一種高通量測序檢測無創親子鑒定的方法與流程

本發明屬于基因工程領域，具體地說是涉及一種高通量測序檢測無創親子鑒定的方法。
背景技術：
：親權鑒定是指通過檢測與分析一系列多態性遺傳標記來判定父母與子女之間是否存在生物學親緣關系。現代親權鑒定的方法采用DNA分析，主要是應用第二代遺傳標記——短串聯重復序列(STR)分型技術，即通過對DNA樣品進行15-20個STRs的檢測、分型和統計而達到計算出親權概率的目的，若有3個及以上STR位點不同，可排除親子關系。然而，在近20年的應用中，人們發現STR分型技術中由于不同等位基因的序列長度相似，區分和判型具有一定的困難，一般每個PCR反應的判型錯誤率可達1％-5％(Boninetal.2004；Welleretal.2004)，判型錯誤會直接影響親子鑒定的準確性和可重復性。單核苷酸多態性(SNP)是指在基因組水平上，特定核苷酸位置上存在兩種或兩種以上不同的堿基，引起DNA系列的多態性，其中任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1％，已成為繼限制性酶切片段長度多態(RFLP)和STR多態標記后的第三代分子遺傳標記。在遺傳制圖、連鎖性分析、疾病基因定位和物種多態性研究等諸多領域中，SNP已經逐漸取代STR，成為首選的遺傳標記。SNP的數量較為龐大，在人類基因組中分布極為廣泛，大約每1000個堿基中就存在一個SNP，估計人類基因組中約含有數百萬個SNP位點。與STR相比，具有以下優勢：(1)其突變率低、擴增片段長度短，不存在著多個核心序列重復、核心序列的非整倍重復等現象，相較于STR更為穩定；(2)對DNA樣本的要求更低，適應更多的特殊環境；(3)檢測更加廉價，且通量更高；(4)同時，由于SNP為等位基因，一方面使得分析過程更容易自動化，另一方面，其多態信息含量低，需要多個位點聯合才能達到個體識別的要求。目前，SNP分型技術在分子診斷、臨床檢驗、法醫學、病原檢測、遺傳疾病研究、指導個體化用藥和新藥研發等多方面具有極其重要應用價值，已成為眾多研究者們廣泛關注的焦點。因此，一種操作方便、成本低廉并且高通量的SNP檢測技術是當前基因檢測的關鍵所在。高通量測序，又稱“下一代”測序技術或深度測序，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志，使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能。因其通量高、樣本成本低、節省時間等優勢已在臨床上取得了相應的應用。目前，二代測序在腫瘤診斷、無創產前基因篩查、新生兒遺傳病篩選、心血管疾病等遺傳性疾病、法醫學方面的應用越來越普遍，且發展前景不可估量。相比較其他高通量的基因檢測技術，二代高通量測序技術更準確、靈敏、具有更高的通量。隨著價格的不斷降低，其應用于親子鑒定的前景十分廣闊，代表了未來的發展方向。技術實現要素：針對上述技術問題，本發明提供一種高通量測序檢測無創親子鑒定的方法，利用SNP標記高通量、易檢測的優點及高通量測序的通量高、節約時間等優勢，建立了一個可用于人類無創親子鑒定的多重PCR引物panel，該panel通過高通量測序的手段可以對400個SNP遺傳標記進行檢測，從而使得胎兒在無創傷性的條件下達到親緣關系的比較和親子鑒定的目的。本發明的技術方案如下：一種高通量測序檢測無創親子鑒定的方法，包括以下步驟：步驟a、提取基因組DNA，包括提取孕婦新鮮血液中的胎兒游離DNA、提取孕婦DNA、提取疑似父親的DNA；步驟b、多重PCR擴增，利用多重PCR引物panel進行多重PCR擴增，并純化擴增產物，采用含有多個SNP位點的擴增子試劑盒進行PCR擴增，分別對胎兒游離DNA、孕婦DNA、疑似父親的DNA進行富集；步驟c、文庫構建，即采用文庫構建試劑盒對純化好的多重PCR擴增產物進行文庫構建；步驟d、文庫質控，采用實時熒光定量PCR和Agilent2100對構建好的文庫進行質量控制，為上機測序做準備；步驟e、測序，采用二代測序儀，包括IonTorrent平臺或Illumina平臺的測序儀進行上機測序；步驟f、數據分析，采用軟件對上機測序結果進行生物信息學分析，進行親子鑒定判斷，并進行生物信息學數據分析，分析胎兒、孕婦和疑似父親的DNA的SNP位點，并進行比對，鑒定出是否具有親緣關系。優選地，所述擴增子試劑盒包含400個SNP位點。優選地，所述提取疑似父親的DNA包括提取抗凝血DNA、口腔上皮細胞DNA、帶毛囊的毛發中的DNA、精液中的DNA中的一種或幾種。本發明的有益效果是所述高通量測序檢測無創親子鑒定的方法經過高通量測序檢測SNP多態及親子推斷實驗驗證，其親子關系是顯著的，并且鑒定結果與實際親緣關系吻合；本發明提供了一組用于胎兒無創親子鑒定的多重PCR引物panel，該SNP標記的多重PCR引物panel可對400個SNP遺傳標記進行檢測，用于胎兒無常親子鑒定中，結果準確；利用高通量測序進行無創親子鑒定檢測，具有無創性、安全性、通量高、成本低等優點；并且相比于傳統的檢測方法，該發明方法可在孕婦懷孕的早期進行檢測，且無創傷性，可以給家庭和社會具有巨大的價值，還可以應用在法醫研究罪犯身份的鑒別或親子鑒定中。附圖說明圖1是本發明所述高通量測序檢測無創親子鑒定的方法的步驟流程圖。具體實施方式下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。如圖所示，本發明公開一種高通量測序檢測無創親子鑒定的方法，包括以下步驟：步驟a、提取基因組DNA，包括提取孕婦新鮮血液中的胎兒游離DNA、提取孕婦DNA、提取疑似父親的DNA；所述提取疑似父親的DNA包括提取抗凝血DNA、口腔上皮細胞DNA、帶毛囊的毛發中的DNA、精液中的DNA中的一種或幾種；步驟b、多重PCR擴增，利用多重PCR引物panel進行多重PCR擴增，并純化擴增產物，采用含有多個SNP位點的擴增子試劑盒進行PCR擴增，分別對胎兒游離DNA、孕婦DNA、疑似父親的DNA進行富集，所述擴增子試劑盒包含400個SNP位點，這些SNP位點的引物的核苷酸序列參見下文中表1所示；步驟c、文庫構建，即采用文庫構建試劑盒對純化好的多重PCR擴增產物進行文庫構建；步驟d、文庫質控，采用實時熒光定量PCR和Agilent2100對構建好的文庫進行質量控制，為上機測序做準備；步驟e、測序，采用二代測序儀，包括IonTorrent平臺或Illumina平臺的測序儀進行上機測序；步驟f、數據分析，采用軟件對上機測序結果進行生物信息學分析，進行親子鑒定判斷，并進行生物信息學數據分析，分析胎兒、孕婦和疑似父親的DNA的SNP位點，并進行比對，鑒定出是否具有親緣關系。本發明中的高通量測序檢測無創親子鑒定的方法經過高通量測序檢測SNP多態及親子推斷實驗驗證，其親子關系是顯著的，并且鑒定結果與實際親緣關系吻合；本發明提供了一組用于胎兒無創親子鑒定的多重PCR引物panel，該SNP標記的多重PCR引物panel可對400個SNP遺傳標記進行檢測，用于胎兒無常親子鑒定中，結果準確；利用高通量測序進行無創親子鑒定檢測，具有無創性、安全性、通量高、成本低等優點；并且相比于傳統的檢測方法，該發明方法可在孕婦懷孕的早期進行檢測，且無創傷性，可以給家庭和社會具有巨大的價值，還可以應用在法醫研究罪犯身份的鑒別或親子鑒定中。實施例一：一種高通量測序檢測無創親子鑒定的方法，包括以下步驟：步驟a、提取基因組DNA；(1)提取胎兒游離DNA1)取出600μl血漿樣品，常溫放置，待樣品融化后，立即加入10μl蛋白酶K，震蕩混勻，短暫離心；2)立即加入600μlGBMix，震蕩混勻，短暫離心；56℃水浴10分鐘后，取出樣品管，擦干管壁，室溫放置5分鐘，離心；把吸附柱和收集管套在一起，并根據樣本信息在管蓋上標記樣本編號；3)加入300μl的-20℃預冷的無水乙醇，輕柔顛倒混勻5～7次，靜置5分鐘，離心；4)轉移樣本溶液750μl至吸附柱管中，8000rpm離心30秒，棄濾液，將吸附柱放回收集管中；將剩余樣本溶液再轉至該吸附柱管中，8000rpm離心30秒，棄濾液，將吸附柱放回收集管中；轉管時須反復核對樣本編號，謹防樣本混淆；5)往吸附柱加入500μl緩沖液GD，8000rpm離心30秒，棄濾液，將吸附柱放回收集管中；6)往吸附柱加入500μl漂洗液PW，8000rpm離心30秒，棄濾液，將吸附柱放回收集管中；7)重復一次步驟6)；8)空吸附柱12000rpm離心2分鐘，將吸附柱轉至1.5mL低吸附離心管上，打開吸附柱蓋子，室溫自然晾干3分鐘；9)往吸附柱的硅膠膜正上方懸空加入43μl洗脫緩沖液TB，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，則為最終的DNA文庫，-20℃保存，備用。(2)提取孕婦DNA1)向血液中加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠；2)加人200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠；3)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；4)向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD，12,000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；5)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；6)重復操作步驟5；7)將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm離心2min，倒掉廢液；將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；8)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12,000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中；(3)提取疑似父親的DNA(干血斑樣品)1)取三片3×3mm的干血斑樣品到1.5ml的離心管(自備)中；2)加入200μl的緩沖液GA；3)加入20μlProteinaseK溶液，渦旋震蕩10sec混勻后，放入預熱至56℃的恒溫震蕩器中，900rpm恒溫震蕩1h；4)短暫離心，加入200μl的緩沖液GB，震蕩10sec充分混勻，將離心管放入預熱至70℃的恒溫震蕩器中，900rpm恒溫震蕩10min，孵育結束后簡短離心以去除管蓋內壁的液滴；5)加入100μl的無水乙醇，如果室溫超過25℃，請將無水乙醇置冰上預冷，輕輕顛倒混勻樣品，室溫放置5min，簡短離心以去除管蓋內壁的液滴；6)將上一步所得溶液都加到一個吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30sec，棄收集管廢液，將吸附柱CR2放回收集管中；7)向吸附柱CR2中加入500μl緩沖液GD，12,000rpm離心30sec，棄收集管廢液，將吸附柱CR2放回收集管中；8)向吸附柱CR2中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm離心30sec，棄收集管廢液，將吸附柱CR2放回收集管中；9)吸附柱CR2中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm離心30sec；棄收集管廢液；10)吸附柱CR2放回廢液收集管中，12,000rpm離心2min，倒掉廢液；將吸附柱CR2置于室溫放置2-5min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；11)吸附柱CR2轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12,000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。步驟b、多重PCR擴增(1)試劑從-20℃冰箱中拿至-4℃中解凍，備用；(2)多重PCR擴增的反應體系如下：組成成分體積(μl)PCRBuffer6.0dNTP0.6Primer6.7HotstarTaqPolymerase0.5模板DNA16.2Total30(3)反應程序：步驟c、文庫構建采用文庫構建的相關試劑盒對純化好的多重PCR擴增產物進行文庫構建。(1)末端修復、磷酸化并加dA尾1)在滅菌PCR管中配制如下反應：組成成分體積(μl)VAHTSTurboEndPrepEnzymeMix30VAHTSTurboEndPrepReactionBuffer(10×)6.5片段化DNA15ddH2O13.5Total652)使用移液器輕輕吹打混勻(請勿震蕩混勻)，并短暫離心將反應液收集至管底；3)將反應管置于PCR儀中，進行下述反應：20℃30min65℃30min4℃hold(2)接頭連接1)將下列組分直接添加至65μl末端修復產物中：組成成分體積(μl)VAHTSTurboT4DNALigase2.0VAHTSTurboLigationEnhancer30.5VAHTSAdapterforIllumina*2.5Total1002)使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應液收集至管底；3)將反應管置于PCR儀中，進行下述反應：20℃15min4℃hold(3)連接產物純化1)渦旋震蕩混勻AMPureXPbeads；2)吸取100μl(1×)AMPureXPbeads至100μl連接產物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻；3)室溫孵育5分鐘；4)將反應管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體；待溶液澄清后(大約5分鐘)，小心移除上清；5)保持EP管始終處于磁力架中，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠；室溫孵育30秒，小心移除上清；6)重復步驟5兩次，總計漂洗三次；7)保持EP管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠10分鐘；8)將EP管從磁力架中取出，加入28μl滅菌超純水進行DNA洗脫，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，將反應管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后(大約5分鐘)，小心吸取22μl上清至滅菌PCR管中；9)進行文庫擴增。(4)PCR擴增1)在滅菌PCR管中配制如下反應：組成成分體積(μl)連接反應純化產物22VAHTSSuper-Fidelity2×PCRBuffer25VAHTSUniversalPCRPrimerforIllumina*1VAHTSIndexPrimerforIllumina*1VAHTSSuper-FidelityDNAPolymerase1Total502)使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應液收集至管底；3)將反應管置于PCR儀中，進行下述反應：(5)PCR擴增產物純化1)渦旋震蕩混勻AMPureXPbeads；2)吸取50μl(1×)AMPureXPbeads至PCR產物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻；3)室溫孵育5分鐘；4)將反應管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后，小心移除上清；5)保持EP管始終處于磁力架中，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30秒，小心移除上清；6)重復步驟5兩次，總計漂洗三次；7)保持EP管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠10分鐘；8)將EP管從磁力架中取出，加入30μl滅菌超純水進行DNA洗脫，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，將反應管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后(大約5分鐘)，小心吸取25μl上清至滅菌PCR管中；9)將制備好的DNA文庫置于-20℃保存；步驟d、文庫質控采用實時熒光定量PCR和Agilent2100對構建好的文庫進行質量控制，為上機測序做準備；步驟e、測序采用二代測序儀，包括IonTorrent平臺或Illumina平臺的測序儀進行上機測序；步驟f、數據分析采用軟件對上機測序結果進行生物信息學分析，進行親子鑒定判斷，并進行生物信息學數據分析，分析胎兒、孕婦和疑似父親的DNA的SNP位點，并進行比對，鑒定出是否具有親緣關系。表1、400個SNP位點的引物的核苷酸序列盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。當前第1頁1 2 3