本發明屬于流腦A群莢膜多糖制備領域，具體地，涉及一種提高流腦A群莢膜多糖產率的制備方法。
背景技術：
：腦膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）簡稱為腦膜炎球菌（meningococcus），是流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）的病原菌。一百多年來，流腦一直在世界各地流行或散在發生，是人類的主要急性呼吸道傳染病之一。很多國家經過長期的流行病學監測，發現此病具有周期性流行的特點。意大利發現1915-1934年在其國內發生了三次流行。我國也出現過五次全國性大流行，在1938、1949、1959、1967及1977年，約每8-10年出現一次流行高峰。據WHO報告，近十余年來發病率平均為2.5/10萬。當今世界各大洲發病率在1/10萬-10/10萬，國內1967年的大流行，全國發病率及病死率均較高。發病數占傳染數的第四位，而死亡數占全部傳染病死亡數的60%，嚴重危害人民健康及影響計劃生育。其主要的特點為：易感人群主要是為兒童，以爆發型病死率最高，可達40%-60%。流腦的預防，主要采取以疫苗接種為主的預防措施。1980年，我國正式生產A群NM多糖疫苗，推廣應用取得了很好的效果。但多糖疫苗對2歲以下的嬰幼兒預防效果較差，結合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無效的問題。結合疫苗比以往的疫苗具有更強的免疫原性和更好的免疫效果。制備流腦A群結合疫苗首先要獲得流腦A群莢膜多糖，目前傳統的生產方式生產流腦A群莢膜多糖的產率較低，提高了疫苗生產過程中的成本，這也是使流腦A群疫苗價格較高的其中一個原因。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種提高流腦A群莢膜多糖產率的制備方法。本發明解決上述問題所采用的技術方案是：一種提高流腦A群莢膜多糖產率的制備方法，包括以下步驟：1）開啟菌種及傳代：開啟流腦A群菌種傳代至氯化血紅素流腦半綜合培養基上，放入二氧化碳細胞培養箱中，36.5℃，8%CO2培養，二代采用半綜合固體培養基培養，三代采用流腦半綜合液體培養基在恒溫振蕩搖床中培養；2）接種到種子罐培養：將上述步驟1）培養得到的流腦A群種子接種到種子罐，恒溫攪拌通氣培養，培養至第五代；3）發酵罐發酵：將上述步驟2）培養得到的流腦A群五代種子接種入發酵罐后，恒溫36℃，深層通氣200rpm攪拌培養，中途補加葡萄糖溶液為流腦A群細菌生產莢膜多糖提供原料，培養流腦A群細菌至對數生長期后期或靜止期前期，此時菌濃度達到100-200億/mL，甲醛殺菌后去除菌體，收集發酵液上清液；4）純化：加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和十六烷基三甲基溴化銨解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%（v/v），2-8℃靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75-80%（v/v），充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次。綜上，本發明的有益效果是：本申請通過對流腦A群莢膜多糖的制備工藝進行優化，提高流腦A群莢膜多糖的產率，降低疫苗生產過程中的成本。具體實施方式下面結合實施例，對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。實施例1一種提高流腦A群莢膜多糖產率的制備方法，包括以下步驟：1）開啟菌種及傳代：開啟流腦A群菌種傳代至氯化血紅素流腦半綜合培養基上，放入二氧化碳細胞培養箱中，36.5℃，8%CO2培養，二代采用半綜合固體培養基培養，三代采用流腦半綜合液體培養基在恒溫振蕩搖床中培養；2）接種到種子罐培養：將上述步驟1）培養得到的流腦A群種子接種到種子罐，恒溫攪拌通氣培養，培養至第五代；3）發酵罐發酵：將上述步驟2）培養得到的流腦A群五代種子接種入發酵罐后，恒溫36℃，深層通氣200rpm攪拌培養，中途補加葡萄糖溶液為流腦A群細菌生產莢膜多糖提供原料，培養流腦A群細菌至對數生長期后期或靜止期前期，此時菌濃度達到100-200億/mL，甲醛殺菌后去除菌體，收集發酵液上清液；4）純化：加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和十六烷基三甲基溴化銨解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%（v/v），2-8℃靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75-80%（v/v），充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，檢測并將結果記錄于下表1中。表1批次復合多糖產量g/L多糖產量g/L固總mg/mL實施例16.120.45.755從上表1中可以看出，本申請通過對流腦A群莢膜多糖的制備工藝進行優化，提高流腦A群莢膜多糖的產率，降低疫苗生產過程中的成本。如上所述，可較好的實現本發明。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，依據本發明的技術實質，在本發明的精神和原則之內，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進等，均仍屬于本發明技術方案的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3