一種皮膚來源的成纖維細胞的培養方法與流程

本發明涉及細胞分離培養技術領域，特別涉及成纖維細胞的分離培養方法。

背景技術：

醫療技術的發展及人們生活水平的提高，使人類平均壽命得到有效延長的同時，也使延緩衰老漸漸進入人類視野。而皮膚作為人體最大的器官，其結構完整、美觀不僅影響著心情，也體現其生活質量的高低。因此，越來越多的愛美人士渴望通過醫療技術干預皮膚老化。然而，目前市場主流的抗衰老產品多以化學藥物或激光療法為主，其短期效果明顯，但長期效果及安全性卻一直備受質疑。自體細胞回輸技術，其采用體外培養自體成纖維細胞達一定數目及活性后，將其回輸入人體執行特定皮膚部位老化細胞的功能，從而對延緩皮膚衰老起到促進作用，具有更高的安全性及有效性。然而，如何快速獲得活性細胞在一定程度上制約了自體細胞回輸技術的臨床應用。

衰老是人類生命歷程中不可缺少的環節，且往往從一個細胞群的老化為起點。而成纖維細胞作為是皮膚中重要的細胞之一，其不僅能合成及分泌膠原蛋白來維持皮膚彈性及韌性，同時也可在皮膚受到損傷時，參與組織修復。而目前研究證實，成纖維細胞活性減弱，膠原蛋白分泌量減少是皺紋產生的重要因素。目前抗皺化妝品種多含有人表皮神經生長因子，堿性成纖維細胞生長因子等，這類生長因子也主要作用于成纖維細胞。此外，針對皮膚性疾病或燒傷等意外引起的皮膚缺損，單靠自體皮膚移植已不能滿足臨床應用需求，若能在短時間內，通過體外培育出大量的人表皮成纖維細胞或將為臨床應用提供新的思路。由此可見，表皮成纖維細胞的培養具有極高的臨床應用價值。

生長因子(Growth factor)存在于體內并對機體細胞的生長發育具有調節作用的一類細胞因子，在體內含量極微，但是生物活性極高。然而隨著年齡的增長，皮膚生長因子自身分泌不斷下降，作用減弱，因此外源生長因子的導入來賦予細胞新的活力成為了生物美容的新熱點和突破口。其中人表皮細胞生長因子(human epidermal growth factor,EGF)能夠啟動與細胞分裂有關的基因，促使細胞進行有絲分裂，有效的促進和調節皮膚細胞的生長和增殖。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)可刺激多種細胞進行有絲分裂、增殖和遷移，在皮膚和創面修復中有重要作用。

此外EGF和bFGF具有多種生物活性，改善細胞生長的微環境，促進羥脯氨酸的合成，促使膠原和彈性纖維合成，分泌膠原物質、透明質酸和糖蛋白，從而使肌膚富有彈性，更加嫩滑有光澤，并減少皺紋的產生，延緩皮膚衰老。

以往研究中多采用包皮組織作為實驗用皮膚，雖其具有取材方便的優點，但皮膚來源均為男性，在實際應用中并不能廣泛代表所有人群皮樣特點。采用植塊法，不僅操作步驟繁瑣如及時翻轉細胞培養瓶等，且細胞需培養14天以上才可順利進行傳代，且遠離組織塊處細胞已明顯變大、老化，使得獲得細胞質量及數量均不如酶消化法。而鑒于大多數人群的耳后皮膚在實際生活中均較少受到摩擦，皮膚細胞更替慢，其個體間差異較小，從而能更具有廣泛性結果。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種成纖維細胞的培養方法，該方法用兩步酶消化法從耳后皮膚中獲得的成纖維細胞，采用DMEM和F12完全培養基并加入EGF、bFGF細胞生長因子，有助于成纖維細胞的增殖、膠原蛋白的分泌及延緩衰老。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種皮膚來源的成纖維細胞的分離培養方法，包括如下步驟：

1)采用兩步酶消化法從人皮膚組織獲得成纖維細胞；

2)用DMEM和F12培養基并添加細胞生長因子EGF和/或bFGF培養成纖維細胞，DMEM培養基與F12培養基的比例為1:1。

優選地，步驟1)中的酶消化法采用0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA消化人皮膚組織，再加入1mg/ml II型膠原蛋白酶。

更優選地，步驟1)為無菌條件下取人皮膚組織，去掉皮下組織及血管，按體積質量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA，4℃過夜處理。第二日取出皮膚，去掉表皮，按體積質量比10:1加入1mg/ml II型膠原蛋白酶，37℃，2h處理，將上述混懸液過200目篩網，吹打濾過液，進行離心。

優選地，步驟1)中的人皮膚組織為人耳后皮膚。

優選地，步驟2)中的細胞生長因子的濃度為：EGF活力單位為75U/ml，bFGF活力單位為100U/ml。

優選地，步驟2)中成纖維細胞在37℃、5％CO₂培養24h。

本發明還提供了一種成纖維細胞的分離培養方法，包括如下步驟：

1)無菌條件下取人耳后皮膚，去掉皮下組織及血管，按體積質量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA，4℃過夜處理。第二日取出皮膚，去掉表皮，按體積質量比10:1加入1mg/ml II型膠原蛋白酶，37℃，2h處理，將上述混懸液過200目篩網，吹打濾過液，進行離心；

2)將上述成纖維細胞加入比例為1:1的DMEM培養基和F12培養基中，37℃、5％CO₂培養24h，棄去培養液，并添加細胞生長因子活力單位為75U/ml的EGF和/或100U/ml的bFGF，繼續37℃、5％CO₂培養24h，獲得培養的成纖維細胞。

本發明對耳后皮膚中成纖維細胞進行提取，傳代，研究不同培養基并在之中添加生長因子對成纖維細胞細胞增殖、膠原分泌以及細胞傳代中的穩定性進行分析，本發明特以人耳后皮膚作為實驗用組織。另外，本發明采用酶消化法替代植塊法。對于0.5cm*0.5cm皮膚塊，經酶消化后24小時即可見成纖維細胞貼壁，消化后72-96小時可見大量成纖維細胞貼壁，不僅保證細胞數目及細胞正常形態，同時減少細胞增殖次數，縮短實驗周期。此外，針對酶消化法中的殘留的表皮細胞，表皮細胞較成纖維細胞更加耐受胰酶，但貼壁速度慢，因此采用快速酶消化，早期替換培養液的方法可獲得高純度的成纖維細胞。

采用兩步酶消化法從健康人耳后皮膚中獲得成纖維細胞，依據培養基種類不同分為A組(FM無血清培養基)、B組(DMEM+10％FBS)、C組(RPMI-1640+10％FBS)、D組(DMEM/F12(1:1)+10％FBS)，并將細胞生長因子(EGF、bFGF)加入到培養基中，采用MTT法、細胞劃痕實驗、酶聯免疫吸附實驗、β-半乳糖苷酶試驗、軟瓊脂克隆形成試驗比較不同培養基和細胞因子對細胞增殖、遷移、膠原分泌、老化、變異的影響。

本發明的有益效果是：

用DMEM/F12(1:1)培養基可有效促進成纖維細胞的增殖，保持成纖維細胞原有細胞形態，提高細胞前期膠原蛋白表達，EGF和bFGF能促進了成纖維細胞的增殖和膠原蛋白分泌的增加。

附圖說明

圖1表示細胞原代培養中，B、D組在培養72h后的示意圖，B組為DMEM+10％FBS，D組為DMEM/F12(1:1)+10％FBS。

圖2表示細胞原代培養中，B、D組通過3次傳代后的示意圖，B組為DMEM+10％FBS，D組為DMEM/F12(1:1)+10％FBS。

圖3表示MTT實驗，A、B、C、D組細胞增殖曲線，A組為FM無血清培養基，B組為DMEM+10％FBS，C組為RPMI-1640+10％FBS,D組為DMEM/F12(1:1)+10％FBS。

圖4細胞遷移實驗，A組為FM無血清培養基，B組為DMEM+10％FBS，C組為RPMI-1640+10％FBS,D組為DMEM/F12(1:1)+10％FBS。

圖5細胞衰老實驗，A組為FM無血清培養基，B組為DMEM+10％FBS，C組為RPMI-1640+10％FBS,D組為DMEM/F12(1:1)+10％FBS。

圖6表示D組成纖維細胞在體外培養30代后，接種在軟瓊脂上培養15天，以A549肺癌細胞為陽性對照品，圖6A為皮膚成纖維細胞，圖6B為A549肺癌細胞，D組為DMEM/F12(1:1)+10％FBS。

圖7表示EGF和bFGF對成纖維細胞增殖的影響。

圖8表示EGF和bFGF對成纖維細胞膠原蛋白分泌的影響。

具體實施方式

1材料和方法

1.1材料

正常耳后皮膚組織由深圳市君焯醫療美容整形研究所提供，采用無菌手術采集耳后1平方厘米的表皮。

A549肺癌細胞由深圳市大規模細胞培養技術和細胞資源庫公共技術服務平臺提供。

0.25％胰蛋白酶，II型膠原蛋白酶、人膠原蛋白酶I型酶聯免疫分析試劑盒購自sigma公司；

MTT試劑盒、β-半乳糖苷酶購自碧云天公司；

FM無血清培養基購自sciencell公司；

重組人表皮生長因子(EGF)購自上海昊海生物科技股份有限公司，重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自北京雙鷺藥業股份有限公司；

DMEM培養基、RPMI-1640培養基、F12培養基、胎牛血清購自Gibco公司,按照說明書配制成基礎培養基，添加10％的胎牛血清配制成完全培養基。

消化液I：0.25％胰酶(購自sigma公司)加入0.02M EDTA混合。

消化液2：II型膠原酶(購自sigma公司)，用PBS配成濃度為1mg/ml。

統計學分析

采用SPSS19.0統計分析軟件，對其中計量資料以表示，并進行重復資料方差分析或成組t檢驗。當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

分組：A組FM無血清培養基，B組DMEM+10％FBS，C組RPMI-1640+10％FBS，D組DMEM/F12(1:1)+10％FBS；

【實施例1】成纖維細胞原代培養：無菌條件下取正常耳后皮膚約2cm*3cm，將其放入無菌PBS中迅速帶回實驗室，去掉皮下組織及血管，按體積質量比5:1加入消化液1(0.25％胰酶+0.02M EDTA)，4℃過夜處理。第二日取出皮膚，去掉表皮，按體積質量比10:1加入消化液2(1mg/ml II型膠原酶)，37℃，2h處理。將上述混懸液過200目篩網，吹打濾過液，并將其等分成4份進行離心500rpm，10min，補加相應培養基重懸后，加到T25細胞培養瓶中，37℃5％CO₂過夜培養，并鏡下觀察細胞是否呈現放射狀或漩渦狀生長。

皮膚組織經消化液1及消化液2處理后，各組均在37℃，5％CO₂培養條件下培養。其中B、D組在培養72h后均可見大量成纖維細胞及少量上皮樣細胞(見圖1)，依據兩種細胞對消化酶I耐受度不同，通過3次傳代后，視野下即無上皮樣細胞(見圖2)。而A、C組則需培養96h以上才可達到細胞融合度80％以上并進行傳代。采用酶消化法可在短時間內獲得大量成纖維細胞。

【實施例2】細胞增殖實驗：單層成纖維細胞經消化液1消化后，依據分組情況，加入相應培養基稀釋細胞密度至約5×10³個/ml，以100μl/孔接種于6塊96孔板中，每組12個孔，且96孔板外圍不設實驗孔。隨后將6塊96孔板放入37℃5％CO₂培養箱中培養，并在12h、24h、48h、72h、96h、120h時間點取一塊96孔板棄去培養液，加入MTT(50μl/孔)，37℃、5％CO₂培養4h，緩慢吸取培養液并用清水沿孔壁吸取未反應的MTT，濾紙拍干，隨后加入DMSO(150μl/孔)，室溫振蕩10min，在波長490nm下讀取各孔吸光度值，并計算各組吸光度平均值。

其結果顯示，培養24h后，四組細胞均開始增殖。其中B組、D組細胞在培養48h-72h間細胞增殖最快，而A、C組在72h-96h增殖快。經統計分析，四組在培養72h后，OD值差異存在統計學意義(F＝14.353,P＝0.034)(見圖3)。

采用D組(DMEM/F12)培養基可有效促進細胞的增殖，采用C組(RPMI-1640)培養基時，細胞增殖速度相對緩慢，而MTT實驗進一步證實了，即使是相同細胞密度下，DMEM及DMEM/F12對于細胞的促增殖作用也明顯高于RPMI-1640及FM無血清培養基。貼壁類細胞采用DMEM培養時可獲得較快生長速度，其高濃度的細胞增殖成分使得剛分離的成纖維細胞可快速適應體外培養環境。此外，考慮臨床應用細胞的部位多為受損或老化部位，因此通過人為創造創面，來模擬細胞在注射入人體內后的遷移情況。其結果顯示，成纖維細胞填充創面速度為：DMEM/F12≥DMEM＞FM＞RPMI-1640。但對細胞形態進行觀察發現，DMEM細胞形態變大，而DMEM/F12仍保持原有細胞形態。由于細胞衰老時多出現細胞核增大現象，以便利于細胞吸收更多物質。而衰老細胞在分泌膠原蛋白、纖維粘連蛋白、彈性蛋白等細胞外基質能力明顯減弱，而這類物質不僅對細胞起到支撐、連接作用，同時也是細胞間信號傳導的重要橋梁。因此，在保證細胞增殖速度的同時，更要防治細胞過早衰老。雖然DMEM細胞營養成分濃度較高，但其營養成分種類較少，而F12培養基似乎可以彌補DMEM在此方面的缺陷，從而在促進細胞增殖過程中，避免了細胞過度老化。

【實施例3】細胞劃痕實驗：將四種培養基培養的成纖維細胞，按2*10⁵cell/孔，接種至6孔板中，37℃、5％CO₂培養過夜至細胞鋪滿六孔板，采用無菌槍頭在六孔板底部人為劃出幾道橫，PBS清洗3次后，加入相應培養基，每隔2小時在同一部位拍照觀察細胞遷徙情況。

自細胞劃痕后24小時內，每隔2小時對細胞遷徙情況進行拍照，其結果顯示，當采用D組培養液細胞遷移速度明顯快于其余各組。見圖4。

【實施例4】膠原蛋白分泌：將各組細胞轉移至T25細胞培養瓶中培養，每次傳代前，吸取細胞上清液-20℃凍存，PBS清洗一次，加入消化酶1消化3min，離心，取出消化酶1,加入培養基重懸，吸取一半補加入原瓶37℃5％CO₂繼續培養，共收集各組在傳代前、傳代1次、傳代2次、傳代3次、傳代4次上清液，離心3000rpm,10min，將樣品存于-20℃冰箱備用，并按照試劑盒說明書進行人膠原蛋白酶I酶聯免疫試驗。

膠原蛋白檢測：各組均先扣除傳代前膠原蛋白含量，其中A組細胞分泌膠原含量相對穩定，而B、D組在傳代3次后膠原分泌達到最大后膠原分泌量逐漸減少，因此，FM無血清培養基可使細胞穩定表達膠原蛋白，而DMEM/F12則有利于提高細胞前期膠原蛋白表達。見表1。

表1各組細胞膠原蛋白分泌檢測

【實施例5】細胞衰老

采用β-半乳糖苷酶檢測試劑盒，大致步驟如下：將細胞傳代按5*10⁴cell/孔接種至6孔板中，PBS清洗，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室溫放置15min，吸棄固定液，PBS清洗3次，3min/次，加入1ml染色液放置于不含CO₂37℃培養箱中孵育過夜，隔日顯微鏡下觀察細胞染色情況。

自細胞傳代至38代時，對四組細胞分別進行β-半乳糖苷酶檢測，其中B組細胞衰老明顯，而C組次之，A、D組較不明顯,可見，DMEM培養下的細胞衰老速度明顯快于其余三組細胞，而其余三組未見明顯差異，見圖5。

【實施例6】軟瓊脂克隆形成實驗

配置2×DMEM-F12完全培養基(含2×FBS)，并與等體積1.2％低熔點瓊脂混合加入6孔板中，每孔1.6ml，常溫放置待其凝固。將傳代30次的成纖維細胞經胰酶消化、離心，添加2×DMEM-F12完全培養基稀釋細胞濃度至1*10⁵cell/ml；另將2×DMEM-F12完全培養基與等體積0.7％低熔點瓊脂糖混合后，并加入100μl細胞懸液混勻，添加至含有下層凝固的瓊脂完全培養基中，放入37℃，5％CO₂培養箱10-14天后，每孔加入1ml(0.01％)結晶紫，室溫染色10min，拍照計數。其中，本實驗以A549肺癌細胞作為陽性對照。

以A549肺癌細胞為陽性對照品，其結果顯示，皮膚成纖維細胞在體外培養30代后，細胞暫時可保持正常生長狀態，無明顯腫瘤化生長跡象。接種在軟瓊脂上培養15天后，不形成克隆且細胞均死亡，見圖6。

【實施例7】細胞生長因子實驗：將細胞均勻接種于96孔板中(1500cell/孔)，37℃、5％CO₂培養24h后，棄去培養液。將EGF、bFGF用培養基稀釋成梯度濃度(濃度梯度為0、25、50、75、100、200、400U/ml)，按每孔200μl加入至96孔板，每個梯度做3組重復，以加200μl培養基設為對照組。繼續37℃、5％CO₂培養24h后，每孔取100μl上清培養液進行人膠原蛋白酶I酶聯免疫試驗(見實施例4)；將96孔板剩余培養液棄凈，用MTT法進行細胞增殖實驗(見實施例2)。

培養基中分別加入一定梯度濃度的EGF和bFGF(濃度梯度為0、25、50、75、100、200、400U/ml)，培養24h后，較未加生長因子的對照組(細胞OD值僅為0.2)，成纖維細胞有明顯的增殖(見圖7)。其中EGF組細胞增長更為突出，當EGF為100U/ml，成纖維細胞增殖達到峰值，細胞OD值為0.38，是對照組的1.9倍。成纖維細胞膠原蛋白的分泌量在加入生長因子后也有明顯的增加(見圖8)，EGF和bFGF確實促進了成纖維細胞I型膠原蛋白分泌的增加。在EGF和bFGF活力單位為75U/ml和100U/ml時分別達到峰值，峰值后隨活力單位的增加分泌量逐漸減少。

但是細胞所需的細胞生長因子是相對較少的，其活性在一定范圍內對細胞的增殖和膠原蛋白的分泌有促進作用，超過一定量，作用反而減弱甚至會反向抑制。也說明在人體內所需的生長因子量并不多，但是生物活性非常高。

綜上所述，采取酶消化法有助于快速從人皮膚組織中獲得成纖維細胞，而采用DMEM/F12培養基并添加一定量的EGF(75U/ml)和bFGF(100U/ml)則有助于成纖維細胞的增殖及膠原蛋白的分泌。