本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種與植物碳酸鹽脅迫耐性相關蛋白GsHA16及其編碼基因與應用。
背景技術：
：土壤鹽堿化加劇是全世界面臨的重大問題，并且嚴重制約植物正常生長發育。世界上有23％的耕地面積是堿性土壤，以及37％的耕地面積是鹽性土壤。僅中國東北地區，堿化的牧場就已高達70％，并逐年增加。土壤中鹽成分的關鍵物質是中性鹽(NaCl和Na2SO4)和堿性鹽(NaHCO3和Na2CO3)，并且堿性鹽除了中性鹽所造成的傷害外還包含碳酸根及碳酸氫根產生的pH傷害，對植物造成的傷害更大。因此，如何提高植物耐堿性、合理開發利用鹽堿地資源，挖掘逆境農業生態區生產潛力，是我國農業持續高效發展、保證我國糧食安全亟待解決的重大問題之一。現代科學技術的迅猛發展，尤其是生物信息學、功能基因組學和分子生物學技術的飛速發展，為挖掘耐鹽堿關鍵基因、分子育種以及合理開發利用鹽堿地奠定了扎實的理論基礎。植物質膜H+-ATPase是一類廣泛存在于植物質膜及內膜系統的質子泵，主要功能是分解并利用細胞內ATP的分解釋放出的能量將質子運出細胞，產生并維持細胞膜內外兩側H+的電化學梯度，為次級轉運體和通道蛋白對營養物質及離子的跨膜轉運提供能量。此外，質膜H+-ATPase還參與細胞內pH平衡、細胞伸長、氣孔開閉以及植物響應外界脅迫等多種生理過程的調節。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何調控植物抗逆性。為解決上述技術問題，本發明首先提供了與植物抗逆性相關蛋白，本發明所提供的與植物抗逆性相關蛋白的名稱為GsHA16，為如下a)或b)或c)的蛋白質：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質；b)在序列2所示的蛋白質的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質；c)將序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。其中，序列2由951個氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1、標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。為了解決上述技術問題，本發明還提供了與GsHA16蛋白相關的生物材料。本發明提供的與GsHA16蛋白相關的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：A1)編碼GsHA16蛋白的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。上述相關生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權利要求1所述的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1所述的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列1由2856個核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼GsHA16蛋白的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有編碼GsHA16蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GsHA16蛋白且具有相同功能，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GsHA16蛋白的核酸分子的表達盒(GsHA16基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達GsHA16蛋白的DNA，該DNA不但可包括啟動GsHA16轉錄的啟動子，還可包括終止GsHA16轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用于本發明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子；組織、器官和發育特異的啟動子及誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S：來自西紅柿的創傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；來自煙草的化學誘導型啟動子，發病機理相關1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導)；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導)；熱休克啟動子(美國專利5，187，267)；四環素誘導型啟動子(美國專利5，057,422)；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉錄終止子包括但不限于：農桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。可用現有的表達載體構建含有所述GsHA16基因表達盒的重組載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標記基因(如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptII基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學試劑標記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。上述生物材料中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農桿菌。上述生物材料中，所述轉基因植物細胞系、轉基因植物組織和轉基因植物器官均不包括繁殖材料。為了解決上述技術問題，本發明還提供了GsHA16蛋白或上述相關生物材料的新用途。本發明提供了GsHA16蛋白或上述相關生物材料在調控植物抗逆性中的應用。本發明還提供了GsHA16蛋白或上述相關生物材料在培育抗逆性提高的轉基因植物中的應用。上述應用中，所述抗逆性為抗碳酸鹽脅迫，所述抗碳酸鹽脅迫具體為抗NaHCO3脅迫，體現為在NaHCO3脅迫的條件下：轉基因植物的根長高于受體植物。為了解決上述技術問題，本發明最后提供了一種培育抗逆性提高的轉基因植物的方法。本發明提供的培育抗逆性提高的轉基因植物的方法包括在受體植物中過表達GsHA16蛋白，得到轉基因植物的步驟；所述轉基因植物的抗逆性高于所述受體植物。上述方法中，所述過表達的方法為將GsHA16蛋白的編碼基因導入受體植物。上述方法中，所述GsHA16蛋白的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本發明的實施例中，所述GsHA16蛋白的編碼基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通過重組載體pCAMBIA330035Su-GsHA16導入所述受體植物中，所述重組載體pCAMBIA330035Su-GsHA16為在pCAMBIA330035Su載體中插入如序列表中序列1所示的GsHA16基因。GsHA16基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。上述方法中，所述抗逆性為抗碳酸鹽脅迫，所述抗碳酸鹽脅迫具體為抗NaHCO3脅迫，體現為在NaHCO3脅迫的條件下：轉基因植物的根長高于受體植物。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜蓿或水黃皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬南芥可為擬南芥(哥倫比亞生態型col-0)。上述方法中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述GsHA16基因轉化目的植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。擴增編碼上述GsHA16蛋白的核酸分子全長或其片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。本發明發現了一種與植物碳酸鹽脅迫耐性相關蛋白GsHA16。本發明的實驗證明，將GsHA16基因超表達于擬南芥中，可增強擬南芥對碳酸鹽脅迫的耐性，說明該蛋白可以為培育具有碳酸鹽脅迫耐性的轉基因植物的研究奠定基礎。附圖說明圖1為GsHA16蛋白在植物細胞內的亞細胞定位分析。圖2為GsHA16基因在碳酸鹽脅迫下的表達模式分析。圖3為GsHA16轉基因擬南芥PCR鑒定。圖4為GsHA16轉基因擬南芥RT-PCR鑒定。圖5為轉GsHA16擬南芥的耐碳酸鹽脅迫分析。其中，圖5A為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的幼苗期表型；圖5B為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的根長，其中，縱坐標代表根長，橫坐標代表NaHCO3濃度；圖5C為150mM的NaHCO3脅迫處理后的T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的成苗期表型。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的野生大豆G07256種子在文獻“MingzheSun,XiaoliSun,YangZhao,HuaCai,ChaoyueZhao,WeiJi,HuiziDuanMu,YangYu,YanmingZhu.EctopicexpressionofGsPPCK3andSCMRPinMedicagosativaenhancesplantalkalinestresstoleranceandmethioninecontent.PLOSONE2014,9(2):e89578”中公開過，公眾可以從黑龍江八一農墾大學或東北農業大學獲得。下述實施例中的pBSK-eGFP載體在文獻“XiaoliSun,WeiJi,XiaodongDing,XiBai,HuaCai,ShanshanYang,XueQian,MingzheSun,YanmingZhu.GsVAMP72,anovelGlycinesojaR-SNAREprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandABAsensitivity.PlantCellTissOrganCult2013,113:199–215”中公開過，公眾可以從黑龍江八一農墾大學或東北農業大學獲得。下述實施例中的pCAMBIA330035Su載體在文獻“XiaoliSun,WeiJi,XiaodongDing,XiBai,HuaCai,ShanshanYang,XueQian,MingzheSun,YanmingZhu.GsVAMP72,anovelGlycinesojaR-SNAREprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandABAsensitivity.PlantCellTissOrganCult2013,113:199–215”中公開過，公眾可以從黑龍江八一農墾大學或東北農業大學獲得。下述實施例中的根癌農桿菌GV3101在文獻“LeeCW,etal.AgrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinArabidopsisthaliana,PlantCell,2009,21(9),2948-62”中公開過，公眾可以從黑龍江八一農墾大學或東北農業大學獲得。下述實施例中的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型col-0)在文獻“LuoX,SunX,LiuB,etal.EctopicexpressionofaWRKYhomologfromGlycinesojaaltersfloweringtimeinArabidopsis[J].PloSone,2013,8(8):e73295.”中公開過，公眾可以從黑龍江八一農墾大學或東北農業大學獲得。實施例1、野生大豆中耐碳酸鹽相關基因GsHA16的獲得一、GsHA16基因的獲得1、總RNA的提取選取飽滿的野生大豆G07256種子，用濃H2SO4處理10min，無菌水沖洗3～4次，25℃暗培養2-3d催芽。待芽長到1～2cm時，將其轉移至1/4Hogland營養液中，置于人工氣候箱中培養。取3周齡野生大豆G07256幼苗的根，采用RNApreppure試劑盒(TIANGEN)提取總RNA。2、cDNA的獲得以OligodT為引物進行cDNA第一條鏈的合成，方法參見Invitrogen公司SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase說明書，得到野生大豆總cDNA。3、PCR擴增以野生大豆總cDNA為模板，采用引物GsHA16-FL-F和GsHA16-FL-R進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。引物序列如下：GsHA16-FL-F：5'-ATGGGTGGCATCAGCCTCGA-3'；GsHA16-FL-R：5'-TTAAACTGTATAGTGCTGCTGAATCGTGT-3'。4、GsHA16基因的克隆載體構建及測序將PCR擴增產物與pEASY-T載體連接，構建pEASY-GsHA16克隆載體。并對其進行測序。測序結果表明：PCR擴增得到的大小為2856bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為GsHA16基因，自5’端第1-2856位為ORF，GsHA16基因編碼序列表中序列2所示的蛋白質，將序列2所示的氨基酸序列命名為GsHA16蛋白。二、GsHA16蛋白在植物細胞內的亞細胞定位分析1、以pEASY-GsHA16克隆載體質粒為模板，采用GsHA16-GFP-F/GsHA16-GFP-R引物進行PCR擴增，得到GsHA16基因全長CDS區(不含終止密碼子TAA)，引物序列如下所示(下劃線代表酶切位點)：GsHA16-GFP-F:5’-CGCATCGATATGGGTGGCATC-3’；GsHA16-GFP-R:5’-GGCTCTAGAAACTGTATAGTGCTGCTGAAT-3’。2、用限制性內切酶ClaI和XbaI分別對GsHA16基因全長CDS區和pBSK-eGFP載體進行雙酶切，連接，構建GsHA16-eGFP融合表達載體。通過PEG法將GsHA16-eGFP融合表達載體轉化擬南芥原生質體，同時以未轉化GsHA16-eGFP載體的原生質體作為對照，通過激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達。結果如圖1所示，未轉化GsHA16-eGFP載體的原生質體細胞中沒有觀察到綠色熒光信號，而轉化GsHA16-eGFP載體的原生質體細胞中綠色熒光蛋白主要分布在細胞膜上，說明GsHA16蛋白主要定位在細胞膜上。三、GsHA16基因在碳酸鹽脅迫條件下的表達模式分析1、植物材料的處理取3周齡的野生大豆幼苗，置于50mMNaHCO3(碳酸鹽脅迫)條件下處理，分別取處理0h、1h、3h、6h和12h的根尖組織，置于-80℃保存。2、cDNA的獲得取經上述處理不同時間后的野生大豆根尖組織各約100mg，液氮研磨，用RNAprepPlantKit(TIANGEN,catno:DP432)試劑盒并參照試劑盒說明書提取RNA。采用反轉錄試劑盒SuperScriptTMIIIReverseTranscriptasekit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反轉錄獲得cDNA。3、通過Real-timePCR對GsHA16基因進行表達量檢測以上述步驟2獲得的cDNA為模板，采用引物GsHA16-RT-F和GsHA16-RT-R進行Real-timePCR，對GsHA16基因進行表達量檢測。引物序列如下所示：GsHA16-RT-F：5’-ATCTTCGTCACAAGGTCCCGC-3’；GsHA16-RT-R：5’-GCAAAGCCCCAGTTAGCATACAC-3’。Real-timePCR采用比較CT法(ΔΔCT)計算基因表達量，以野生大豆GAPDH基因為內參基因，以未經處理的樣品作為對照。目標基因表達差異通過經過處理的樣本相對于每個時間點未經處理的樣本的倍數來表示。每個樣品包括3次生物學重復和3次技術重復，數據取3次生物學重復的平均值，如果有一個數值的偏差比較大則取兩個數據的平均值。原始數據經標準化處理。標準化處理后的數據經T-test進行差異顯著性分析。相對表達量計算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT處理-ΔCT對照)＝2-[(CT處理目的基因-CT處理內參基因)-(CT對照目的基因-CT對照內參基因)]。內參基因引物序列如下所示：GAPDH-RT-F：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’；GAPDH-RT-R：5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。定量Real-timePCR結果如圖2所示：碳酸鹽脅迫處理后，GsHA16基因表達量呈上升趨勢，并在碳酸鹽脅迫處理6h后達到頂峰，表明GsHA16基因的表達受碳酸鹽脅迫誘導。實施例2、轉GsHA16擬南芥植株的獲得及耐鹽堿性分析一、轉GsHA16擬南芥植株的獲得1、以pEASY-GsHA16克隆載體為模板，采用基因特異引物GsHA16-U-F和GsHA16-U-R進行PCR擴增，得到GsHA16基因全長CDS區。引物序列如下(下劃線代表載體構建時所需的接頭序列，其中U為USER酶切位點)：GsHA16-U-F:5’-GGCTTAAUATGGGTGGCATCAGC-3’；GsHA16-U-R:5’-GGTTTAAUTTAAACTGTATAGTGCTGCTGA-3’。2、用限制性內切酶PacI和Nt.BbvCI對pCAMBIA330035Su載體進行雙酶切，得到載體酶切產物。將獲得的載體酶切產物、USER酶(NEB,M5505S)和步驟1獲得的GsHA16基因在37℃下孵育20min，利用USER酶對GsHA16基因片段的尿嘧啶處進行切割，形成可與pCAMBIA330035Su載體互補的粘性末端，接著25℃下孵育20min，并轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α(全式金，CD201-01)，得到的重組表達載體記作pCAMBIA330035Su-GsHA16，并送交測序。測序結果表明：pCAMBIA330035Su-GsHA16在pCAMBIA330035Su載體中插入如序列表中序列1所示的GsHA16基因。GsHA16基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。3、采用凍融法，將pCAMBIA330035Su-GsHA16載體轉化至根癌農桿菌GV3101，獲得重組農桿菌，并經PCR鑒定得到陽性轉化子(含有序列表中序列1所示的GsHA16轉化子)，用于侵染擬南芥植株。4、轉GsHA16擬南芥的獲得及鑒定將上述重組農桿菌通過Floral-dip法侵染野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)。將T0代種子表面消毒后，播種于含25mg/L固殺草的1/2MS培養基上進行篩選。將T1代抗性苗移栽至營養缽中培養，提取基因組DNA，進行PCR和RT-PCR鑒定。具體步驟如下：采用EasyPurePlantGenomicDNAKit基因組提取試劑盒(全式金，EE111-01)，提取野生型和固殺草抗性植株的基因組DNA，用基因特異引物(GsHA16-FL-S和GsHA16-FL-AS)進行PCR鑒定(圖3)。對PCR鑒定陽性的植株，提取總RNA，采用半定量RT-PCR，以擬南芥ACTIN2基因為內參，利用實施例1中的Real-timePCR引物(GsHA16-RT-F和GsHA16-RT-R)檢測GsHA16基因在轉基因植株中的表達量(圖4)。ACTIN2基因特異引物序列如下：ACTIN2-RT-F：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；ACTIN2-RT-R：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。將RT-PCR陽性的T1代轉GsHA16擬南芥單株收種子，并分別播種于含25mg/L固殺草的1/2MS培養基上進行篩選，觀察T2代分離情況。如此重復，直至得到T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系。選取T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)用于下述耐碳酸鹽分析。二、轉GsHA16擬南芥耐碳酸鹽分析1、選取飽滿的野生型擬南芥、T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的種子，用5％NaClO處理6-8min，滅菌ddH2O沖洗5-7次，4℃春化3d，播種于正常的1/2MS培養基，22℃培養11d。待擬南芥長至六葉期，將幼苗分別移至正常的1/2MS培養基、含7mMNaHCO3的1/2MS培養基、含8mMNaHCO3的1/2MS培養基和9mMNaHCO3的1/2MS培養基豎直培養7d。實驗重復三次。結果如圖5A和圖5B所示。當NaHCO3的濃度為7mM時，T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長分別為4.37cm和4.49cm；野生型擬南芥的根長為3.98cm。當NaHCO3的濃度為8mM時，T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長分別為3.79cm和3.94cm；野生型擬南芥的根長為3.71cm。當NaHCO3的濃度為9mM時，T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長分別為3.08cm和2.97cm；野生型擬南芥的根長為2.74cm。從圖中和以上結果可以看出：碳酸鹽脅迫抑制了野生型擬南芥、T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的根的伸長(圖5A)，但T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長要長于野生型擬南芥(圖5B)。2、選取飽滿的野生型擬南芥、T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)種子，春化后播種于營養缽中(營養土：君子蘭土：蛭石1：1：1)，置于人工氣候培養箱中培養。選取長勢一致的4周齡擬南芥植株，每3d澆灌1次150mMNaHCO3(pH9.0)溶液進行鹽堿脅迫處理，觀察脅迫處理后植株表型。結果如圖5C所示：碳酸鹽脅迫處理后野生型擬南芥、T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)都逐漸失綠變紫甚至死亡，但是T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的長勢明顯優于野生型。上述結果表明GsHA16基因超量表達顯著提高了植物的碳酸鹽脅迫耐性。當前第1頁1 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