本發明涉及水產食品加工技術領域，具體地涉及一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽及其制備方法。
背景技術：
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖濃度以及改善其癥狀的生物活性成分。目前研究較多的天然產物類降糖因子、礦物質類降糖因子、維生素類降糖因子，其作用機理各不相同。天然產物類降糖因子按化學結構可分為黃酮類、活性多糖類、生物堿類、皂甙類、萜類、共軛亞油酸、多肽類等。自人工合成胰島素以來，磺脲類藥物、雙胍類、胰島素增敏劑、糖抑制劑等各種口服或注射的藥物相繼問世，然而化學藥物常產生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用溫和而持久，性質穩定，幾乎無毒性反應，還可多種降糖成分并存，綜合起作用等優點，備受患者以及和醫學界的青睞，也成為了降血糖功能因子的主要研究方向。
目前國內外專利中未見利用魚鰾資源制備二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV：DPP-IV)抑制肽的專利文獻報道。本發明針對目前魚類加工產業的快速發展，魚鰾蛋白資源數量的快速增加，根據魚鰾蛋白的特性，以魚鰾為原料，通過對魚鰾高溫高壓和超聲波等預處理，利用多種蛋白酶分步酶解技術，通過膜分離、凝膠分離及高效液相色譜分離技術，開發了同時具有特定降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽，建立一套高效的多功能魚鰾蛋白肽的制備方法。
技術實現要素：
本發明的目的是在于提供一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽。
本發明的另一目的在于提供上述魚鰾蛋白肽的制備方法。
本發明的再一個目的在于提供上述魚鰾蛋白肽的應用。
為了實現上述技術目的，本發明提供了一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法，包括以下步驟:
(1)超聲處理去脂的魚鰾漿液；
(2)加入復合蛋白酶進行二步法酶解；
(3)對酶解液高溫下保溫后冷卻至室溫，離心并取上清液通過二步超濾法處理；
(4)濾液過柱層析分離，收集洗脫峰，即得。
上述制備方法中，步驟(1)的魚鰾清洗后先經高溫處理，再制備魚鰾漿液。所述高溫處理為本領域公知的處理方式，例如可以采用110-121℃下20-40min。
步驟(1)超聲處理方法為將去脂的魚鰾漿液溫度調至65-75℃，30-40kH的超聲頻率處理15-25min。
本發明的實施例中，具體操作為選用冷凍魚鰾，在2-8℃條件下進行解凍清洗，取魚鰾，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚鰾清洗后在110-121℃的條件下保溫20-40分鐘，然后在魚鰾中加入2.0～4.0倍的水，用打漿機將魚鰾打成漿，通過6000～8000g離心10～15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
本發明提供的具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法中，步驟(2)二步法酶解中，第一步酶解加入的復合蛋白酶為堿性蛋白酶和動物蛋白酶，二者質量比為1-2:1，且加入的復合蛋白酶質量為魚鰾質量的0.2％-0.3％；
第一步酶解條件為50-55℃，pH值7.0-8.0，酶解0.5-1.5h。
其中，步驟(2)二步法酶解中，第二步酶解加入的復合蛋白酶為中性蛋白酶和風味蛋白酶，二者質量比為1-2:1，且加入的復合蛋白酶質量為魚鰾質量的0.1％-0.3％；
第二步酶解條件為50-60℃，pH值7.0-8.0，酶解1.0-2.0h。
上述制備方法中，步驟(3)的高溫下保溫是指于90-95℃下保溫3-5min；
步驟(3)的離心是指3000-4000g條件下離心10-15min。
步驟(3)的兩步超濾法為先用孔徑為6000D的膜超濾上清液，得到分子量小于6000D的濾液，再對該濾液用孔徑為3000D的膜超濾，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
步驟(4)的具體操作是：取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第1個洗脫峰,再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液。
本發明提供的制備方法中，還包括步驟(5)將步驟(4)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對制得的魚鰾蛋白肽的主要成分進行測定，其氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為40％～60％。
上述制備方法制備得到的魚鰾蛋白肽屬于本發明的保護范圍。本發明通過實驗發現，本發明上述方法制備得到的魚鰾蛋白肽具有優異的降血糖和抗氧化功能。
進而，本發明提供了該魚鰾蛋白肽在制備降血糖或抗氧化藥物中的應用。含有本發明方法制得的魚鰾蛋白肽的食品、保健品或藥物也屬于本發明的保護范圍。
本發明的優點在于：
(1)本發明方法所用原料易得，成本低，可控性強，適于產業化生產。
(2)本發明首先對魚鰾先進行高溫(110-121℃)處理，結合特定頻率超聲波技術處理的魚鰾蛋白漿，可以明顯改善魚鰾蛋白的結構，提高魚鰾蛋白的酶敏感性和產品的得率。
(3)本發明制得的魚鰾蛋白肽具有較好的DPP-Ⅳ抑制的功能，其IC50值小于0.6mg/mL，同時具有較好的抗氧化功能，在1mg/mL的條件下，其清除DPPH自由基能力達到88％以上，還原力達到0.88以上。
(4)本發明制備的魚鰾蛋白肽安全無污染，采用多種食品級復合蛋白酶(堿性蛋白酶、動物蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶)，經在溫和條件下，經過適度酶解獲得特定分子量的魚鰾蛋白肽，不加任何添加劑，為100％魚鰾蛋白肽。
(5)本發明開發魚鰾蛋白肽中具有特定功能的三種肽(Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu)的比例為40％以上。本發明開發魚鰾蛋白肽中分子量小于2000的肽的比例為95％以上易于機體消化和吸收。
(6)本發明方法制得的魚鰾蛋白肽，能廣泛應用于特需食品和營養食品的制造。
具體實施方式
除非另有定義，下文中所使用的所有專業術語與本領域技術人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業術語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發明的保護范圍。
除有特別說明，本發明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場上購買的商品或者可以通過公知的方法制得的產品。
實施例1具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍魚鰾100克，在4℃條件下進行解凍，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚鰾清洗后在121℃的條件下保溫20分鐘，然后在魚鰾中加入2.0倍的水，用打漿機將魚鰾打成漿，通過6000g離心10～15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
(2)將去脂魚鰾漿液的溫度調整到65℃，于超聲波發生器中經超聲波(頻率為40kH)處理15分鐘。
(3)按照魚鰾重量0.4％的重量百分比比例向經過超聲波處理的魚鰾漿液體中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步利用0.2％的復合蛋白酶(堿性蛋白酶和動物蛋白酶組成，它們之間的質量比為2：1)，在50℃，pH為7.5(用1mol/L的NaOH或HCl來調節)的條件下進行酶解反應1.5h；然后利用0.2％復合蛋白酶(中性蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為2：1)，在55℃、pH為7.0(用1mol/L的NaOH或HCl來調節)條件下進行酶解反應2.0h；在95℃下保溫5分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心10min鐘，收集上清液；
(4)將步驟(3)所得的上清液利用孔徑為6000道爾頓的陶瓷膜將分子量小于6000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量把小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，經過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第1個洗脫峰,用RP-HPLC反相高效液相色譜進行分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)將步驟(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對魚鰾蛋白肽的主要成分進行測定，本實施例制得的魚鰾蛋白肽中氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為42％。
實施例2具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍魚鰾10克，在6℃條件下進行解凍，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗，魚鰾清洗后在110℃的條件下保溫40分鐘，然后在魚鰾中加入3.0倍的水，用打漿機將魚鰾打成漿，通過6000g離心15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
(2)將去脂魚鰾漿液的溫度調整到70℃，于超聲波發生器中經超聲波(頻率為40kH)處理25分鐘。
(3)按照魚鰾重量0.5％的重量百分比比例向經過超聲波處理的魚鰾漿液體中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步利用0.2％的復合蛋白酶(堿性蛋白酶和動物蛋白酶組成，它們之間的質量比為2：1)，在55℃，pH為7.5(用1mol/L的NaOH或HCl來調節)的條件下進行酶解反應1.0h；然后利用0.3％復合蛋白酶(中性蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為2：1)，在55℃、pH為7.5(用1mol/L的NaOH或HCl來調節)條件下進行酶解反應2.0h；在95℃下保溫5分鐘，冷卻至室溫，在3500g條件下離15min，收集上清液；
(4)將步驟(3)所得的上清液利用孔徑為6000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于6000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第1個洗脫峰,再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)將步驟(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對魚鰾蛋白肽的主要成分進行測定，本實施例制得的魚鰾蛋白肽中其氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為43％。
實施例3具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍魚鰾1000克，在8℃條件下進行解凍清洗，取魚鰾，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚鰾清洗后在121℃的條件下保溫25分鐘，然后在魚鰾中加入3.0倍的水，用打漿機將魚鰾打成漿，通過6000g離心15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
(2)將去脂魚鰾漿液的溫度調整到70℃，于超聲波發生器中經超聲波(頻率為40kH)處理15分鐘。
(3)按照魚鰾重量0.4％的重量百分比比例向經過超聲波處理的魚鰾漿液體中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步利用0.2％的復合蛋白酶(堿性蛋白酶和動物蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1)，在55℃，pH為8(用1mol/L的NaOH或HCl來調節)的條件下進行酶解反應1.5h；然后利用0.2％復合蛋白酶(中性蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1)，在60℃、pH為7.0(用1mol/L的NaOH或HCl來調節)條件下進行酶解反應2.0h；在95℃下保溫5分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心12min，收集上清液；
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進行處理，利用孔徑為6000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于6000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，收集第1個洗脫峰,再用RP-HPLC反相高效液相色譜進行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)將步驟(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對魚鰾蛋白肽的主要成分進行測定，本實施例制得的魚鰾蛋白肽中氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為43％。
實施例4魚鰾蛋白肽DPP-Ⅳ抑制能力的測定試驗
試驗樣品：實施例1、實施例2、實施例3制備的魚鰾蛋白肽及合成的肽DPP-Ⅳ抑制能力按照如下方法進行：
將樣品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)緩沖液稀釋至合適的濃度，吸取25μL樣品稀釋液與25μL底物(濃度為1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶標板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力為8U/L)，混勻后在37℃下精確孵育60min，立即加入100μL 1mol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 4.0)緩沖液終止反應，于405nm下測吸光值A，并根據下列公式計算樣品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A樣品-A樣品空白對照)/(A陰性對照-A陰性空白對照)}×100
A樣品：為樣品反應液在405nm處的吸光值A；
A樣品空白對照：以Tris-HCL緩沖液代替DPP-IV酶液作為樣品空白對照的吸光值A；
A陰性對照：以Tris-HCL緩沖液代替樣品作為陰性對照的吸光值；
A陰性空白對照：以Tris-HCL緩沖液代替DPP-IV酶液和樣品作為陰性空白對照的吸光值
DPP-IV抑制的IC50值測定：
測定樣品在不同濃度下的DPP-IV抑制率，以多肽濃度的對數值與抑制率做回歸曲線，得到回歸方程，由回歸方程計算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制是肽的濃度。結果見表1。
實施例5本發明魚鰾蛋白抗氧化活性的測定試驗
試驗樣品：實施例1、實施例2、實施例3制備的魚鰾蛋白肽。
按照如下方法進行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的魚鰾蛋白肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH自由基能力越強。空白對照即是將樣品溶液1.5mL換成去離子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)還原力測定：取1mg/mL的魚鰾蛋白肽1mL，加入0.2M磷酸緩沖液(pH 6.6)2.5mL和1％(質量分數)的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻，然后在50℃水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質量分數)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5mL，加入去離子水2.5mL和1％(質量分數)三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，在室溫下反應10min，用700nm波長測定吸光度。還原力即可用700nm波長處吸光值表示。
結果(見表1)本發明魚鰾蛋白肽具有很好的DPP-IV抑制能力，DPP-IV抑制活性(IC50值)低于0.60mg/mL，顯著低于同類復合蛋白肽的IC50值，具有很好的DPP-IV抑制能力。同時本發明的魚鰾蛋白肽具有較好的抗氧化能力，在1mg/mL的條件下，其清除DPPH自由基能力達到88％以上，還原力達到0.88以上，也是一種較好的抗氧化肽。
表1本發明魚鰾蛋白肽的DPP-IV抑制和抗氧化活性試驗結果
注：合成肽1的氨基酸序列Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His
合成肽2的氨基酸序列Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His
合成肽3的氨基酸序列Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu
以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
序列表
<110> 中國農業大學
<120> 一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽及其制備方法
<130> KHP161116973.3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 魚
<400> 1
Trp Gly Asp Glu His Ile Pro Gly Ser Pro Tyr His
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 魚
<400> 2
Ile Ala Gln Pro Gln Glu Lys Ala Pro Asp Pro Phe Arg His
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 魚
<400> 3
Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
1 5