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一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的專用引物和方法與流程

文檔序號:12098139閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的專用引物,包括上游引物和下游引物,其特征在于:

上游引物CVA-4F:5’-TCACATTATCAGAGAACCAGAG-3’;

下游引物CVA-4B:5’-GCAAAAGTTAATAATGACATGCC-3’。

2.一種權利要求1所述的櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法,其特征在于,包括以下步驟:

第一步,提取CVA毒源材料的總RNA,用隨機引物反轉錄得到cDNA,以CVA-4F和CVA-4B為引物進行PCR擴增,大小為205bp的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收,連接克隆載體,轉化大腸桿菌感受態細胞,篩選并挑取含陽性克隆的大腸桿菌進行培養,提取質粒得到陽性質粒標準品;

第二步,陽性質粒標準品分別梯度稀釋至不同濃度,以CVA-4F和CVA-4B為引物進行熒光定量PCR擴增,以Ct值為縱坐標,以質粒拷貝數為橫坐標,繪制得到標準曲線;

第三步,提取待測樣品的總RNA,以CVA-4B為引物反轉錄得到cDNA,以該cDNA為模板,按照與步驟(2)中完全相同的條件進行熒光定量PCR擴增,所得Ct值代入標準曲線公式得到待測樣品中CVA基因組RNA的含量。

3.如權利要求2所述一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法,其特征在于,在第一步中,陽性質粒標準品的制備,其PCR反應體系為:2×Ex Taq Mix 12.5μL,10μM CVA-4F和CVA-4B引物各1.0μL,模板2.0μL,雙蒸水補足至25μL。

4.如權利要求2所述一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法,其特征在于,在第一步中,陽性質粒標準品的制備,其PCR反應程序為:95℃3min;95℃30s,58℃30s,72℃20s,共35個循環;72℃10min。

5.如權利要求2所述一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法,其特征在于,在第二步中,繪制標準曲線時根據公式:拷貝數(copy/μL)=(濃度(ng/μL)×10-9×6.02×1023)/(質粒堿基數×660),將質粒標準品依次稀釋至108,107,106,105,104copy/μL共5個濃度。

6.如權利要求2所述一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法,其特征在于,在第二步中,繪制標準曲線和檢測待測樣品時的熒光定量PCR反應體系為:2×SYBR Green qPCR Mix 10.0μL,10μM CVA-4F和CVA-4B各1.4μL,模板1.0μL,雙蒸水補足至20μL。

7.如權利要求2所述一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法,其特征在于,在第二步中,繪制標準曲線和檢測待測樣品時的熒光定量PCR反應程序為:95℃2min;95℃5s,58℃10s,共39個循環;由65℃至95℃,以每10s升溫0.5℃讀取熒光值得到溶解曲線。

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