一種仔豬心肌成纖維細胞的分離培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種豬心肌成纖維細胞分離培養方法，屬于現代生物技術的細胞培養技術領域。
【背景技術】
[0002]細胞培養技術在生物、醫學科學研究中的應用越來越廣泛。原代培養是指通過組織塊直接長出單層細胞或者用酶或機械方法將組織分散成單個細胞開始培養，在首次傳代前的培養可認為是原代培養。原代細胞可廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫學基礎研究，如蛋白質組學、基因組學、細胞株研究等，還可應用于藥物篩選、藥物代謝和毒理研究等。除此以外，原代培養也是建立各種細胞系(株)必經的階段。
[0003]心肌成纖維細胞約占心肌組織細胞總數的60~70%，是心臟中非心肌細胞的主要組成部分。該細胞通過產生細胞外基質，如膠原蛋白和纖維連接蛋白，構成了心肌細胞的機械框架；另一方面，心肌成纖維細胞還可以產生心室重構過程中所需的金屬蛋白酶、各種生長因子和細胞因子。因此，對心肌功能正常運作起著重要作用。臨床上，心肌成纖維細胞的增殖參與了高血壓左心室肥厚、缺血性心臟病、擴張型心肌病及充血性心力衰竭等多種心血管疾病的病理過程，研究心肌成纖維細胞對于現代心血管疾病的研究具有重要意義。
[0004]迄今為止，研究人類心臟肥大等心臟疾病使用的細胞模型主要為乳鼠的心肌成纖維細胞和乳鼠心肌細胞。但是，因豬與人的親緣性更近，并且豬的心臟在解剖結構、心臟血管分布、心臟與體重比等方面和人的心臟很相似，因此，如果以豬心肌成纖維細胞作為研究人類心臟肥大等疾病的細胞模型更具優勢。然而到目前為止，尚無有關仔豬心肌成纖維細胞分離培養的研究。
【發明內容】
[0005]本發明提供一種仔豬成纖維細胞分離培養方法，該培養方法簡單易操作，節約時間，成功率高，獲得的原代細胞形態穩定、活性好、數量足，細胞增殖能力強。
[0006]本發明的技術方案如下:
一種仔豬心肌成纖維細胞分離方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)將出生1~3日內的仔豬，用0.1%新潔爾滅全身消毒，前腔靜脈放血迅速處死，固定仔豬，75%酒精消毒胸腹部皮膚。
[0007](2)無菌手術刀將仔豬胸部皮膚切開。
[0008](3)無菌剪刀沿胸腔最后一根肋骨向前剪開，暴露心臟，立即放入盛有50 mL預冷PBS燒杯中，洗去血細胞和血凝塊。
[0009](4)無菌鑷子將心臟轉移到無菌的平皿中，無菌眼科剪截取心室，剝除心包膜，加入適量預冷PBS沖洗，剔除血管、脂肪和結締組織，預冷PBS漂洗2?3次。
[0010](5)將其剪成1?2 mm3組織塊，轉移到50 mL離心管中，用預冷PBS漂洗組織碎塊2?3次，以去除血細胞，棄掉洗滌液留下組織塊以備消化。[0011 ] (6)加入0.25%胰蛋白酶和0.1% II型膠原酶1:1混合酶液，用量是組織塊體積的3~5倍，置37°C水浴中振蕩消化15 min后，棄去上清液(主要為紅細胞、細胞碎肩及死細胞)。
[0012](7)再加入含DNA酶(終濃度為0.02 mg/mL)的混合酶液，置37 °C水浴中振蕩消化8~10min。
[0013](8)移液管小心吸取上清液移入另一支無菌離心管中，并加入10~15 mL含10?15%胎牛血清的DMEM高糖培養液終止消化。如此重復消化3~8次。
[0014](9)細胞懸液用100 μ m和40 μ m濾篩分別過濾后收集到離心管，1000 RPM/min離心5~6min，棄上清，加入紅細胞裂解液3~5 mL離心棄上清，用含10%~15%胎牛血清的DMEM高糖培養液重懸細胞，將細胞懸液加入25cm2培養瓶中于37°C、5% C0 2培養箱中培養。
[0015](10)差速貼壁。從培養瓶放入培養箱中開始計時，60~90 min后，棄去未貼壁細胞，貼壁細胞即為分離純化的心肌成纖維細胞。
[0016]相比現有技術，本發明的有益效果在于:
(1)豬的心臟在解剖結構、心臟血管分布、心臟與體重比等方面和人的心臟很相似，是小鼠等實驗動物的心臟不能比擬的。為提供穩定、重復性好、與臨床更為接近的動物模型，我們選用與人心臟接近的豬作為研究對象。到目前為止，尚無分離豬心肌成纖維細胞的相關報道，用豬心肌成纖維細胞作為人類心臟肥大等疾病的研究模型更加準確。
[0017](2)本發明操作簡單易行，無需特殊設備，節約時間等優點，得到仔豬心肌成纖維細胞形態穩定、活性好、數量多，細胞增殖能力強，可用于后續細胞藥物敏感試驗、細胞的分選與鑒定等研究。
[0018](3)本發明使用0.25%胰蛋白酶和0.1% II型膠原酶1:1混合酶液，置37 °C水浴中振蕩，多次消化。消化得到細胞懸液在冰上處理，以提高細胞活性。同時采用較低濃度胰蛋白酶和較高濃度II型膠原酶混合消化酶消化心肌組織，能很好地將心肌成纖維細胞分離出來。
[0019](4)本發明使用DNA酶，在心肌組織消化時，能有效減少細胞懸液粘稠度，提高細胞獲得率。
[0020](5)本發明使用紅細胞裂解液裂解紅細胞，減少紅細胞對心肌成纖維細胞生長影響。
【附圖說明】
[0021]圖1實施例1藏豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第2天細胞。
[0022]圖2實施例1藏豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第3天細胞。
[0023]圖3實施例1藏豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第4天細胞。
[0024]圖4實施例2長白豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第2天細胞。
[0025]圖5實施例2長白豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第3天細胞。
[0026]圖6實施例2長白豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第4天細胞。
[0027]圖7實施例3大白豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第2天細胞。
[0028]圖8實施例3大白豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第3天細胞。
[0029]圖9實施例3大白豬(仔豬)心肌成纖維細胞生長第4天細胞。
[0030]圖10~13 Hoechst染色心肌成纖維細胞。
【具體實施方式】
[0031]實施例1:
一種藏豬心肌成纖維細胞分離培養方法，包括如下步驟:
(1)將出生2日齡仔豬，用0.1%的新潔爾滅全身消毒后，前腔靜脈放血迅速處死，固定仔豬，75%酒精消毒胸腹部皮膚。
[0032](2)無菌手術刀將仔豬胸部皮膚切開。
[0033](3)無菌剪刀沿仔豬最后一根肋骨向前剪開胸腔，取下心臟，立即放入盛有50 mL預冷PBS燒杯中，洗去血細胞和血凝塊。
[0034](4)無菌鑷子將心臟轉移到無菌平皿中，截取心室組織并剝除心包膜，加入適量預冷PBS沖洗，剔除血管、脂肪和結締組織，漂洗3次。
[0035](5)眼科剪刀將組織剪成1 mm3左右碎塊轉移到50 mL錐形瓶中，加入PBS漂洗3次，棄掉洗滌液留下組織塊以備消化。
[0036](6)加入0.25%胰蛋白酶和0.1% II型膠原酶1:1混合酶液，用量是組織體積3倍，置37 °(:水浴中振蕩消化15min后，吸管棄去上清液。
[0037](7)再加入混合酶液，置37 °(:水浴中振蕩消化10 min。。
[0038](8)移液管小心吸取上清液移入另一支無菌離心管中，并加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液終止消化。如此重復消化5次。
[0039](9)細胞懸液用100 μ m和70 μ m濾篩分別過濾后收集到離心管，1000 RPM/min離心5 min,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液重懸細胞。
[0040](10)差速貼壁1次90 min,分離純化心肌成纖維細胞。
[0041](11)得到細胞如圖1~3。
[0042]實施例2:
一種長白豬心肌成纖維