一種提高淀粉分支酶活力的方法與流程

本發明涉及一種提高淀粉分支酶活力的方法，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術：

淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme；GBE；EC 2.4.1.18)是一種屬于糖苷水解酶家族13的糖基轉移酶，是合成糖原及支鏈淀粉的關鍵酶。經淀粉分支酶改性的淀粉具有高支化的特點，因此在食品、醫藥等工業中具有廣闊的應用前景。

目前，野生淀粉分支酶的活力普遍較低，耐熱性較差，不利于工業化生產。微生物來源的淀粉分支酶大多數實現了在大腸桿菌中胞內表達，仍需要破壁這一生產步驟，使得其工業生產成本較高。

本發明中所使用的來源于耐熱菌株熱葡糖苷酶地芽胞桿菌(Geobacillus thermoglueosidan)STB02的淀粉分支酶的活力約為384U/mg，進一步提高該酶的環化活力，將更加有利于淀粉分支酶的工業化生產。

技術實現要素：

本發明要解決的第一個技術問題是提供一種活力提高的淀粉分支酶突變體，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示序列的淀粉分支酶的第349位的蛋氨酸(Met)分別突變成蘇氨酸(Thr)或絲氨酸(Ser)，所得單突變體依次命名為M349T，M349S。

編碼所述淀粉分支酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種獲得所述突變體M349T、M349S的方法。根據SEQ ID NO.1所示的基因序列，分別設計并合成定點突變引物，對基因進行定點突變，獲得編碼M349T、M349S突變體的基因，并將其轉化至宿主E.coli BL21(DE3)中進行表達。

所述方法包括以下步驟：

(1)利用快速PCR技術，以含野生淀粉分支酶基因的表達載體pET-20b(+)/gbe為模板進行突變；

(2)突變體的表達與純化

挑取含有突變質粒的表達宿主E.coli BL21(DE3)，進行發酵培養并使用IPTG誘導酶的表達，收集發酵上清液，采用鎳柱親和柱，分離純化得到突變體M349T、M349S的酶制品。

本發明的有益效果：

本發明通過構建突變體M349T和M349S，均實現了淀粉分支酶酶活力的提高，與野生型淀粉分支酶相比，突變體M349T、M349S的活力都提高了60％；經突變體M349T和M349S改性后的支鏈淀粉α-1,6糖苷鍵相對含量分別提高27.9％和22.1％。本發明得到的突變體比野生型淀粉分支酶更適用于高支化淀粉的工業化生產。

附圖說明

圖1馬鈴薯純支鏈淀粉經野生淀粉分支酶及其突變體改性4h后¹HNMR測定譜圖。A：野生型淀粉分支酶，B：突變體M349T，C：突變體M349S。

具體實施方式

實施例1突變體M349T、M349S的制備

(1)定點突變

根據SEQ ID NO.1所示的野生淀粉分支酶基因gbe的序列，分別設計并合成引入M349T、M349S密碼子突變的引物。

利用快速PCR技術，以含野生淀粉分支酶基因的表達載體pET-20b(+)/gbe為模板進行突變，所用引物分別是：

引入Met349Thr突變的引物為：

正向引物：

5’-GGGCATATTGACGATTGCCGAAGATTCGACGGAATGGCCGCTCGTCACTGC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：

5’-CGAATCTTCGGCAATCGTCAATATGCCCGGGTCATGCGCAAATACGGTCT-3’，下劃線為突變堿基；

引入Met349Ser突變的引物為：

正向引物：5’-ACCCGGGCATATTGAGCATTGCCGAAGATTCGACGGAATGGCCGC-3’，下劃線為突變堿基，

反向引物：5’-AATCTTCGGCAATGCTCAATATGCCCGGGTCATGCGCAAATACGG-3’，下劃線為突變堿基。

PCR反應體系均為：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)20μL，dNTPs(各2.5mM)8μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL，加入雙蒸水68μL。

PCR反應擴增條件均為：98℃預變性4min；隨后98℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸5min，進行23個循環，每一個循環退火溫度設置降0.2℃；最后72℃保溫10min。

將PCR產物經DpnI消化2h后，轉入大大腸桿菌(Escherichia coli)JM109感受態細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養基中培養過夜，挑取單菌落于LB液體培養基中培養過夜后提取質粒并進行測序驗證。將含編碼淀粉分支酶突變體的基因的表達載體轉入表達宿主E.coli BL21(DE3)感受態細胞中。上述各培養基中均添加100μg/mL的氨芐青霉素。

(2)突變體的表達與純化

挑取含有突變質粒的表達宿主E.coli BL21(DE3)的單克隆于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，在37℃、200r/min下培養8～12h，以體積比2％的接種量接種到含100μg/mL氨芐青霉素的TB培養基中，開始培養溫度為37℃、搖床轉速為200r/min，當菌體濃度培養至OD₆₀₀至0.6時，加入0.01mM的IPTG后迅速轉至在30℃、200r/min下繼續誘導48h，將發酵液于4℃、10000rpm離心15min以除去菌體，收集上清液。

將發酵上清液采用鎳柱親和層析His Trap HP柱，分別純化得到突變體M349T、M349S的酶制品。

實施例2酶活測定分析

(1)酶活力的測定

用0.9mL的50mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)配制0.25％(w/v)馬鈴薯支鏈淀粉或直鏈淀粉標準溶液，加入0.1mL酶液，在50℃下反應15min。反應結束后沸水浴滅酶10min，并以10000r/min離心2min待顯色用。顯色體系為0.3mL反應上清液與5.0mL顯色液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I₂，pH 7.5)于7mL離心管中混合，顯色15min后在530nm或660nm處測定吸光值。酶活定義：在530nm或660nm處，吸光值每分鐘降低1％所需的酶量為一個酶活單位。

(2)酶活力比較

實驗結果列于表1，結果發現，與野生型淀粉分支酶相比，突變體M349T、M349S的活力都提高了60％。通過晶體結構模擬分析發現突變成蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)后，增強了與其他氨基酸的氫鍵作用，有利于穩定空間結構。

表1

實施例3利用NMR分析改性淀粉的α-1,6糖苷鍵相對含量

以配制的5mg/mL的馬鈴薯純支鏈淀粉溶液作為底物，稱取0.5g馬鈴薯純支鏈淀粉溶解在90mL磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.5)中，定容至100mL，在沸水中糊化30min。分別加入一定量的野生淀粉分支酶、突變體M349T、M349S置于50℃下反應4h，煮沸滅酶后進行冷凍干燥。

改性淀粉的α-1,6糖苷鍵相對含量測定采用核磁共振氫譜(NMR)測定。稱取20mg待測樣品，溶解于0.5mLD₂O中，不得有氣泡。

實驗結果如圖1和表2所示，當以5％馬鈴薯純支鏈淀粉為底物時，相比于野生型淀粉分支酶，突變體M349T、M349S具有更高的活力。經4h酶反應后，與野生型相比，突變體M349T和M349S改性后的支鏈淀粉α-1,6糖苷鍵相對含量分別提高27.9％和22.1％。綜上可以看出，突變體M349T和M349S更適用于高支化淀粉的工業化生產應用。

表2

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。