:[M+H]+calcd for C14H23N5O6,357.2；found,357.2；[M+Na]+calcd for C14H23N5O6,379.2；found,379.2.
將1.2mg產物3溶解于1.2mL飽和碳酸氫鈉水溶液中形成溶液A。將2.4mg靶向肽(LTVSPWYGTGTQGTGRGTGDDR)加入到3.6mL tris-HCl緩沖液(0.05M,pH＝8.0)中形成溶液B。將溶液A與B混合均勻后，投入1mg胰蛋白酶和1mg谷氨酰胺轉氨酶38℃攪拌反應6h。反應結束后對溶液通過Welchrom C18柱分離得到靶向阿糖胞苷藥物。產率為24％。MALDI-TOF/MS,calcd for C89H133N24O30,M＝2018.9Da；found,m/z 2019.7[M+H]+.
實施例5：
使用CCK-8試劑盒對實施例1制備的靶向阿扎胞苷作用于MCF-7乳腺腫瘤細胞的毒性進行測試。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7細胞懸液，將培養板在培養箱預培養24小時(37℃，5％CO2)。之后向培養板中分別加入10μL 0.0002mol/L的阿扎胞苷與靶向阿扎胞苷。將培養板在培養箱孵育20小時后，向每孔加入10μL CCK溶液，繼續將培養板在培養箱內孵育4小時。最后用酶標儀測定樣品在450nm處的吸光度。經測定，靶向阿扎胞苷組MCF-7細胞的存活率是阿扎胞苷組MCF-7細胞的存活率的68％，說明靶向阿扎胞苷對于腫瘤細胞的殺傷力更強。
實施例6：
使用CCK-8試劑盒對實施例2制備的靶向阿扎胞苷作用于MCF-7乳腺腫瘤細胞的毒性進行測試。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7細胞懸液，將培養板在培養箱預培養20小時(37℃，5％CO2)。之后向培養板中分別加入10μL 0.0002mol/L的阿扎胞苷與靶向阿扎胞苷。將培養板在培養箱孵育24小時后，向每孔加入10μL CCK溶液，繼續將培養板在培養箱內孵育4小時。最后用酶標儀測定樣品在450nm處的吸光度。經測定，靶向阿扎胞苷組MCF-7細胞的存活率是阿扎胞苷組MCF-7細胞的存活率的70％，說明靶向阿扎胞苷對于腫瘤細胞的殺傷力更強。
實施例7：
使用CCK-8試劑盒對實施例3制備的靶向阿糖胞苷作用于MCF-7乳腺腫瘤細胞的毒性進行測試。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7細胞懸液，將培養板在培養箱預培養20小時(37℃，5％CO2)。之后向培養板中分別加入10μL 0.0002mol/L的阿糖胞苷與靶向阿糖胞苷。將培養板在培養箱孵育24小時后，向每孔加入10μL CCK溶液，繼續將培養板在培養箱內孵育4小時。最后用酶標儀測定樣品在450nm處的吸光度。經測定，靶向阿糖胞苷組MCF-7細胞的存活率是阿糖胞苷組MCF-7細胞的存活率的82％，說明靶向阿糖胞苷對于腫瘤細胞的殺傷力更強。
實施例8：
使用CCK-8試劑盒對實施例4制備的靶向阿糖胞苷作用于MCF-7乳腺腫瘤細胞的毒性進行測試。首先，在96孔板中配置100μL的MCF-7細胞懸液，將培養板在培養箱預培養24小時(37℃，5％CO2)。之后向培養板中分別加入10μL 0.0002mol/L的阿糖胞苷與靶向阿糖胞苷。將培養板在培養箱孵育20小時后，向每孔加入10μL CCK溶液，繼續將培養板在培養箱內孵育4小時。最后用酶標儀測定樣品在450nm處的吸光度。經測定，靶向阿糖胞苷組MCF-7細胞的存活率是阿糖胞苷組MCF-7細胞的存活率的85％，說明靶向阿糖胞苷對于腫瘤細胞的殺傷力更強。