本發明涉及水產食品加工技術領域，具體地涉及一種具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚蛋白肽及其制備方法。
背景技術：
高血壓是對人類健康危害極大的一種疾病，潛伏期長。高血壓的早期階段，一般沒有明顯不適癥，直至發生臨床跡象心臟病發作、腦血管破裂而導致死亡。
血管緊張素轉化酶(Angiotensin I converting enzyme，ACE)為腎素-血管緊張素系統的關鍵酶。血管緊張素原在腎素的作用下轉化為血管緊張素I，血管緊張素I在ACE的作用下轉化為血管緊張素II，刺激血管收縮，造成血壓上升。抑制ACE的活性對降低血壓有著積極的作用，因而開發有效的ACE抑制劑引起人們的極大關注。雖然來源于食物的ACE抑制肽比人工合成的ACE抑制劑作用弱，但是它有其獨特的優點，不會產生降壓過度的問題，安全性高，無副作用，除降壓功能外，往往同時具有免疫促進、易消化吸收等功能。由于藥物療法存在副作用，天然食物中的降血壓功能因子的開發利用將成為今后高血壓非藥物治療的重要部分。
現有技術中關于ACE抑制肽開發的報道，主要是通過酶解的方法從水產動物體或牛乳乳清蛋白源獲得ACE抑制肽，酶解過程通常都需要通過添加酸或堿來調節體系的pH值，這無疑影響了獲得的ACE抑制肽產品的功能特性，且增加了操作的繁瑣程度；還有的ACE抑制肽的制備方法在酶解后還有脫苦脫味的步驟，以改善水產動物的腥味等不適口的味道，這些方法均不同程度地增加了操作步驟和生產成本，制約了產業化規模化ACE抑制肽的生產及蛋白肽的得率。另一方面，現有技術從水生生物中獲得的具有ACE抑制功能的肽往往僅具有ACE抑制功能，未發現有其他的生物活性功能，即產品性能單一。
目前國內外專利中未見利用甲魚肉資源制備血管緊張素轉化酶抑制肽的專利文獻報道。本發明針對目前甲魚蛋白產品開發的現狀，利用甲魚肉為原料，通過對甲魚肉的超聲波等預處理，在不添加任何酸和堿條件下，利用多種蛋白酶復合酶解，通過膜分離和凝膠分離技術，開發了同時具有特定降壓和抗氧化功能的甲魚蛋白肽，建立一套簡單高效的多功能的甲魚蛋白肽的制備方法。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明的目的是在于提供一種具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚蛋白肽。
本發明的另一目的在于提供上述甲魚蛋白肽的制備方法。
本發明的再一個目的在于提供上述甲魚蛋白肽的應用。
為了實現上述技術目的，本發明提供了一種具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚蛋白肽及其制備方法，包括以下步驟:
(1)超聲處理去脂的甲魚肉漿液；
(2)加入復合蛋白酶進行二步法酶解，酶解過程無需添加酸或堿調節pH值；
(3)對酶解液離心并取上清液通過二步超濾法處理；
(4)濾液過柱層析分離，收集洗脫峰，即得。
步驟(1)所述的甲魚肉漿液通過以下方式獲得：新鮮甲魚放血宰殺，取甲魚肉，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚肉清洗后在95℃水中保溫5-10分鐘，然后在甲魚肉中加入2.0～4.0倍的水，用打漿機將甲魚肉打成漿，通過6000～8000g離心10～15min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
其中，步驟(1)超聲處理方法為將去脂的甲魚肉漿液溫度調至55-65℃，25-30kH的超聲頻率處理15-25min。
本發明通過大量實驗發現，甲魚肉漿液溫度調至55-65℃進行超聲處理，效果最好，能夠較好地改變甲魚肉蛋白的組織結構，使下面酶解步驟縮短酶解時間和較少的用酶量，就能夠獲得優質的蛋白肽。
在上述方法的步驟(2)二步法酶解中，第一步酶解加入的復合蛋白酶為堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶，二者質量比為1-2:1，且加入的復合蛋白酶質量為甲魚肉質量的0.1％-0.3％。
優選地，第一步酶解條件為55-65℃酶解1-2h。
在上述方法的步驟(2)二步法酶解中，第二步酶解加入的復合蛋白酶為木瓜蛋白酶和風味蛋白酶，二者質量比為1:1-2，且加入的復合蛋白酶質量為甲魚肉質量的0.1％-0.3％。
優選地，第二步酶解條件為50-60℃酶解1-2h。
第二步酶解結束之后于90-95℃下保溫3-5min，冷卻至室溫。
上述方法中，步驟(3)的兩步超濾法為先用孔徑大于5000D的膜超濾，再用孔徑為3000D的膜超濾，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
在本發明的實施例中，兩步超濾法為利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
本發明甲魚蛋白肽的制備方法步驟(4)，是取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經過凝膠分離，收集洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的具有較好血管緊張素轉化酶(ACE)抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽。
在本發明的實施例中，是取分子量為小于3000的蛋白肽液，經過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為1.8-2.8mL/min，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000具有較好血管緊張素轉化酶(ACE)抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽。
上述制備方法制備得到的甲魚蛋白肽屬于本發明的保護范圍。本發明通過實驗發現，本發明上述方法制備得到的甲魚蛋白肽具有優異的ACE抑制和抗氧化功能。
進而，本發明提供了該甲魚蛋白肽在制備降血壓或抗氧化藥物中的應用。含有本發明方法制得的甲魚蛋白肽的食品、保健品或藥物也屬于本發明的保護范圍。
本發明的優點在于：
(1)本發明開發的甲魚肉蛋白肽制備方法簡單，整個加工過程中沒有添加酸或堿進行pH的調整，產品保持較好的功能特性，較易實現產業化生產。
(2)開發的蛋白肽具有較好的血管緊張素轉化酶(ACE)活性抑制的功能，其IC 50值為小于0.4mg/mL，1.2mg/mL樣品濃度的ACE抑制率達到90％以上，同時具有較好的抗氧化功能。能廣泛應用于特需食品和營養食品的制造。
(3)本發明利用特定頻率超聲波技術處理一定溫度(55-65℃)的甲魚肉蛋白漿，可以明顯改善甲魚肉蛋白的結構，縮短酶解時間，提高甲魚肉蛋白肽的功能和產品的得率。
(4)本發明方法制備得到的甲魚蛋白肽食用安全，本發明采用多種食品級復合蛋白酶(堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶)，經在溫和條件下，經過適度酶解獲得特定分子量的甲魚肉蛋白肽，不加任何添加劑，為100％甲魚肉蛋白肽，產品具有良好的風味，較高的得率。
(5)本發明開發甲魚蛋白肽中分子量小于1000D的肽的比例為90％以上，易于機體消化和吸收。
具體實施方式
除非另有定義，下文中所使用的所有專業術語與本領域技術人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業術語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發明的保護范圍。
除有特別說明，本發明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場上購買的商品或者可以通過公知的方法制得的產品。
實施例1具有ACE抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽的制備方法
(1)取甲魚肉100克，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗，魚肉清洗后在95℃水中保溫10分鐘，然后在甲魚肉中加入2.0倍的水200克，用打漿機將甲魚肉打成漿，通過6000g離心10min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
(2)將去脂甲魚肉漿液的溫度調整到55℃，于超聲波發生器中經超聲波頻率為30kH處理15分鐘，改變甲魚肉蛋白的組織結構。
(3)按照甲魚肉重量0.3％的重量百分比比例向經過超聲波處理的甲魚肉漿液體中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步加復合蛋白酶一(堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1)0.2％，在60℃條件下進行酶解2h；然后進行第二步利用復合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：2)0.1％，在55℃條件下進行酶解反應1.5h；在95℃下保溫3分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心15min，收集上清液。
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先取將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白液，再經過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為2.0mL/min，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的甲魚肉蛋白肽。
實施例2具有血管緊張素轉化酶抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽的制備方法
(1)取甲魚肉500克，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚肉清洗后在90℃水中保溫8分鐘，然后在甲魚肉中加入3.0倍的水，用打漿機將甲魚肉打成漿，通過7000g離心10min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
(2)將去脂甲魚肉漿液的溫度調整到60℃，于超聲波發生器中經超聲波(頻率為25kH)處理25分鐘，改變甲魚肉蛋白的組織結構。
(3)按照甲魚肉重量0.2％的重量百分比比例向經過超聲波處理的甲魚肉漿液體中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步添加蛋白酶一(堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1)0.1％，在65℃條件下進行酶解反應2h；然后進行第二步添加復合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1)0.1％，在60℃條件下進行酶解反應2h；在90℃下保溫3～5分鐘，冷卻至室溫，在3500g條件下離心15min，收集上清液。
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先取將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白液，再經過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為2.0mL/min，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的甲魚肉蛋白肽。
實施例3具有血管緊張素轉化酶抑制和抗氧化功能的甲魚肉蛋白肽的制備方法
(1)取甲魚肉1000克，用符合飲用水衛生標準的清潔水清洗,魚肉清洗后在95℃水中保溫10分鐘，然后在甲魚肉中加入2.5倍的水2500克，用打漿機將甲魚肉打成漿，通過7000g離心12min，去上層脂肪，得到去脂的甲魚魚肉漿液。
(2)將去脂甲魚肉漿液的溫度調整到65℃，于超聲波發生器中經超聲波頻率為30kH處理15分鐘，改變甲魚肉蛋白的組織結構。
(3)按照甲魚肉重量0.4％的重量百分比比例向經過超聲波處理的甲魚肉漿液體中加入復合蛋白酶進行分步酶解，第一步加復合蛋白酶一(堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶組成，它們之間的質量比為2：1)0.2％，在60℃條件下進行酶解1.5h；然后第二步加入甲魚肉重量0.2％復合蛋白酶二(木瓜蛋白酶和風味蛋白酶組成，它們之間的質量比為1：1)，在55℃條件下進行酶解反應1.5h；在92℃下保溫3分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心13min，收集上清液。
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先取將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白液，再經過Sephadex G-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，流速為2.5mL/min，洗脫峰在280nm下進行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到分子量為小于3000D的甲魚肉蛋白肽。
實施例4甲魚肉蛋白肽血管緊張素轉化酶(ACE)抑制能力的測定試驗
試驗樣品：實施例1、實施例2、實施例3制備的甲魚肉蛋白肽ACE抑制能力按照如下方法進行：
ACE抑制率的方法。用高效液相色譜可以在228nm下定量檢測釋放出的Hip量，從而計算出多肽的ACE抑制率。
1)試劑的配置
pH8.3的磷酸鹽緩沖溶液：用超純水配制，其中含磷酸鹽50mmol/L，NaCl 300mmol/L，調整pH到8.3；
ACE酶液：將2mL的磷酸鹽緩沖液加入1U的ACE中，使其濃度變為0.5U/mL。
HHL溶液：使用磷酸緩沖液溶解HHL，使其終濃度為5mmol/L。
樣品溶液：稱取適量樣品，用磷酸鹽緩沖液所需濃度的溶液。
2)ACE抑制率測定的色譜條件
檢測波長：228nm；流速:1mL/min；流動相A:超純水(含0.1％三氟乙酸)，流動相B:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；進樣量:10μL，手動進樣；
3)測定ACE抑制活性的方法
取120μL HHL底物溶液，加入20μL的樣品混合均勻，在37℃恒溫水浴中保溫10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒溫水浴中反應30min，再加入150μL 1mol/L的HCl終止反應，得到反應液。該反應液利用HPLC進行分析，同時設置空白對照組。ACE抑制活性計算公式如下：
ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100,
式中，M為對照組中馬尿酸的峰面積，N為添加的樣品組中馬尿酸的峰面積。
4)半抑制濃度的測定
按照ACE抑制肽體外檢測方法測定其抑制活性，以濃度為橫坐標，ACE抑制率為縱坐標繪成圓滑的曲線，從曲線中計算出IC50值。結果見表1。
實施例5本發明甲魚肉蛋白抗氧化活性的測定試驗
試驗樣品：實施例1、實施例2、實施例3制備的甲魚肉蛋白抗氧化活性肽。
按照如下方法進行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH自由基能力越強。空白對照即是將樣品溶液1.5mL換成去離子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100。結果見表1。
(2)還原力測定：取1mg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸緩沖液(pH 6.6)2.5mL和1％(質量分數)的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻，然后在50℃水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質量分數)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5mL，加入去離子水2.5mL和1％(質量分數)三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，在室溫下反應10min，用700nm波長測定吸光度。還原力即可用700nm波長處吸光值表示。結果見表1。
(3)氧化自由基吸收能力(ORAC)：不同濃度的抗氧化活性肽溶液20μL與75mM磷酸鹽緩沖液80μL(pH 7.4)及200nM的熒光試劑50μL充分混合，然后在37℃溫育15min，再加入80mM的AAPH溶液50μL。用酶標儀每分鐘讀取熒光值共進行100min。熒光的激發波長和發射波長分別是485nm和538nm。用磷酸緩沖溶液代替樣品作為空白。以Trolox作為標準對照，使用的濃度為0，2，4，8，12，16μM，繪制熒光淬滅曲線，并計算熒光淬滅曲線下的積分面積(AUC)。AUC的計算公式如下：
其中：f0是0min時熒光值，fi是第i min時的熒光值。
ORAC值用樣品曲線的斜率與Trolox曲線的斜率之比，ORAC值得單位表示為μM Trolox/mg肽。
表1本發明三個實施例制得的甲魚蛋白肽的分子量及血管緊張素轉化酶(ACE)抑制和抗氧化活性試驗結果
結果(見表1)本發明甲魚蛋白肽具有很好的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制能力ACE抑制活性(IC50值)低于0.35mg/mL，顯著低于同類復合蛋白肽的IC50值，1.2mg/mL樣品ACE抑制率達到90％以上，具有很好的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制能力。同時發明甲魚蛋白肽具有具有較好的抗氧化能力，在1mgg/mL的條件下，其清除DPPH自由基能力達到89％以上，還原力達到0.87以上，其ORAC為16以上，也是一種較好的抗氧化肽。
以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。