檢測leber氏致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬分子生物學技術領域，設及檢測LEBER氏致病基因突變的方法，及其引 物、試劑盒。
【背景技術】
[0002] LEBER氏（Leberhereditaryopticneuroretinopathy)是一種遺傳性視神經病， 現有的檢測L邸邸氏的致病基因技術包括：突變特異性引物PCR檢測、異源雙鏈-單鏈構象 多態性、限制性片段長度多態性和測序方法。主要是基于單個突變位點的PCR和測序方法 及單基因忍片方法，顯著缺點主要在于僅僅能檢測單個突變位點，不能對多個突變位點進 行同時檢測，也不能對分布于多個外顯子的位點進行同時檢測。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測LEBER氏致病基因突變的方法， 其解決了現有技術中進行LEBER氏致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污染和 靈敏度低等問題。
[0004] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種檢測LEBER氏致病基因突變 的方法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，其包括如下實現步驟：
[0005] 樣本處理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0006]DNA提取，取220μ1抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[0007] 1)加220μ1BufferBL，震蕩混合，于70°C解育10分鐘；
[000引。加220μ1無水乙醇震蕩混合約20秒；
[0009] 3) 12000巧m離屯、1 分鐘；
[0010] 4)取上清轉入收集柱中，12000巧m離屯、2分鐘；
[0011] 5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500 μ 1皿solution,室溫放置5分鐘；
[0012] 6)12000巧m離屯、2分鐘；
[0013] 7)加入 700μ1 wash Buffer, 12000巧m離屯、2 分鐘；
[0014] 8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700 μ 1 wash Buffer, 12000巧m離屯、2分 鐘；
[001引 9)棄收集管內液體，12000巧m離屯、2min;
[0016] 10)將收集柱放入一個新的1. 5ml離屯、管內，加入50μ1 70°C預熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000巧m離屯、2分鐘，濾液即為模板DNA;
[0017]PCR擴增
[001引PCR反應體系：
[0019] 10XPCRBuffer2μ1；
[0020] HotStarTaq DNA Polymerase按kit標準調整；
[00引]dNTPmix2";
[0022]上游引物PrimerU1μ1 ;
[0023]下游引物PrimerL1μ1 ;
[0024] DM模板Xμ1 ;
[00巧]滅菌蒸饋水20μ1---上述總體積；
[0026] PCR產物電泳：1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；
[0027] PCR產物純化
[0028] 每管內加入100μ1PCR-A液，混勻，轉入純化柱內，12000巧m離屯、2min;
[0029]棄收集管內液體，加入 700μ1washingbuffer, 12000巧m離屯、2min;
[0030]棄收集管內液體，加入 400μ1washingbuffer, 12000巧m離屯、2min;
[003。棄收集管內液體，12000巧m離屯、2min;
[003引柱內加入30μ1 70°C預熱洗脫液，12000巧m離屯、3min;
[0033] 測序反應
[0034]反應體系：0. 8μ1Bi曲ye+1.5ylBi曲yeSeqBuffer+3yl引物+1μ1PCR純 化產物 +3. 5μ1dd&0 ;
[0035] 測序PCR熱循環條件：
[0036] 1)變性的條件，96°ClOsec;
[0037] 5)退火的條件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25個循環；
[0038] 6)延伸的條件，60°C4min;
[0039] 7)4°C保溫；
[0040] 每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算；
[0041] 測序產物純化
[0042] 10μ1反應體系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0043] 1)每管加入100μΙ100%酒精，或每管加入1μ1 125mM邸TA到管底，或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底，然后震蕩混勻，室溫放置15min;
[0044] 2) 10°C，4000巧m離屯、30min，馬上倒置，1200巧m離屯、Imin;
[0045] 3)每管加入100μl70%酒精，離屯、15min;5°C，3600巧m離屯、30min，馬上倒置， 1200巧m離屯、Imin;
[0046] 4)室溫揮發凈酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[0047] 5) 95°C變性 5min，4°C保溫 4min，加樣上機；
[0048]6)測序純化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[004引 PCR檢測，包括：
[0050]1)對照孔的設立和檢測重復孔：樣本檢測同時設有對照實驗，包括陰性對照；對 照和樣本均采用復孔.
[0051] 在LE邸R氏基因突變位點兩端設計Ξ對特異性引物；
[0052]所述引物是G11778A、T14484C和G3460A;
[0053]所述引物G11778A的sense為：
[0054] 5'-TCAATCAGCCACATAGC-3',
[00巧]所述引物G11778A的antisense為：
[0056] 5'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3',
[0057]所述T14484C的sense為：
[0058] 5'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3',
[0059]所述T14484C的antisense為：
[0060]日'-CGCCCATAATCATACAAA-3'；
[0061]所述G3460A的sense為：
[0062]5,-CTAATGCTTACCGAACGA-3,，
[0063]所述G3460A的antisense為：
[0064] 5' -TGATGGCTAGGGTGACTT-3'；
[0065] 所述引物PCR擴增出目的片段模板；
[006引所述目的片段的獲取包括：W上述引物分別對人基因組DNA進行PCR擴增得到條 帶單一的目的基因片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度為10-2化g/μ1，作為檢 測陰性對照用；
[0067] 2) 25 μ 1反應體系檢測：
[0068] PremixTaqPC民Masl:erMIX 12.5μ1 DNA模板 l-lOng/μΙ PrimerU 終濃度為400ηΜ PrimerL 終濃度為400nM 滅菌蒸傭水 郵化25μ1
[0069] 混合均勻；所有樣本混合完后，將ΑΒΙVeritiDxPCR系統儀器中進行程序性檢 測；
[0070] 結果分析及判定：對PCR產物進行測序分析。
[0071] 本發明的另一目的在于提供一種檢測LEBER氏致病基因突變的引物，其特征在 于，所述引物序列包括：
[0072]沈Q ID N0:1 5'-TCAATCAGCCACATAGC-3'
[0073]沈Q ID N0:2 5'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3'
[0074]沈Q ID N0:3 5'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3'
[00巧]SEQID N0:4 5，-CGCCCATAATCATACAAA-3'
[0076]沈Q ID N0:5 5'-CTAATGCTTACCGAACGA-3'
[0077]沈Q ID N0:6 5'-TGATGGCTAGGGTGACTT-3'。
[0078] 本發明的還一目的在于提供一種包括所述引物的檢測LE邸R氏致病基因突變的 試劑盒。
[0079] 本發明的有益效果為：
[0080] 利用3對特異性引物同時對患者的可能的突變位點進行檢測，使用該方法能保證 95%W上的疾病檢出率。直接W全血樣作PCR的DNA模板，設計并合成特異性PCR引物，擴 增產物并進行測序，可W直接檢測L冊N患者線粒體DNA3個原發性致病突變位點位點的具 體情況，具有較高的特異性和準確性。其解決了現有技術中進行LEBER氏致病基因突變檢 測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污染和靈敏度低等問題，尤其是提供了病理組織之外的非 創傷性如血清或血漿等檢測。
【附圖說明】
[0081] 此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申 請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：[008引圖1是本發明實施例1PCR擴增產物電泳結果示意圖。
[0083] 圖2為本發明G11778A檢測結果示意圖。
[0084] 圖3為本發明T14484C檢測結果示意圖。
[0085] 圖4為本發明G3460A檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0086]W下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，運些實施例是用于說明 本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可W根據具體廠家的條件做 進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
[0087] 實施例1
[0088] 樣本處理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0089]DNA提取，取220μ1抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[0090] 1)加 220μ1BufferBL，震蕩混合，于 70°C解育 10 分鐘；
[0091] 2)加220μ1無水乙醇震蕩混合約20秒；
[0092] 3) 12000巧m離屯、1 分鐘；
[009引4)取上清轉入收集柱中，12000巧m離屯、2分鐘；
[0094] 5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分鐘；
[0095]6) 12000巧m離屯、2 分鐘；
[0096] 7)加入 700μ1wash Buffer,12000巧m離屯、2 分鐘；
[0097] 8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μ1wash Buffer,12000巧m離屯、2分 鐘；
[0098] 9)棄收集管內液體，12000;rpm離屯、2min;
[0099] 10)將收集柱放入一個新的1. 5ml離屯、管內，加入50μ1 70°C預熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000巧m離屯、2分鐘，濾液即為模板DNA;
[0100]PCR擴增
[0101]PCR反應體系：
[010引10XPCR Buffer2μ1;
[0103] HotStarTaq DNAPolymerase按kit標準調整；
[0104]dNTPmix2μ1；
[0105]上游引物PrimerU1μ1;
[0106]下游引