一種高效、快速篩選HIVP24抗原核酸適配體的方法與流程

本發明屬于生物技術檢測領域，涉及一種新的核酸適配體篩選方法，特別是一種高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法。

背景技術：

在2004年，全球估計有3590至4430萬人與人類免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至640萬人屬于新發感染病例，另外，有280至350萬人死于艾滋病。這些數字并在不斷增長中，其中，東亞、東歐、中亞等地區漲幅最快。HIV感染后可刺激機體生產囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。DNA適配體相比于抗體/抗原檢測具有以下優點：(1)DNA適配體更穩定，不易降解，可長期保存；(2)與靶分子結合力更強，甚至強于天然配基；(3)篩選周期較短，一般僅需1-2個月；(4)無免疫原性；(5)變性，復性速度較快，可反復使用，以及在室溫下運輸，保存；(6)相對于抗體，寡核苷酸適配體不具有效應器功能；(7)靈敏度高，可進行化學修飾，成本低等優點。而目前國內外檢測HIV方法用的是ELISA、免疫共沉淀法等方法，靈敏度低，成本高。因此提高靈敏度、降低檢測成本具有重要的意義。

核酸適配體在早期檢測中能檢測到pmol數量級的物質，所以對早期檢測具有重要意義。核酸適配體無免疫原性，易于修飾，變性、復性速度較快，可反復使用等優點，為早期檢測提供一種高靈敏度、低成本的檢測技術。現已有文獻表明已有篩選HIV P24抗原核酸適配體的研究，但結果均是未篩選出目標適配體。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一種高效、快速篩選獲得HIV P24抗原核酸適配體的方法，以及提供一種早期檢測技術。

本發明為實現上述目的所采用的技術方案是：一種高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法，其特征在于：以羧基化瓊脂磁珠為介質，進行6輪篩選，選出HIV P24抗原的高特異性核酸適配體。

所述6輪篩選是用兩輪正篩和四輪反篩篩選得到HIV P24抗原的高特異性核酸適配體。

所述高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法包括以下步驟：

(1)ssDNA文庫的處理；

(2)取0.3ml磁珠于1.5mLEP管中，加入300ul HIV P24抗原，37℃，孵育2h，棄去EP管中的抗原，加入500uL封閉液，37℃，1h，結合初級ssDNA文庫，37℃，孵育1h；

(3)棄去未結合ssDNA文庫，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，加入200ul去離子水，95℃，10min，收集上清，作為下一輪篩選的次級庫；

(4)取磁珠0.15mL，加入150uL已稀釋100倍的HIV P24抗原，結合次級庫，重復步驟(2)的步驟；

(5)正篩管：取磁珠0.15mL，加入已稀釋100倍的150uL HIV P24抗原，37℃，孵育1h，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，然后加入500uL封閉液，37℃，1h；

(6)qPCR擴增獲得dsDNA：dsDNA反應體系見表1，在上述PCR反應體系中加入80ul模板，充分混勻，每管30ul，分成8管，qPCR進行擴增，S型曲線達到最高點停止擴增；

表1 dsDNA qPCR反應體系

(7)取0.1mL鏈霉親和素磁珠于1.5mLEP管中，加入擴增后的dsDNA，37℃，孵育30min，棄取上清液，用500ul的TPBS，37℃水浴，每次4min,重復3次，用水洗1次，加入200uL結合緩沖液，95℃，5min，收集上清液，然后將上清液加入到反篩管中，37℃，孵育45min，將未結合的ssDNA文庫再與正篩管于37℃，旋轉孵育1h，除去未結合的ssDNA文庫；

(8)正篩管和反篩管都用篩選緩沖液洗3次，每次3min，各加入200ul去離子水，95℃，5min，收集上清，作為下一輪篩選的次級庫；

(9)富集效果監測：按照表2所示反應體系添加試劑，充分混勻后，分為4管，每管20ul；取分好的3管體系，各加入10ul正篩管上清、反篩管上清、去離子水，qPCR進行檢測；

表2集效果監測qPCR反應體系

(10)重復上述篩選步驟，在第3輪反篩管磁珠中加入已稀釋100倍的150uL HIV gp41抗原，并在每輪篩選中加入tRNA非特異性競爭劑進行篩選，增加篩選的特異性，共進行6輪篩選，各輪SELEX篩選條件見表3；

表3各輪SELEX篩選條件

本發明大大的縮短了篩選周期、降低了篩選成本；同時提供了一種靈敏度高、成本低的早期檢測技術，也為篩選分子機理研究奠定了基礎。

附圖說明

圖1為本發明篩選流程圖。

圖2為本發明反篩第三輪qPCR檢測結果圖。

圖3為本發明反篩第四輪qPCR檢測結果圖。

圖中：1，3—HIV P24抗原，2，4—HIV P24抗體。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明，但本發明并不局限于具體實施例。

實施例

一種高效、快速篩選HIV P24抗原核酸適配體的方法，以羧基化瓊脂磁珠為介質，進行6輪篩選，選出HIV P24抗原的高特異性核酸適配體，所述6輪篩選是用兩輪正篩和四輪反篩篩選得到HIV P24抗原的高特異性核酸適配體，具體包括以下步驟：

(1)ssDNA文庫的處理；

(2)取0.3ml磁珠于1.5mLEP管中，加入300ul HIV P24抗原，37℃，孵育2h，棄去EP管中的抗原，加入500uL封閉液，37℃，1h，結合初級ssDNA文庫，37℃，孵育1h；

(3)棄去未結合ssDNA文庫，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，加入200ul去離子水，95℃，10min，收集上清，作為下一輪篩選的次級庫；

(4)取磁珠0.15mL，加入150uL已稀釋100倍的HIV P24抗原，結合次級庫，重復步驟(2)的步驟；

(5)正篩管：取磁珠0.15mL，加入已稀釋100倍的150uL HIV P24抗原，37℃，孵育1h，用篩選緩沖液洗3次，每次1min，然后加入500uL封閉液，37℃，1h；

(6)qPCR擴增獲得dsDNA：dsDNA反應體系見表4，在上述PCR反應體系中加入80ul模板，充分混勻，每管30ul，分成8管，qPCR進行擴增，S型曲線達到最高點停止擴增；

表4 dsDNA qPCR反應體系

(7)取0.1mL鏈霉親和素磁珠于1.5mLEP管中，加入擴增后的dsDNA，37℃，孵育30min，棄取上清液，用500ul的TPBS，37℃水浴，每次4min,重復3次，用水洗1次，加入200uL結合緩沖液，95℃，5min，收集上清液，然后將上清液加入到反篩管中，37℃，孵育45min，將未結合的ssDNA文庫再與正篩管于37℃，旋轉孵育1h，除去未結合的ssDNA文庫；

(8)正篩管和反篩管都用篩選緩沖液洗3次，每次3min，各加入200ul去離子水，95℃，5min，收集上清，作為下一輪篩選的次級庫；

(9)富集效果監測：按照表5所示反應體系添加試劑，充分混勻后，分為4管，每管 20ul；取分好的3管體系，各加入10ul正篩管上清、反篩管上清、去離子水，qPCR進行檢測；

表5集效果監測qPCR反應體系

(10)重復上述篩選步驟，在第3輪反篩管磁珠中加入已稀釋100倍的150uL HIV gp41抗原，并在每輪篩選中加入tRNA非特異性競爭劑進行篩選，增加篩選的特異性，共進行6輪篩選，各輪SELEX篩選條件見表6；

表6各輪SELEX篩選條件

此流程利用磁珠法經過6輪篩選成功的獲得了HIV P24核心抗原的適配子，從反篩第三輪開始替換反篩管偶聯的靶標，目的是為了盡可能多的減少非特異性單鏈，從而獲得高特異性的適配體。對于后期的分子間的機理研究以及技術檢測具有非常重要的作用。技術方法快速、準確、成本低,配基特異性高，為早期檢測提供了簡單的方法。為腫瘤的治療提供了一種新的載體。適配體可以偶聯治療腫瘤的藥物并定向地輸送到特異性腫瘤細胞中。

以上內容是結合優選技術方案對本發明所做的進一步詳細說明，不能認定發明的具體實施僅限于這些說明。對本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明的構思的前提下，還可以做出簡單的推演及替換，都應當視為本發明的保護范圍。