比活提高的α?淀粉酶JcAmy突變體及其編碼基因和應用的制作方法

本發明涉及基因工程領域，具體涉及比活提高的α-淀粉酶jcamy突變體及其編碼基因和應用。
背景技術：
：α-淀粉酶，系統名稱為1,4-α-d-葡聚糖水解酶，是一種內切水解酶，其主要作用是催化淀粉的1,4-α-d-葡聚糖生成還原性糊精和糖類，在淀粉、清潔劑、飲料和紡織等領域具有重要作用。目前在酒精釀造、淀粉糖等領域中，淀粉質原料加工過程中一般要經過液化和糖化兩個階段。在液化和糖化過程中所使用的酶主要為α-淀粉酶和糖化酶。目前工業上廣泛使用的商品化α-淀粉酶和糖化酶的最適ph值約為6.5和4.5，因此在液化和糖化過程中期間需要加入酸堿來調節ph。在液化和糖化過程中大量加入酸堿不僅使加工工藝復雜化，而且增加了生產成本。如果能夠開發出在酸性條件下穩定的α-淀粉酶，則在液化和糖化過程中不需要額外添加酸堿進行ph調節，不僅可以減少試劑消耗，簡化加工工藝，而且可以降低生產成本，節約糧食。對淀粉加工領域具有重大意義。鹽地咸海鮮芽胞桿菌(jeotgalibacilluscampisalis)α-淀粉酶簡稱jcamy。jcamy是一種耐酸性淀粉酶，其最適ph為5.0，在ph4到8范圍內具有很好的穩定性，使其能夠在酸性液化條件下發揮很好的作用。雖然jcamy具有很好的ph特性，但是其比活低，生產成本高，限制了其工業化應用。因此，提高jcamy的比酶活，降低其生產成本，是jcamy工業化應用急需解決的題。近年來，一系列的微生物源α-淀粉酶實現在大腸桿菌或者酵母中的異源表達。但是由于從自然界篩選得到的野生菌產的α-淀粉酶的活力一般都比較低，不能直接運用于工業化的發酵生產。現有技術一般是通過對野生菌株進行誘變、雜交育種等技術手段來提高菌株的產酶能力，但是誘變雜交等技術的工作量大并且不可控地出現負突變的幾率比較大。本發明通過定點突變技術，提高了鹽地咸海鮮芽胞桿菌α-淀粉酶jcamy的比活力，大大降低了其生產成本，為其進一步工業化應用奠定基礎。技術實現要素：本發明的目的是通過對來源于鹽地咸海鮮芽胞桿菌α-淀粉酶jcamy進行分子改造，使改造后的α-淀粉酶具有更高的比活，降低生產成本，為鹽地咸海鮮芽胞桿菌α-淀粉酶的工業化應用奠定基礎。本發明的目的是提供比活提高的α-淀粉酶jcamy突變體。本發明的的再一目的是提供上述α-淀粉酶jcamy突變體的編碼基因。鹽地咸海鮮芽胞桿菌α-淀粉酶jcamy的核苷酸序列和氨基酸序列如seqidno.1，其氨基酸序列如seqidno.2所示。本發明采用定點飽和突變的方法對seqidno.2所示的α-淀粉酶jcamy的第6位，第53位，第173位，第245位和/或第281位進行分子改造，經過高通量篩選得到提高比活的α-淀粉酶突變體。這些突變體的氨基酸序列如seqidno.3到seqidno.10所示，編碼突變體的核苷酸序列如seqidno.11到seqidno.18所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體，其氨基酸序列為seqidno.2的α-淀粉酶jcamy的第6位，第53位，第173位，第245位和/或第281位中至少一個氨基酸被相應的置換為以下氨基酸之一：α-淀粉酶jcamy的第6位被替換為g6f，g6m，g6p，g6n或g6s；α-淀粉酶jcamy的第53位被替換為n35s或n35a；α-淀粉酶jcamy的的第173位被替換為n173k或n173s；α-淀粉酶jcamy的第245位被替換為q245g，q245p或q245r；α-淀粉酶jcamy的第281位被替換為g281n，g281d，g281s或g281k。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-1，其突變位點為：g6f，n35s，n173k，q245g，g281n，氨基酸序列如seqidno.3所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-2，其突變位點為：g6m，n35s，n173s，q245p，g281d，氨基酸序列如seqidno.4所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-3，其突變位點為：g6p，n35a，n173k，q245r，g281k，氨基酸序列如seqidno.5所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-4，其突變位點為：g6n，n35s，n173k，q245p，g281s，氨基酸序列如seqidno.6所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-5，其突變位點為：g6s，n35a，n173s，q245p，g281k，氨基酸序列如seqidno.7所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-6，其突變位點為：g6p，n35a，n173k，q245g，g281s，氨基酸序列如seqidno.8所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-7，其突變位點為：g6s，n35a，n173k，q245p，g281n，氨基酸序列如seqidno.9所示。根據本發明的具體實施方式的優化改良的α-淀粉酶jcamy突變體jcamy-8，其突變位點為：g6m，n35a，n173k，q245g，g281s，氨基酸序列如seqidno.10所示。本發明通過蛋白理性改造和高通量篩選技術對鹽地咸海鮮芽胞桿菌(jeotgalibacilluscampisalis)a-淀粉酶jcamy進行分子改造。相對于原始α-淀粉酶的比活，突變后α-淀粉酶比活的提高幅度為21％-92％，為鹽地咸海鮮芽胞桿菌α-淀粉酶的工業化應用奠定基礎。附圖說明圖1顯示根據本發明具體實施方式的原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體jcamy1-8的最適ph。圖2顯示根據本發明具體實施方式的原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體jcamy1-8的ph穩定性。具體實施方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實驗材料和試劑：1、菌株與載體：大腸桿菌菌株topl0、畢赤酵母x33、載體ppiczαa，zeocin購自invitrogen公司。2、基因：將已公布的鹽地咸海鮮芽胞桿菌(jeotgalibacilluscampisalis)α-淀粉酶jcamy(sequenceid:wp_052476631.1)，根據畢赤酵母密碼子優化后進行合成基因。3、酶與試劑盒：q5高保真taq酶mix購自neb公司，質粒提取，膠純化，限制性內切酶、試劑盒購自上海生工公司。4、培養基：大腸桿菌培養基為lb，配方：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0。lbz為lb培養基加25ug/mlzeocin。酵母培養基為ypd，配方為：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。酵母篩選培養基為ypdz，配方為ypd+100mg/lzeocin。酵母誘導培養基bmgy，配方為1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.00004％biotin、1％甘油(v/v))和bmmy，除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與bmgy相同。實施例1、鹽地咸海鮮芽胞桿菌(jeotgalibacilluscampisalis)α-淀粉酶jcamy的克隆根據合成的a-淀粉酶jcamy基因的序列設計兩條引物(f：5'-gatcgaattcgctactcctcaaaacggtactatga-3'和r：5'-tagcgcggccgcctactcaccataaatggaaacagaa-3')用于擴增鹽地咸海鮮芽胞桿菌α-淀粉酶基因。將擴增的pcr產物純化回收，連接到表達載體ppiczαa，得到表達載體ppiczαa-jcamy。實施例2、定點突變單突變位點為g6f，g6m，g6p，g6n或g6s；或者n35s，n35a，n173k或n173s；或者q245g，q245p或q245r；或者g281n，g281d，g281s或g281k以上述ppiczαa-jcamy為模板，以相應的引物進行pcr擴增，具體地擴增反應體系如下：q5高保真taq酶mix23ul對應突變體引物1ul對應突變體引物1ulppiczαa-jcamy(20ng)2ul加水至50ul反應程序如下：瓊脂糖電泳檢測pcr擴增結果，純化回收pcr產物。用限制性內切酶dpni將原始質粒分解，將分解完的產物才用熱激法轉入大腸桿菌top10，通過菌液pcr驗證重組轉化子，提取驗證正確的轉化子的質粒進行測序，從而確定相應的突變體。將測序正確的突變體，用saci線性化，轉入畢赤酵母x33。通過篩選得到一系列提高比活的單位點突變體，這些突變體的相對比活如表1所示。表1原始α-淀粉酶和單點突變體α-淀粉酶相對比活編號相對比活(％)原始α-淀粉酶100g6f115g6m121g6p130g6n119g6s116n35s135n35a141n173k126n173s136q245g123q245p128q245r121g281n142g281d136g281s115g281k127實施例3、高通量篩選高比活突變菌株將實施例2中的酵母重組轉化子用牙簽逐個挑至24孔板，每個孔中加入1ml含有bmgy培養基，30℃，220rpm培養24h左右，離心去上清。再分別加入1.6mlbmmy培養基進行誘導培養。培養24h后，離心取上清，將上述上清液分別取出200μl至96孔板，進行α-淀粉酶酶活測定。α-淀粉酶酶活檢測參照中華人民共和國國家標準《gb/t24401-2009》進行測定。實施例4、組合突變第6位：g6f，g6m，g6p，g6n，g6s；第53位：n35s，n35a；第173位：n173k，n173s；第245位：q245g，q245p，q245r；第281位：g281n，g281d，g281s，g281k。將實施例2中酶比活提高的單突變位點g6f，g6m，g6p，g6n，g6s，n35s，n35a，n173k，n173s，q245g，q245p，q245r，g281n，g281d，g281s，g281k分別進行組合，實驗過程同實施例2相同。通過實驗最終得到8個組合突變分別命名為jcamy-1、jcamy-2、jcamy-3、jcamy-4、jcamy-5、jcamy-6、jcamy-7、jcamy-8其中jcamy-1包含的突變位點為：g6f，n35s，n173k，q245g，g281n。其中jcamy-2包含的突變位點為：g6m，n35s，n173s，q245p，g281d。其中jcamy-3包含的突變位點為：g6p，n35a，n173k，q245r，g281k。其中jcamy-4包含的突變位點為：g6n，n35s，n173k，q245p，g281s。其中jcamy-5包含的突變位點為：g6s，n35a，n173s，q245p，g281k。其中jcamy-6包含的突變位點為：g6p，n35a，n173k，q245g，g281s。其中jcamy-7包含的突變位點為：g6s，n35a，n173k，q245p，g281n。其中jcamy-8包含的突變位點為：g6m，n35a，n173k，q245g，g281s。實施例5、原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體的比活分析分別將原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶進行純化，純化方法為鎳柱純化。將純化好的α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶分別測定相應的酶活并計算出比活。以突變體比活除以原始α-淀粉酶比活，來計算突變體比活的提高幅度。相比原始jcamy，突變后的jcamy比活提高幅度為21％-92％(具體結果見表2)。表2原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶相對比活編號相對比活(％)原始α-淀粉酶100jcamy-1135jcamy-2159jcamy-3142jcamy-4121jcamy-5130jcamy-6150jcamy-7192jcamy-8160實施例6、原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體jcamy1-8的最適ph及ph穩定性參照國標方法測定原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體jcamy1-8的最適ph。原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體jcamy1-8的最適ph如圖1所示。由圖1可知，突變體jcamy1-8的最適ph并沒有發生太大變化，幾乎和原始α-淀粉酶一樣。將原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體jcamy1-8分別在ph4-8條件下室溫處理3小時，然后參照國標的方法測定酶活。原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體jcamy1-8的ph穩定性如圖2所示。由圖2可知，突變體jcamy1、jcamy3和jcamy7在ph4條件下的穩定性要好于原始α-淀粉酶，而突變體jcamy2、jcamy4、jcamy5、、jcamy6、jcamy8的ph穩定性與原始α-淀粉酶一致。<110>廣東溢多利生物科技股份有限公司<120>比活提高的α-淀粉酶jcamy突變體及其編碼基因和應用<160>18<210>1<211>1458<212>dna<213>鹽地咸海鮮芽胞桿菌<400>1gctactcctcaaaacggtactatgatgcaatactttgaatggtacttgccaaacgatggt60ttgcattggaaccgtttgaccaacgacgcctccaaccttaagaacttgggtgtcactacc120gtttggatccctcctgcctacaagggtacttcccaaaacgacgtcggatacggagcctac180gacttgtacgaccttggtgagttcaaccaaaagggtaccgtccgtaccaagtacggtact240agaggtcagttgcagaccgctatcaacacccttaagaaccagggtatcggtacttacgga300gacgtcgtcatgaaccataagggaggtgctgactttaccgagtccgtccaagctgtcgaa360gtcaacccaaacaacagatctcaagaaacttccggtgaatacaccatttccgcttggacc420ggattcaacttcgccggtcgtaacaacttgcactccgccttcaagtggagatggtaccac480ttcgacggtactgactgggaccagtccagatccttgaacagaatttacaagttcagagga540tctggtaagtcctgggacaccgaagtttccaacgagttcggtaactacgactatcttatg600tatgccgacgttgacttcgatcacccagaggtcaaggccgagttgaagaactggggtaag660tggtatgttcaatctttgaaccttgatggttttagattggatgccgttaaacatatcaag720cacgattacatccaagagtggttggccgacgtcagacgtactactggtaaagagttgttc780accgttgccgaatactggcagaacgacttgggtgccattaacaattacttggctaagacc840ggatattctcactccgtcttcgacgtcccacttcactacaacttccagcgtgctgccaac900tccggaggtaatttcgatatgagaactattttcaacggatccgttgtccagcaacaccca960actttggccgtcaccatcgtcgacaaccatgactcccagccaggtcaatccttggagtcc1020accgttgacgcttggttcaaaccacttgcctacgctatgatcatgaccagagagcagggt1080taccctaacttgttctacggtgacttttacggaaccaagggttcctctaatagagagatc1140ccaaatttgtcttctaaattgactcctattttgaaggccagaaaagacatggcctacggt1200acccagcatgactaccttaatcaccaagacgttatcggttggaccagagagggtgttact1260gaccgttccaagtccggtttggccactatcttgtctgacggaccaggaggaaacaagtgg1320atgtatgtcggtaagagaaacgccggagagacctggagagacaagaccggtaactcttcc1380aacgccgttaccatcaactctgacggttggggacagttttttgtcaatggtggttctgtt1440tccatttatggtgagtag1458<210>2<211>460<212>prt<213>鹽地咸海鮮芽胞桿菌<400>2atpqngtmmqyfewylpndglhwnrltndasnlknlgvttvwippaykgtsqndvgygay60dlydlgefnqkgtvrtkygtrgqlqtaintlknqgigtygdvvmnhkggadftesvqave120vnpnnrsqetsgeytisawtgfnfagrnnlhsafkwrwyhfdgtdwdqsrslnriykfrg180sgkswdtevsnefgnydylmyadvdfdhpevkaelknwgkwyvqslnldgfrldavkhik240hdyiqewladvrrttgkelftvaeywqndlgainnylaktgyshsvfdvplhynfqraan300sggnfdmrtifngsvvqqhptlavtivdnhdsqpgqslestvdawfkplayamimtreqg360ypnlfygdfygtkgssnreipnlsskltpilkarkdmaygtqhdylnhqdvigwtregvt420drsksglatilsdgpggnkwmyvgkrnagetwrdktgnss460<210>3<211>485<212>prt<213>人工序列<400>3atpqnftmmqyfewylpndglhwnrltndasnlkslgvttvwippaykgtsqndvgygay60dlydlgefnqkgtvrtkygtrgqlqtaintlknqgigtygdvvmnhkggadftesvqave120vnpnnrsqetsgeytisawtgfnfagrnnlhsafkwrwyhfdgtdwdqsrslkriykfrg180sgkswdtevsnefgnydylmyadvdfdhpevkaelknwgkwyvqslnldgfrldavkhik240hdyigewladvrrttgkelftvaeywqndlgainnylaktnyshsvfdvplhynfqraan300sggnfdmrtifngsvvqqhptlavtivdnhdsqpgqslestvdawfkplayamimtreqg360ypnlfygdfygtkgssnreipnlsskltpilkarkdmaygtqhdylnhqdvigwtregvt420drsksglatilsdgpggnkwmyvgkrnagetwrdktgnssnavtinsdgwgqffvnggsv480siyge485<210>4<211>485<212>prt<213>人工序列<400>4atpqnmtmmqyfewylpndglhwnrltndasnlkslgvttvwippaykgtsqndvgygay60dlydlgefnqkgtvrtkygtrgqlqtaintlknqgigtygdvvmnhkggadftesvqave120vnpnnrsqetsgeytisawtgfnfagrnnlhsafkwrwyhfdgtdwdqsrslsriykfrg180sgkswdtevsnefgnydylmyadvdfdhpevkaelknwgkwyvqslnldgfrldavkhik240hdyipewladvrrttgkelftvaeywqndlgainnylaktdyshsvfdvplhynfqraan300sggnfdmrtifngsvvqqhptlavtivdnhdsqpgqslestvdawfkplayamimtreqg360ypnlfygdfygtkgssnreipnlsskltpilkarkdmaygtqhdylnhqdvigwtregvt420drsksglatilsdgpggnkwmyvgkrnagetwrdktgnssnavtinsdgwgqffvnggsv480siyge485<210>5<211>485<212>prt<213>人工序列<400>5atpqnptmmqyfewylpndglhwnrltndasnlkalgvttvwippaykgtsqndvgygay60dlydlgefnqkgtvrtkygtrgqlqtaintlknqgigtygdvvmnhkggadftesvqave120vnpnnrsqetsgeytisawtgfnfagrnnlhsafkwrwyhfdgtdwdqsrslkriykfrg180sgkswdtevsnefgnydylmyadvdfdhpevkaelknwgkwyvqslnldgfrldavkhik240hdyirewladvrrttgkelftvaeywqndlgainnylaktkyshsvfdvplhynfqraan300sggnfdmrtifngsvvqqhptlavtivdnhdsqpgqslestvdawfkplayamimtreqg360ypnlfygdfygtkgssnreipnlsskltpilkarkdmaygtqhdylnhqdvigwtregvt420drsksglatilsdgpggnkwmyvgkrnagetwrdktgnssnavtinsdgwgqffvnggsv480siyge485<210>6<211>485<212>prt<213>人工序列<400>6atpqnntmmqyfewylpndglhwnrltndasnlkslgvttvwippaykgtsqndvgygay60dlydlgefnqkgtvrtkygtrgqlqtaintlknqgigtygdvvmnhkggadftesvqave120vnpnnrsqetsgeytisawtgfnfagrnnlhsafkwrwyhfdgtdwdqsrslkriykfrg180sgkswdtevsnefgnydylmyadvdfdhpevkaelknwgkwyvqslnldgfrldavkhik240hdyipewladvrrttgkelftvaeywqndlgainnylaktsyshsvfdvplhynfqraan300sggnfdmrtifngsvvqqhptlavtivdnhdsqpgqslestvdawfkplayamimtreqg360ypnlfygdfygtkgssnreipnlsskltpilkarkdmaygtqhdylnhqdvigwtregvt420drsksglatilsdgpggnkwmyvgkrnagetwrdktgnssnavtinsdgwgqffvnggsv480siyge485<210>7<211>485<212>prt<213>人工序列<400>7atpqnstmmqyfewylpndglhwnrltndasnlkalgvttvwippaykgtsqndvgygay60dlydlgefnqkgtvrtkygtrgqlqtaintlknqgigtygdvvmnhkggadftesvqave120vnpnnrsqetsgeytisawtgfnfagrnnlhsafkwrwyhfdgtdwdqsrslsriykfrg180sgkswdtevsnefgnydylmyadvdfdhpevkaelknwgkwyvqslnldgfrldavkhik240hdyipewladvrrttgkelftvaeywqndlgainny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