一種用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的質粒載體及方法與流程

本發明屬于植物育種技術領域，具體涉及一種用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的質粒載體及方法。

背景技術：

植物經常處于逆境脅迫的環境中，植物應對脅迫常見的響應就是促進活性氧的積累(Halliwellet al.，1998)。RCD1蛋白是植物逆境和生長發育過程中一個重要的調節因子(Jaspers et al.，2009；Teotia Setal.，2009)。SRO是植物特有的小蛋白家族，在擬南芥中，該家族共有六個成員，包括RCD1和5個SROs(SIMILAR-TO-RCD-ONE)，即AtSRO1-AtSRO5(Jaspers et al.，2009)。RCD1蛋白包含一個保守的球狀WWE結構域和一個PARP(poly ADP-ribose polymerase)結構域，WWE結構域可以調節特定蛋白質之間的相互作用(Aravindet al.，2001)。

土壤鹽漬度是一個影響植物生長和農業生產力的重要環境因素，鹽漬土中的Na⁺在植物體細胞質中過度積累對植物生長發育是不利的(Liu et al.，2001)。SOS(salt overly sensitive)途徑負責維持植物體內的Na⁺平衡(Zhu et al.，2002)，Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白SOS1定位于質膜上，它可以將細胞內的Na⁺排出(Qiu et al.，2002)。擬南芥中，過量表達SOS1可以提高抗鹽脅迫能力。前人研究表明，擬南芥SOS1和RCD1在鹽脅迫和氧化脅迫時發生相互作用，共同參與植物的抗鹽和抗氧化途徑(Katiyar-Agarwal et al.，2006)。

植物體內對氧化脅迫的響應有利于植物的正常生長發育。前人研究表明酵母的Yap1(Yeast activator proteins 1)參與酵母細胞對H₂O₂引起的氧化脅迫反應，它作為H₂O₂轉錄因子在氧化脅迫信號中扮演重要角色(Carmel‐Harel et al.，2001；Fernandes et al.，1997)。植物中有許多參與氧化脅迫的相關因子已被深入研究，比如致病相關蛋白(RP)、抗壞血酸氧化酶(APX)、苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)等(Teotia et al.，2009)。Belles-Boix等研究表明，擬南芥RCD1可以增強酵母抗氧化能力并互補Yap1突變酵母表型，表明AtRCD1在擬南芥的氧化脅迫中扮演重要的角色(Belles-Boix et al.，2000)。擬南芥突變體rcd1-1表現出對臭氧和超氧化物超敏感，引起超氧根離子的積累，并在短時間內傳播病態(Overmyer et al.，2005)。此外，突變體還表現出對脫落酸、乙烯、茉莉酸甲酯敏感度降低，并且這幾種植物激素調節基因的表達量也發生了改變(Overmyer et al.，2000)。因此，AtRCD1在調節擬南芥的生長發育及對環境脅迫的反應中發揮重要作用。

擬南芥中，AtRCD1的同源基因AtSROs在PARP(Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和C-末端的RST[RCD-SRO-TAF4(TATA-box-binding protein-associated factor 4)]結構域上與AtRCD1具有高度保守性(Jaspers et al.，2009)。研究表明，AtSRO1與AtRCD1之間在功能上存在部分功能冗余,AtSRO1同樣參與到非生物脅迫反應當中(Ahlfors et al.，2009；Jaspers et al.，2009；Overmyer et al.，2000)，AtSRO5表達明顯受鹽脅迫誘導(Borsani et al.，2005)，AtSRO2、AtSRO3和AtSRO5也顯示出對多種非生物脅迫下轉錄子水平的變化,比如強光、鹽處理及O₃(Jaspers et al.，2010)。然而AtSRO4的研究相對較少，沒有相關類似的功能。

在擬南芥中RCD1已經進行了克隆和功能鑒定，但是在蘋果中的尚未見報道。因此，需要一種得到對鹽脅迫具有增強抗性的植物的方法。

技術實現要素：

為解決現有技術的不足，本發明提供了一種用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的質粒載體及方法。該技術方案從蘋果嘎啦中分離克隆出的抗鹽相關基因完整編碼區段的核苷酸序列，同時提供了該基因在抗鹽的轉基因擬南芥和煙草中的應用，可用于通過植物基因工程技術改善植物抗鹽性和其他有益生產性狀。

一種用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的質粒載體，包含MdMAX1基因表達框和篩選標記，所述MdMAX1基因表達框由包含在植物中組成型表達的強啟動子和由所述強啟動子控制表達的MdMAX1基因，所述MdMAX1基因表達的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。

該基因片段來源于嘎啦蘋果組培苗，其通過特殊設計的引物擴增嘎啦基因組DNA獲得，其中所述的引物包括引物1，5-CCATCACCAATCTATTAAACCT-3，引物2，5-CAAGAACATTACAGGACTGAAG-3，得到cDNA全長序列。該基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)為1623bp，編碼540個氨基酸。之后利用強啟動子(花椰菜花葉病毒35S啟動子)驅動原理的轉基因技術，將MdMAX1基因的超量表達載體轉入擬南芥和煙草中，從而獲得轉基因植株。超量表達MdMAX1基因的轉基因擬南芥在鹽脅迫下，萌發率明顯降低，葉片中活性氧物質含量顯著增多；同時MdMAX1基因表達量顯著提高的遺傳轉化煙草對鹽脅迫更加敏感，說明MdMAX1基因在植株抗鹽中發揮重要作用。

優選的，所述MdMAX1基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

優選的，所述植物是擬南芥、蘋果或煙草。

優選的，所述質粒載體由所述MdMAX1基因順著CaMV35S啟動子的轉錄方向插入到pCAMBIA 1300質粒的BamHⅠ和PsTⅠ之間得到。

本發明還提供了一種用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的方法，包括以下步驟：將權利要求1-4中任一項所述的質粒載體導入到植物細胞中，篩選攜帶有所述質粒載體的植物細胞，并將其培育成植株，即得到對鹽脅迫高敏感的植物。

具體的，所述植物是擬南芥、蘋果或煙草。

當為擬南芥時，用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的方法包括以下步驟：

1)用所述質粒載體轉化農桿菌LBA4404，得到攜帶有所述質粒載體的農桿菌LBA4404；

2)用所述攜帶有所述質粒載體的農桿菌LBA4404制作為侵染液；

3)用所述侵染液侵染擬南芥花序，收集果莢，抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉基因植株，經過連續多代篩選得到純合體，收取種子，培養，得到對鹽脅迫高敏感的擬南芥。

具體的，包括以下步驟：

1)將獲得的擬南芥種子，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min，滅菌水沖洗5次，吸干水，播種于種子萌發培養基上，光培養，至小苗長出，移栽到基質培養到開花；

2)選取農桿菌LBA4404單克隆菌落接種于10mL YEP液體培養基中，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液體培養基內，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8，離心收集菌體，用稀釋液懸浮稀釋20倍，得到侵染液，備用；

3)將擬南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果莢，50mg·L-1Hyg抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉基因植株，經過連續3代篩選得到T3代純合體，收取種子，培養，得到對鹽脅迫高敏感的擬南芥。

當為煙草時，用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的方法包括以下步驟：

1)用所述質粒載體轉化農桿菌LBA4404，得到攜帶有所述質粒載體的農桿菌LBA4404；

2)用所述攜帶有所述質粒載體的農桿菌LBA4404轉化為侵染液；

3)用所述侵染液侵染煙草的幼嫩組織，分化培養得到初代芽體后切下進行繼代培養，生根培養，得到對鹽脅迫高敏感的煙草。

具體的，包括以下步驟：

1)播種：將獲得的煙草種子，分別用70％酒精消毒1min，0.7％次氯酸鈉消毒23-25min，滅菌水沖洗3次，吸干水。播種于種子萌發培養基上，光培養；

2)預培養：剪下幼嫩葉片，切成方形,葉片向光面向上擺放于預培養培養基上，倒置培養1d；

3)選取農桿菌LBA4404單克隆菌落接種于10mL YEP液體培養基中，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液體培養基內，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8，離心收集菌體，用MS液體培養基懸浮稀釋20倍，得到侵染液，備用；

4)將經預培養的煙草葉片浸入菌液10min，期間多次搖晃；然后倒掉菌液，用無菌濾紙吸干多余菌液，轉移至共培養基上，封口，28℃暗培養1d，之后，移至分化培養基上培養，每隔15d更換一次培養基。

5)待芽長至2cm時，切下，部分繼續繼代培養，部分移入MS生根培養基上進行生根。根系發育好后，煉苗后移入盛有基質的營養缽中，溫室常規管理，得到對鹽脅迫高敏感的煙草。

總體上，本發明的發明人基于首次發現了從蘋果中分離克隆出的抗鹽相關基因完整編碼區段的DNA片段，并命名為MdMAX1，從而提供了用于得到對鹽脅迫高敏感的植物的方法。

附圖說明

圖1：MdMAX1與其同源基因蛋白序列比對。

圖2：嘎啦組培苗在不同逆境處理條件下，MdMAX1基因的相對表達量。

分別用100mMNaCl(左圖)和300mM甘露醇(右圖)處理嘎啦蘋果組培苗，分別于0h、3h、6h、12h、24h取樣，用液氮固定，進行RNA提取并反轉錄作為模板，檢測MdMAX1基因的相對表達量。

圖3：超量表達構建載體pCAMBIA1300圖譜。

圖4：野生型擬南芥(col)和轉基因擬南芥株系(#3、#5、#7、#8)的半定量RT-PCR以及定量PCR檢測MdMAX1基因表達量。野生型擬南芥(col)中MdMAX1表達量為1。

圖5：鹽和甘露醇脅迫下擬南芥種子萌發實驗。(A-C)在1/2MS，150mMNaCl、300mM甘露醇培養基下，野生型擬南芥(col)和轉基因擬南芥株系(#3、#5、#7、#8)萌發情況觀察及統計。(D)不同濃度NaCl(75mM、125mM和150mM)處理以及不同濃度甘露醇(200mM、300mM)處理，擬南芥萌發情況統計。

圖6：DAB和NBT染色觀察離體葉片活性氧積累情況。野生型擬南芥(col)和轉基因擬南芥株系(#3、#5、#7、#8)離體葉片150mMNaCl和200mM甘露醇處理4h,DAB和NBT染色觀察葉片中活性氧(H2O2和O2-)含量。

圖7：野生型煙草(NC89)和轉基因擬南芥株系(MAX1-9、MAX1-11和MAX1-17)定量PCR檢測MdMAX1基因表達量。基因表達量最低的MAX1-11株系中MdMAX1基因表達量設定為1。

圖8：野生型煙草(NC89)和轉基因擬南芥株系(MAX1-9、MAX1-11和MAX1-17)用300mMNaCl處理15天后表型觀察。

具體實施方式

以下對本發明的原理和特征進行描述，根據以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發明所采用的均為本領域現有技術。

實施例1：分離克隆MdMAX1基因和基因結構分析

1.從蘋果嘎啦品種中分離克隆MdMAX1基因

(1)嘎啦組培葉片RNA提取及反轉錄

方法同MdSIMYB1專利(專利201210197919.5)中實例1中的步驟一)、二)、三)

(2)cDNA全長序列的獲得

根據NCBI查到的擬南芥中MAX1基因保守氨基酸序列，設計兼并引物(MdMAX1-F,MdMAX1-R)，以實例1步驟一)反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增。

MdMAX1-F：5’-CCATCACCAATCTATTAAACCT-3’，其序列如SEQ.ID.NO.3所示；

MdMAX1-R：5’-CAAGAACATTACAGGACTGAAG-3’，其序列如SEQ.ID.NO.4所示；

PCR擴增體系方法同MdSIMYB1專利(專利號201210197919.5)中實例1步驟四)中2)的PCR體系。

PCR反應程序：94℃預變性5分鐘；循環參數為94℃變性40秒、56℃退火40秒、72℃延伸90秒，進行32個循環；72℃充分延伸10分鐘。PCR反應結束后，PCR產物進行回收、載體連接、轉化(具體方法參見專利201210197919.5實例1步驟四)中的1)，在北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定后，得到MdMAX1基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。測序正確的單克隆，堿法提取pMD18-T-MdMAX1的質粒DNA，-20℃保存，用于后續功能驗證實驗。

2.蘋果MdMAX1基因產物的結構和氨基酸序列分析

該基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)為1623bp。由此推得，該基因編碼540個氨基酸。將其氨基酸序列在國際基因庫中檢索，發現與已公布的擬南芥，葡萄，油菜等基因有較高的同源性。所以我們將該基因命名為MdMAX1。(附圖1)

實施例2：MdMAX1基因在鹽脅迫處理下表達模式分析

(1)將生長狀況一致的蘋果嘎啦組培苗，分別用NaCl(100mM)、甘露醇(300mM)處理蘋果組培苗0h、3h、6h、12h、24h，用未處理的狀態一致的材料做對照。材料取好后液氮中迅速固定，提取RNA并反轉錄得cDNA。。

(2)在MdMAX1基因的非保守區設計特異引物MdMAX1(qRT)-F、MdMAX1(qRT)-R，及蘋果的內參引物Md18S-F、Md18S-R。

Md18S-F：5’-AAACGGCTACCACATCCA-3’；

Md18S-R：5’-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’；

MdMAX1(qRT)-F:5’-ATCAGCCACCACAGCATTCACAT-3’；

MdMAX1(qRT)-R：5’-GCGGTCCAAATCCATCAATCTCTGC-3’；

(3)用實例3步驟(1)中所得的cDNA為模板，用蘋果內參引物Md18S-F和Md18S-R調整這些cDNA模板，使各cDNA模板濃度一致。

反應程序為：94℃預變性4分鐘；循環參數為94℃變性25秒、56℃退火25秒、72℃延伸30秒，運行25個循環；72℃后延伸l0分鐘。擴增產物在1％瓊脂糖凝膠上做電泳分析，用Lab Assistant TM Gel3000Series凝膠成像分析儀檢測條帶亮度，據結果將cDNA稀釋至適當倍數，使其濃度一致。

(4)用濃度一致的cDNA模板進行定量PCR，檢測嘎啦組培苗經逆境處理后MdMAX1基因的表達差異。

結果顯示MdMAX1基因經鹽和甘露醇脅迫處理后表達上調，表明該基因受鹽和甘露醇脅迫誘導(附圖2左NaCl處理，右甘露醇處理)

實施例3：MdMAX1基因載體的構建

為研究MdMAX1基因的功能，將包含有MdMAX1基因編碼區在內的共1623bp片段正確插入表達載體pCAMBIA 1300上。(附圖3)

(1)利用DNAMAN等軟件，根據分離出的MdMAX1基因的核苷酸序列(SEQ.ID.NO:1)，設計帶酶切位點的引物EMdMAX1-F和EMdMAX1-R，以實例1步驟二)中4)所保存的pMD18-T-MdMAX1的質粒DNA為模板，進行PCR反應。

EMdMAX1-F：5’-GGATCCCCATCACCAATCTATTAAACCT-3’其序列如SEQ.ID.NO.5所示；

劃橫線部分為BamHⅠ酶切位點；

EMdMAX1-R：5’-CTGCAGCAAGAACATTACAGGACTGAAG-3’其序列如SEQ.ID.NO.6所示；

劃橫線部分為PstⅠ酶切位點；

(2)PCR反應結束后，進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳、PCR產物回收、載體連接、轉化、測序(具體步驟參見專利201210197919.5實例1步驟四)中的1)。堿法提取其質粒DNA，用BamHⅠ和PstⅠ雙酶切，鑒定正確后用于后面的實驗。

(3)用BamHⅠ和PstⅠ兩個內切酶，同時雙酶切中的(2)所得質粒DNA與pCAMBIA 1300質粒，回收MdMAX1的片段和pCAMBIA 1300載體片段，用T4連接酶將二者連接起來。篩選陽性克隆進行測序，從中選擇正確的重組子pCAMBIA 1300-MdMAX1。

(4)用構建好的重組子pCAMBIA 1300-MdMAX1轉化農桿菌LB4404感受態細胞。進行PCR鑒定，挑取陽性菌落進行測序。測序正確的重組子pCAMBIA 1300-MdMAX1單克隆用于后面擬南芥和煙草的轉化。

實施例4：轉基因擬南芥和煙草的獲得

(1)獲得轉基因擬南芥

1.將獲得的擬南芥種子，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水沖洗5次，吸干水。播種于種子萌發培養基上(直接鋪于表面)，光培養(25-28℃，16h長日照/8h短日照，10d)，至小苗長出。移栽到基質培養到開花。

2.挑取農桿菌單克隆菌落接種于10mL YEP液體培養基(含50mg/L潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8(約48h)；取其中lmL菌液加入20mL YEP液體培養基內，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8(約5h)。離心收集菌體，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％Silweet)懸浮稀釋20倍，備用；

3.將擬南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果莢，50mg·L^-1Hyg抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉基因植株，經過連續3代篩選得到T3代純合體，收取種子，進行表型分析。

(2)獲得轉基因煙草

1.播種：將獲得的煙草種子，分別用70％酒精消毒1min，0.7％次氯酸鈉消毒23-25min(期間多次搖晃)，滅菌水沖洗3次，吸干水。播種于種子萌發培養基上(直接鋪于表面)，光培養(25-28℃，16h長日照/8h短日照，15d)。

2.預培養：剪下幼嫩葉片，切成方形(約1cm),葉片向光面向上擺放于預培養培養基上，倒置培養1d。

3.挑取農桿菌單克隆菌落接種于10mL YEP液體培養基(含50mg/L潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8(約48h)；取其中lmL菌液加入20mL YEP液體培養基內，28℃、200rpm，振蕩培養至OD600為06-0.8(約5h)。離心收集菌體，用MS液體培養基懸浮稀釋20倍，備用；

4.將經預培養的煙草葉片浸入菌液10min，期間多次搖晃；然后倒掉菌液，用無菌濾紙吸干多余菌液，轉移至共培養基上，封口，28℃暗培養1d。之后，移至分化培養基上培養(條件：28℃，光照時間16h/d，光照強度2000Lux)。每隔15d更換一次培養基。

5.待芽長至2cm左右時，切下，部分繼續繼代培養，部分移入MS生根培養基上進行生根。根系發育好后，煉苗后移入盛有基質的營養缽中，溫室常規管理。

種子萌發培養基：1/2MS

煙草預培養、共培養培養基：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L

煙草分化培養基：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Hyg 30mg/L+Cb250mg/L.

煙草生根培養基：MS+IAA 0.1mg/L

實施例5：MdMAX1基因在擬南芥中功能驗證

利用篩選培養基(含100mg/L潮霉素)篩選抗潮霉素陽性的候選轉基因株系，共獲得4個35S:MdMAX1陽性株系(#3、#5、#7和#8)；為進一步鑒定轉基因株系，在進行繼代培養時，每株系各取0.1g左右的組培苗，提取相應的RNA，反轉錄并進行半定量RT-PCR檢測和定量，以確定這些株系中MdMAX1基因的表達水平。結果顯示，MdMAX1基因在#3、#5、#7及#8中過量表達(附圖4)。

為了進一步確定轉基因植株的功能，我們在鹽脅迫條件下對擬南芥的萌發率進行統計，同時觀察擬南芥葉片在脅迫下氧化性物質的積累情況。

1)種子處理。將獲得的擬南芥種子(col，#3，#5，#7，#8)，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水沖洗5次，吸干水。播種于種子萌發培養基上(1/2MS，含75mM、100mM、125mM、150mMNaCl及200mM、300mM甘露醇)。4℃層積處理4天后至光下培養(25-28℃，16h長日照/8h短日照，10d)。

2)種子萌發統計。光學顯微鏡下觀察統計種子萌發率。

3)結果觀察。在1/2MS培養基上，野生型和轉基因株系種子萌發沒有明顯的差異；在含有150mMNaCl和300mM甘露醇的培養基上，轉基因株系種子萌發比野生型明顯慢，同時在不同濃度NaCl和甘露醇處理的培養基上，也顯示出同樣的結果(附圖5)。對離體的葉片NaCl和甘露醇處理后，觀察活性氧含量，結果顯示，轉基因株系葉片中活性氧物質(H2O2和O2^-)含量比野生型更多。(附圖6)這說明超量表達MdMAX1基因的轉基因擬南芥對鹽脅迫更敏感。

實施例6：MdMAX1基因在煙草中功能驗證

按照實施例5所示的方法，準備超量表達MdMAX1基因的轉基因煙草。定量PCR結果顯示，獲得MAX1-9，MAX1-11，MAX1-17三個轉基因煙草。(附圖7)

選擇生長狀態良好且均一的3個轉基因株系和野生型的煙草幼苗，進行鹽脅迫逆境處理。如圖所示，在鹽處理15天后，轉基因煙草顯示出更嚴重的枯萎表型。結果表明，超量表達MdMAX1基因的轉基因煙草對鹽脅迫更敏感。(附圖8)。

綜上所述，這些結果充分說明了MdMAX1基因是一個抗鹽相關的基因，該基因的過量表達可以降低植株的抗鹽能力。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。