一種馬鈴薯專用復合微生物菌劑及其制備方法與流程

本發明屬于農業微生物技術領域，涉及一種馬鈴薯專用復合微生物菌劑及其制備方法。

背景技術：

馬鈴薯（solanumtuberosum）又稱土豆、洋芋、山藥蛋等，其食用部位是地下塊莖，富含淀粉和粗蛋白質，可糧菜飼兼用；工業上可生產淀粉、酒精等，是典型的高產作物，也是我國部分馬鈴薯主產區農民脫貧致富、增加收入的支柱產業。馬鈴薯是全球第四大糧食作物，中國是世界馬鈴薯總產最多的國家。2016年2月23日，農業部發布《關于推進馬鈴薯產業開發的指導意見》，將馬鈴薯作為主糧產品進行產業化開發。

連作障礙引起的土壤惡化、病害積累等一直是困擾馬鈴薯生產的一大障礙。近年來，隨著馬鈴薯產業化程度的提高，連作問題更加突出。馬鈴薯連作障礙的發生，不僅影響馬鈴薯產量和品質，同時還降低了產品的安全性。因此，急需解決馬鈴薯連作障礙問題，從而實現馬鈴薯的高產、穩產。

總結國內外馬鈴薯連作的研究成果，馬鈴薯連作障礙形成機制主要有土壤微生物變化、養分比列失調、鹽漬化加重、土壤物理結構改變及植物自毒作用等，通過實施輪作、科學施肥等措施，可以有效控制連作障礙對馬鈴薯生產的影響。馬鈴薯的施肥，一般是以“有機肥為主，化肥為輔，重施基肥，早施追肥”為原則。鑒于馬鈴薯對肥料的特殊需求，尤其是對基肥的需求特殊，所以，普通的化肥和有機肥并不能夠直接用于馬鈴薯。然而復合微生物菌劑是一種環境友好型肥料，其選用的微生物菌種均是來自于植物組織（根、莖、葉、鱗莖等）和根際土壤的有益菌，能夠促進植物生長，消減作物的連作障礙，提高作物品質和產量，預防和治療病蟲害，改善土壤營養結構和理化性質，保持生態平衡，減少環境污染等。目前馬鈴薯施用的肥料以化學肥料為主，造成土壤板結，肥力下降等問題；病蟲害的防治主要采用化學農藥，不僅易產生抗藥性，還會造成嚴重的環境污染等問題，而現有技術中還沒有專門為降低馬鈴薯連作障礙而設計的復合微生物菌劑。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明提供了一種符合馬鈴薯生長營養需求的馬鈴薯專用復合微生物菌劑及其制備方法。

本發明所述復合微生物菌劑用于協調營養，促進馬鈴薯生長，降低馬鈴薯連作障礙，提高馬鈴薯品質、產量以及抗病抗逆性，達到改善土壤特性的目的。

一種馬鈴薯專用復合微生物菌劑，其特征在于該復合微生物菌劑為含有菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07、菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14的發酵液；所述發酵液中aspergilluapseududeflectusds03、metarhiziumanisopliaesms07、bacillussp.ds18、bacilluslaterosporusles15、bacillusmegateriumfbs3和bacillussubtilisfbrs14的群落總數依次為：1.0×10³～5.0×10⁴cfu/ml、1.0×10³～5.0×10⁴cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml。

所述菌株aspergilluapseududeflectusds03保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰路1號院3號，中科學院微生物研究所，保藏日期為2015年12月7號，種名：假彎頭曲霉，保藏號為cgmccno.11791。

所述菌株metarhiziumanisopliaesms07保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰路1號院3號，中科學院微生物研究所，保藏日期為2015年12月7號，種名：綠僵菌，保藏號為cgmccno.11792。

所述菌株bacillussp.ds18保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰路1號院3號，中科學院微生物研究所，保藏日期為2015年12月7號，種名：芽孢桿菌，保藏號為cgmccno.11829。

所述菌株bacilluslaterosporusles15保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰路1號院3號，中科學院微生物研究所，保藏日期為2015年12月7號，種名：側孢芽孢桿菌，保藏號為cgmccno.11832。

所述菌株bacillusmegateriumfbs3保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰路1號院3號，中科學院微生物研究所，保藏日期為2015年12月7號，種名：巨大芽孢桿菌，保藏號為cgmccno.11834。

所述菌株bacillussubtilisfbrs14保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為：北京市朝陽區北辰路1號院3號，中科學院微生物研究所，保藏日期為2015年12月7號，種名：枯草芽孢桿菌，保藏號為cgmccno.11835。

所述發酵液中aspergilluapseududeflectusds03、metarhiziumanisopliaesms07、bacillussp.ds18、bacilluslaterosporusles15、bacillusmegateriumfbs3和bacillussubtilisfbrs14的群落總數依次為：2.0×10⁴cfu/ml、3.0×10⁴cfu/ml、2.0×10⁹cfu/ml、6.0×10⁹cfu/ml、4.0×10⁹cfu/ml、6.0×10⁹cfu/ml。

上述馬鈴薯專用復合微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：

1）斜面培養：將菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07、菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14六種微生物菌株分別接種于固體培養基，活化菌株；

2）一級種子培養：，將步驟1）活化的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養基，150-180rpm搖床培養；

3）混合發酵培養：將步驟2）一級種子接種于液體培養基中，進行復合菌劑搖床培養，即得馬鈴薯專用復合微生物菌劑。

步驟1）中，菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07在15℃～38℃條件下接種于pda固體培養基上培養3-5天；菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14在20℃～30℃條件下接種于na固體培養基上，培養2-3天。

步驟2）中，菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07在20℃～38℃條件下接種于pda液體培養基中搖床培養3-5天；菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14在20℃～30℃條件下接種于na液體培養基中搖床培養3-5天。

步驟3）中，接種量為液體培養基的體積的0.5%-2%，優選1%。

步驟3）中，所述混合發酵培養條件：溫度20-28℃；150-200rpm，優選180rpm；培養3-5天。

所述pda培養基成分為：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000ml，ph6.0-6.5；na培養基成分：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g、蒸餾水1000ml，ph7.0-7.2，121℃滅菌20min。

本發明所述復合微生物菌劑能促進馬鈴薯生長、降低連作障礙、提高抗逆性及改良作物土壤特性。本發明所述復合微生物菌劑施用在種植馬鈴薯的根際土壤中，施用方法為土壤灌溉。

上述操作步驟如無特別說明，均按本領域常規操作。

本發明的有益效果：本發明的馬鈴薯專用復合微生物菌劑施用后大量的有益菌補充到土壤中后，在作物根系周圍形成保護屏障，抑制有害菌的生長，繁殖，保護作物根系，同時抑制各種病蟲害，從而提高馬鈴薯抗旱、抗病蟲害等抗逆性；活菌在根際定殖后，能夠改善種植土壤生態環境，改良土壤結構和理化性質，降低連作障礙。

本發明的馬鈴薯專用復合微生物菌劑能夠為馬鈴薯生長提供營養。發酵過程中微生物產生多種有效代謝產物具有固氮、解磷、解鉀的作用，從而提高馬鈴薯的生物產量和品質；

本發明的馬鈴薯專用復合微生物菌劑的菌株是來源于植物組織（根、莖、葉、鱗莖等）和根際土壤的有益菌，不會引入致病菌，不污染環境，無毒副作用；現有技術中多種菌復合容易出現菌株之間相互抑制，影響生長的現象，本發明經過長期摸索，選擇的菌株之間不會相互抑制，在定殖生長、功能效果上還能互補。

本發明產品的各個組分配比，可根據具體的土壤條件和不同生育期的需求顧慮，進行適當的調整，以滿足作物的生長。

附圖說明

圖1為不同處理的30株馬鈴薯塊莖總數。

圖2為不同處理的30株馬鈴薯塊莖總重量。

圖3為不同重量馬鈴薯塊莖所占比例，主要展示不同處理對馬鈴薯產量的影響。

圖4為不同粗糙度馬鈴薯塊莖所占比例，主要展示不同處理對馬鈴薯品質的影響。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

下述實施例中所用的實驗方法，如無特殊說明均為常規方法。

實施例1.

馬鈴薯專用復合微生物菌劑的組成：

假彎頭曲霉菌株ds032.0×10⁴cfu/ml；

綠僵菌菌株sms073.0×10⁴cfu/ml；

芽孢桿菌菌株ds182.0×10⁹cfu/ml；

側孢芽孢桿菌菌株les156.0×10⁹cfu/ml；

巨大芽孢桿菌菌株fbs34.0×10⁹cfu/ml；

枯草芽孢桿菌菌株fbrs146.0×10⁹cfu/ml。

上述馬鈴薯專用復合微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：

1）斜面培養：將菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）、菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）六種微生物菌株分別接種于固體培養基，活化菌株；

2）一級種子培養：將步驟1）活化的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養基，180rpm搖床培養；

3）混合發酵培養：將步驟2）一級種子接種于液體培養基中，進行復合菌劑搖床培養，得到馬鈴薯專用復合微生物菌劑。

上述制備方法中，在步驟1）中，將菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在30℃條件下接種于pda固體培養基上培養4天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在28℃條件下接種于na固體培養基上，培養3天；

在步驟2）中，將菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在30℃條件下接種于pda液體培養基中搖床培養3天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在28℃條件下接種于na液體培養基中搖床培養3天；

在步驟3）中，接種量為液體培養基的體積的1%；

在步驟3）中，混合發酵培養條件：溫度28℃；180rpm；培養5天。

實施例2

馬鈴薯專用復合微生物菌劑的組成：

假彎頭曲霉菌株ds031.0×10³cfu/ml；

綠僵菌菌株sms071.0×10³cfu/ml；

芽孢桿菌菌株ds188.4×10⁸cfu/ml；

側孢芽孢桿菌菌株les158.1×10⁸cfu/ml；

巨大芽孢桿菌菌株fbs38.2×10⁸cfu/ml；

枯草芽孢桿菌菌株fbrs148.8×10⁸cfu/ml；

所述菌劑制備方法同實施例1.區別在于：

在步驟1）中，將菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在20℃條件下接種于pda固體培養基上培養5天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在20℃條件下接種于na固體培養基上，培養3天；

在步驟2）中，將菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在15℃條件下接種于pda液體培養基中搖床培養3天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在20℃條件下接種于na液體培養基中搖床培養3天；

在步驟3）中，接種量為液體培養基的體積的0.5%；

在步驟3）中，混合發酵培養條件：溫度20℃；180rpm；培養4天。

實施例3

馬鈴薯專用復合微生物菌劑的組成：

假彎頭曲霉菌株ds033.0×10⁴cfu/ml；

綠僵菌菌株sms075.0×10⁴cfu/ml；

芽孢桿菌菌株ds181.2×10¹⁰cfu/ml；

側孢芽孢桿菌菌株les151.5×10¹⁰cfu/ml；

巨大芽孢桿菌菌株fbs31.3×10¹⁰cfu/ml；

枯草芽孢桿菌菌株fbrs141.4×10¹⁰cfu/ml。

所述菌劑制備方法同實施例1。區別在于：

在步驟1）中，將菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在38℃條件下接種于pda固體培養基上培養3天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在30℃條件下接種于na固體培養基上，培養2天；

在步驟2）中，將菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在38℃條件下接種于pda液體培養基中搖床培養2天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在30℃條件下接種于na液體培養基中搖床培養3天；

在步驟3）中，接種量為液體培養基的體積的2%；

在步驟3）中，混合發酵培養條件：溫度20℃；150rpm；培養5天。

實施例4馬鈴薯專用復合微生物菌劑田間應用效果

試驗設計：

施用時間為馬鈴薯塊莖形成期。

施用方法為土壤灌溉，以不施用本產品同一地域同品種馬鈴薯為試驗對照。

試驗地點：甘肅省蘭州市七里河區西果園鄉馬鈴薯種植基地，露地直播，覆蓋地膜。

供試品種：“新大坪”一級種。

試驗設計采用完全隨機區組設計，共2個區組，株距30~40cm，行距70cm，各處理間設2保護行。各種栽培管理措施按照當地高產優質馬鈴薯栽培技術精心管理。各處理馬鈴薯達到收獲期進行樣品采集。

試驗結果：

（1）施用本發明所述馬鈴薯專用復合微生物菌劑處理的馬鈴薯總重量及單個個體重量明顯比常規對照組高，兩者達到顯著差異，復合菌劑處理的馬鈴薯產量比對照提高了57.5%。由此表明施用復合微生物菌劑能明顯降低連作障礙，提高馬鈴薯的產量。具體見表1、圖1、2。

表1不同處理馬鈴薯產量

（2）施用本發明所述馬鈴薯專用復合微生物菌劑對馬鈴薯生長具有明顯的促進作用，處理組馬鈴薯在生長性狀指標上明顯優于常規對照組。復合微生物菌劑處理的馬鈴薯單個重量大于150g的數量明顯大于常規對照組，而常規對照組單個重量大多數小于100g，由此表明復合微生物菌劑對馬鈴薯產量提升起到很大的作用。具體見表2、圖3。

表2不同處理馬鈴薯產量性狀指標

（3）馬鈴薯的表皮粗糙程度反映馬鈴薯的品相、口感，表皮粗糙程度與產品品相和口感成正比。施用本發明所述馬鈴薯專用復合微生物菌劑對馬鈴薯品相和口感有很大的協同增強效應，處理的馬鈴薯表皮粗糙度明顯大于常規對照。由此可見，馬鈴薯專用復合微生物菌劑不僅提高馬鈴薯產量，同時對馬鈴薯的生物品質和品相方面都有極大的提高，提升了馬鈴薯的市場競爭力。具體見表3、圖4。

表3不同處理馬鈴薯品質

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