堿性木聚糖酶活力測定的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于木聚糖酶活力測定領域，具體涉及一種堿性木聚糖酶活力測定的方 法。
【背景技術】
[0002] 木聚糖酶是可將木聚糖降解為單糖和寡糖的水解酶。一直以來，其在造紙、食品、 飼料、能源等工業都有著較為重大的應用價值，因而引起科研工作者的廣泛關注，并對其進 行了相關研宄。酶活力是衡量酶生物活力的重要指標。對于木聚糖酶活力的測定，已有既 定的國家標準GB 23874-2009飼料添加劑木聚糖酶活力的測定，然而該標準是在37°C、pH 為5. 50的條件下來進行測定。而對于很多工業而言，堿性的環境使得木聚糖酶的使用并非 十分便利。隨著對木聚糖酶的研宄和發展，新型的堿性木聚糖酶正在相關行業中嶄露頭角。 由于傳統的木聚糖酶活力測定方法是酸性方法，對于堿性木聚糖酶而言，酸性木聚糖酶的 檢測條件和方法已經有所不足。酸性條件下的堿性木聚糖酶活力不是最佳，并且會對堿性 木聚糖酶活力造成降低，從而對堿性木聚糖酶的活力表示偏差很大。傳統的測定方法已經 無法再客觀地反應堿性木聚糖酶的活力，新的方法亟待出現。
【發明內容】
[0003] 本發明針對已有的技術的不足，提供一種堿性木聚糖酶活力測定的方法，該方法 能夠更為客觀地反應堿性木聚糖酶的活力。
[0004] 為實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案：
[0005] 堿性木聚糖酶活力測定的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)依據堿性木聚糖酶的特性，配制pH = 7. 8的磷酸二氫鈉 -磷酸氫二鈉緩沖液， 并在此基礎上配制木糖標準溶液、木聚糖標準溶液及待測堿性木聚糖酶樣品；
[0007] (2)制作木糖吸光度-木糖濃度的標準曲線，其斜率為K，截距為Cci;
[0008] (3)在pH = 7. 8的堿性環境下，用步驟⑴中待測堿性木聚糖酶樣品水解木聚糖 為木糖，記錄酶解反應時間t，并用紫外分光光度法檢測水解得到的木糖的吸光度A e;同時 設置不加堿性木聚糖酶的空白對照組，并測其吸光度Ab;
[0009] (4)根據以下公式計算出堿性木聚糖酶活力XD:
[0011] 式中：
【主權項】
1. 堿性木聚糖酶活力測定的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 依據堿性木聚糖酶的特性，配制pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液，并在 此基礎上配制木糖標準溶液、木聚糖標準溶液及待測堿性木聚糖酶樣品； (2) 制作木糖吸光度-木糖濃度的標準曲線，其斜率為K，截距為 (3) 在pH= 7. 8的堿性環境下，用步驟（1)中待測堿性木聚糖酶樣品水解木聚糖為木 糖，記錄酶解反應時間t，并用紫外分光光度法檢測水解得到的木糖的吸光度AE;同時設置 不加堿性木聚糖酶的空白對照組，并測其吸光度Ab; (4) 根據以下公式計算出堿性木聚糖酶活力XD:
式中： XD--稀釋酶液中木聚糖酶的活力，U?ml/1; Ae一一酶反應液的吸光度； Ab一一酶空白樣的吸光度； K--標準曲線的斜率； C〇--標準曲線的截距； M--木糖的摩爾質量，M(C5H1Q05) = 150. 2g?mol-1; t--酶解反應時間，min; 1000--轉化因子，lmmol=1000 y mol〇
2. 根據權利要求1所述的堿性木聚糖酶活力測定的方法，其特征在于，步驟（1)所述 pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液的配制過程如下：取磷酸氫二鈉35. 90g，加水 溶解，并稀釋至500mL，得到甲液；取磷酸二氫鈉2. 76g，加水溶解，并稀釋至100mL，得到乙 液；取91. 5mL甲液與8. 5mL乙液混合，搖勻，即得所述pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二 鈉緩沖液； 步驟（1)所述木糖標準溶液的配制過程如下：稱取無水木糖1. 〇〇〇g，加pH= 7. 8的磷 酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液溶解，定容至l〇〇mL，即得所述木糖標準溶液； 步驟（1)所述木聚糖標準溶液的配制過程如下：在50°C下，稱取木聚糖1. 0000g，加 入0. 32g氫氧化鈉，再加入90mL水，磁力攪拌，同時加熱，直至木聚糖完全溶解；然后停止 加熱，繼續攪拌30min，加入1. 18g磷酸氫二鈉；繼續磁力攪拌，同時測定其pH;如果pH為 7. 80,用pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液定容至100mL，如果pH偏離7. 80， 再用甲液或乙液調節至7. 80,然后再用pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液定容 至100mL，得到所述木聚糖標準溶液； 步驟（1)所述堿性木聚糖酶樣品的反應用酶液配制過程如下： 堿性木聚糖酶樣品為固體樣品的反應用酶液制備過程為：稱樣量稱取試樣兩份，精確 至0? 001g，加入40mLpH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液，磁力攪拌30min，再用 pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液定容至100mL，在4。。條件下避光保存lh~ 2h，上離心機1000g離心3min~5min，取上清液，再用pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉 緩沖溶液做適當稀釋，稀釋后的待測酶液中木聚糖酶活力控制在〇. 04U ~0. 10U?mL-1 之間； 堿性木聚糖酶樣品為液體樣品的反應用酶液制備過程為：液體樣品直接用pH= 7. 8的 磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液進行稀釋、定容，稀釋后的酶液中木聚糖酶活力控制在 0. 04U?ml/1~0. 10U?mL之間；如果稀釋后酶液的pH偏離7. 80,需要用甲液或乙液調節 校正至7. 80,然后再用pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液做適當稀釋定容。
3. 根據權利要求1所述的堿性木聚糖酶活力測定的方法，其特征在于，步驟（2)所述制 作木糖吸光度-木糖濃度標準曲線時，吸取步驟（1)配制的pH= 7. 8的磷酸二氫鈉-磷酸 氫二鈉緩沖溶液4.OOmL，加入DNS試劑5.OOmL，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫，用水定容至 25.OOmL，制成標準空白樣。
4. 根據權利要求1所述的堿性木聚糖酶活力測定的方法，其特征在于，步驟（3)測定酶 活力的過程中，整個液體環境保持在50°C、pH= 7. 80條件下。
【專利摘要】本發明公開了一種堿性木聚糖酶活力測定的方法，屬于木聚糖酶活力測定領域。所述方法包括以下步驟：配制pH＝7.8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液，并在此基礎上配制木糖標準溶液、木聚糖標準溶液及堿性木聚糖酶樣品；制作木糖吸光度-木糖濃度的標準曲線；在pH＝7.8的堿性環境下，用待測堿性木聚糖酶水解木聚糖，并檢測水解得到的木糖的吸光度AE；同時設置不加堿性木聚糖酶的空白對照組，并測其吸光度AB；將所測水解得到的木糖的吸光度值用標準曲線對應獲得所述水解產物木糖的含量；根據公式計算出堿性木聚糖酶活力。本發明針對堿性木聚糖酶活力測定方法進行了改進，解決了現有檢測方法不能客觀地反應堿性木聚糖酶的活力的問題。
【IPC分類】G01N21-31, G01N1-28
【公開號】CN104807764
【申請號】CN201510191712
【發明人】馬千里, 楊仁黨, 楊飛, 阮蒙
【申請人】華南理工大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月21日