一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑曲霉β?葡萄糖苷酶表達酶活的方法與流程

本發明屬于基因工程領域，涉及一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法。

背景技術：

纖維素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協同作用的多組分酶系，是一種復合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成。

在纖維素酶降解纖維素的時候，外切酶先把纖維素酶解為短鏈可溶的片段，內切酶把短鏈的片段酶解為纖維二糖，纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下酶解為葡萄糖。纖維素酶酶解纖維素是一個協同降解的過程，某一種酶活性過高或者過低都會降低纖維素酶解效率。

黑曲霉是一種食品安全菌，產生的纖維素酶具有廣闊的應用領域，比如污水處理、垃圾利用、食品等。黑曲霉生產的纖維素酶中β-葡萄糖苷酶的酶活相對較高，三種酶的組成不利于最大化的發揮酶的催化效率。降低β-葡萄糖苷酶的活性是優化纖維素酶酶系組成的一個重要措施。已有的降低某種酶的表達效率的措施主要為基因敲除，也取得了一些效果。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點與不足，提供一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法。本發明的目的還在于提供一種磷酸鹽誘導β-葡萄糖苷酶活性降低的黑曲霉菌株。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法，包括如下步驟：

（1）將由磷酸鹽誘導啟動子或含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列、表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列和終止子序列組成的DNA片段構建到表達載體上；

（2）將步驟（1）所構建的重組載體轉化到黑曲霉中；

（3）往培養基中加入磷酸鹽后對轉化有重組載體的黑曲霉菌株進行培養。

步驟（1）中所述的含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列優選如SEQ ID NO.1所示。

步驟（1）中所述的表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列優選如SEQ ID NO.2所示。

步驟（1）中所述的終止子序列優選如SEQ ID NO.3所示。

步驟（1）中所述的表達載體優選為pMW1載體。

步驟（1）優選為：將序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段通過限制性內切酶EcoI、KpnI及DNA連接酶構建到pMW1載體上，得到重組載體。

步驟（2）中所述的黑曲霉優選為黑曲霉ATCC16404。

步驟（2）優選通過農桿菌將所構建的重組載體轉化到黑曲霉中。

步驟（3）中所述的培養基的配方優選為：麩皮10g，蛋白胨1g，牛肉膏1g，水1L。

步驟（3）中所述的磷酸鹽優選為磷酸鈉。

一種磷酸鹽誘導β-葡萄糖苷酶活性降低的黑曲霉菌株，為上述方法中構建的轉化有重組載體的黑曲霉菌株。

本發明具有如下優點和有益效果：本發明利用磷酸鹽誘導啟動子調控β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA轉錄，有效降低了β-葡萄糖苷酶的翻譯量和表達的活性，從而優化了黑曲霉表達的纖維素酶系組合，以最大化發揮纖維素酶系降解纖維素的效率。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

1. 材料

黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC16404，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1，pMW1質粒（BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心）。

人工合成的DNA序列1（SEQ ID NO.4所示），該序列由含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列、表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列、終止子序列及兩端的酶切位點序列組成。

2. 方法

（1）質粒pMW1的提取

含有質粒pMW1的大腸桿菌DH5α在含有30μg/mL氨芐霉素的LB培養基中培養18h。質粒提取按照上海生工的一步法質粒DNA抽提試劑盒（產品編號B518188）的操作流程提取。具體如下：取0.5mL菌液，10000r/m離心3min收集菌體，倒盡或吸干培養基。在菌體沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振蕩至徹底懸浮菌體，室溫放置3min。將裂解液全部小心移入吸附柱，室溫放置1min，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，再次向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中，將空吸附柱和收集管放入離心機，8000rpm離心2min。將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室溫靜置2min，8000r/m離心2 min。將所得到的質粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后續試驗。

（2）重組質粒的構建

1）pMW1質粒、合成的DNA序列1的酶切、回收

往20μL提取的pMW1質粒或用雙蒸水稀釋10倍的DNA序列1中加入EcoI和KpnI（Takara）各2μL、酶切緩沖液2.5μL，37℃水浴3h后，加入2μL Loading Buffer，終止反應。

酶切的質粒或DNA序列1通過瓊脂糖凝膠電泳后用上海生工的SanPrep核酸純化套件（膠回收）試劑盒（B515103-0100）回收，得pMW1質粒酶切回收液、DNA序列1酶切回收液。

2）連接和轉化

連接體系為：pMW1質粒酶切回收液17.5μL，DNA序列1酶切回收液2μL，DNA連接酶（Takara）2.5μL，連接酶緩沖液2.5μL。16℃連接24h，連接產物備用。

將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取轉化子培養，提質粒進行酶切、測序鑒定，鑒定正確的重組質粒命名為pMW1-01。

（3）黑曲霉孢子原生質體制備及重組質粒的轉化

1）斜面活化

在無菌操作臺中，將保藏的黑曲霉ATCC16404菌種接入已滅菌的斜面培養基中，置于30℃恒溫培養箱中培養3天，斜面長出孢子。

所用斜面培養基為PDA培養基，其配制方法為：取新鮮馬鈴薯60g，去皮切成細絲狀，加入適量蒸餾水，置于蒸煮鍋內煮沸并不斷用玻璃棒攪拌至快成糊狀，用八層紗布過濾取濾液，依次加入用天平稱取的葡萄糖2g、瓊脂2g，攪勻，最后用蒸餾水定容至100mL，加熱溶解。分裝于試管中，約至試管的三分之一，然后加塞包扎滅菌，滅菌溫度為121℃，壓強為0.1Mpa，滅菌20min。滅菌結束后擺斜面冷卻待用。

2）孢子懸浮液的制備

將已活化的黑曲霉孢子從試管中刮到裝有生理鹽水的三角瓶中，置于30℃搖床上，150r/m震蕩10min。取出用4層擦鏡紙過濾，將濾液用3000r/m離心，棄上清液，用生理鹽水洗滌1-2次。然后對懸浮液進行鏡檢和計數，調整孢子濃度約為5×10⁸個/mL，50℃熱激1min，30℃培養8h，得到孢子萌發懸浮液。

3）原生質體懸液的制備

采用高滲溶液即0.8mol/L NaCl溶液配制0.5%蝸牛酶和1%纖維素酶的混合酶液10mL，加入10mL孢子萌發懸浮液，30℃水浴4h，用微孔濾膜過濾，再用0.8mol/L NaCl溶液反復沖洗濾膜上的孢子，最后濾膜上的孢子溶解到10mL 0.8mol/L NaCl溶液中，得到原生質體懸液。

4）根癌農桿菌感受態的制備

挑取根癌農桿菌AGL1接種于3mL LB液體培養基中，28℃、180r/min培養過夜。取2mL 培養液接種于100mL LB液體培養基中繼續培養，至OD₆₀₀為0.5左右。將培養液置冰浴中40min后4℃、5000r/min 離心10min，棄去上清液。用10mL 4℃預冷的無菌水離心洗滌1次，棄去上清液。再用10mL 4℃預冷的10%甘油懸浮菌體，4℃、5000r/min離心5min，棄去上清液。最后用1mL 4℃預冷的10%甘油懸浮，分裝成每管70μL，-70 ℃保存。

5）根癌農桿菌的轉化和培養

取1μL重組質粒pMW1-01，加到70μL根癌農桿菌AGL1感受態細胞中，混勻，吸取并加到間距0.2cm電轉杯中，擦拭干凈，調節電擊電壓為2.5kV，電擊5ms。將電轉化后的根癌農桿菌涂布于LB平板（含100μg/mL氨芐霉素）上進行篩選。篩選得到的陽性克隆子在LB平板（含100μg/mL氨芐霉素）上劃線，28℃培養2d。挑取單菌落接種于5mL LB液體培養基（含100μg/mL氨芐霉素）中，28℃、180r/min培養16～20h。取1mL根癌農桿菌菌液接種于含有相應抗性的100mL LB液體培養基中，28℃、180r/min培養至OD₆₀₀為0.8左右時備用。

6）誘導培養和轉化

根癌農桿菌的誘導培養：取4mL（OD₆₀₀＝0.8）的根癌農桿菌菌液5000r/min離心5min收集菌體，用6mL含有400μmol/L乙酰丁香酮的IM培養基懸浮菌體，28℃懸浮培養5h。IM培養基：KH₂PO₄ 1.45g，K₂HPO₄ 2.05g，NH₄NO₃ 0.5g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，NaCl 0.3g，葡萄糖2g，甘油5g，1000mL水，鹽酸調節pH 5.4。

轉化：黑曲霉原生質懸液250μL，調節誘導后的根癌農桿菌菌液的濃度，按黑曲霉孢子與根癌農桿菌1:100的數量比例等體積混合均勻，涂布在轉化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固體培養基上。

7）轉化子的篩選

涂布在轉化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固體培養基上的黑曲霉24℃避光培養48h，然后將原生質體長處的菌絲用無菌水稀釋后涂到含有150μg/mL潮霉素B的IM固體培養基上進行初篩，培養4d，隨后轉接至含有200μg/mL潮霉素B的IM培養基上進行復篩，獲得轉化成功的轉化子。

（4）誘導啟動降低β-葡萄糖苷酶的表達活性

1）產酶培養

產酶培養基配制：麩皮10g，蛋白胨1g，牛肉膏1g，自來水1L，115℃滅菌30min。在250mL三角瓶中裝入150mL液體產酶培養基。

在無菌操作臺中，將黑曲霉菌種或篩選的轉化子接入已滅菌的斜面PDA培養基中，置于30℃恒溫培養箱中培養3d，得到斜面孢子。得到的斜面孢子接入到產酶培養基中，接種量為 1×10⁵孢子/mL，150r/m、30℃培養36h，培養液用濾紙過濾，測定濾液β-葡萄糖苷酶的酶活。出發菌株的酶活為22U/mL，所篩選轉化子的酶活為21.0U/mL。

β-葡萄糖苷酶酶活測定按照文獻（張莉，王婧，楊婷。產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株紫外誘變選育及酶學性質分析。《食品工業科技》， 2015。）中的方法。

2）磷酸鹽誘導產酶培養

往產酶培養基中加入磷酸鈉，磷酸鈉的終濃度為2g/L。在無菌操作臺中，將黑曲霉菌種或篩選的轉化子接入已滅菌的斜面PDA培養基中，置于30℃恒溫培養箱中培養3d，得到斜面孢子。黑曲霉菌種或篩選的轉化子接入到誘導培養基中，接種量為 1×10⁵ 孢子/mL，150r/m、30℃培養培養36h，濾紙過濾，測定濾液β-葡萄糖苷酶的酶活。出發菌株的酶活為25U/mL，所篩選轉化子的酶活為7.8U/mL。這說明啟動子在磷酸鹽誘導下，啟動β-葡萄糖苷酶反義mRNA的轉錄，降低了β-葡萄糖苷酶的翻譯量，從而降低了其表達量。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業大學

<120> 一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑曲霉β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1346

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列

<400> 1

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<211> 110

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列

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<211> 214

<212> DNA

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<223> 終止子序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 1686

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> DNA序列1

<400> 4

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