一種原代培養背根神經節衛星膠質細胞的方法與流程

本發明屬于背根節衛星膠質細胞分離培養技術領域，尤其涉及一種體外原代培養背根神經節衛星膠質細胞的方法。

背景技術：

背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)的神經細胞是軀體感覺的初級傳入神經元，其中樞突進入脊髓發出上行纖維，與其它部位的神經元再次形成突觸連接，如和丘腦的神經元形成脊髓丘腦束等。這些神經元和上行纖維在感覺從外周到中樞的傳遞過程中起著重要的作用。衛星膠質細胞(satellite glial cels，SGCs)是外周神經中一種重要的神經膠質細胞，它們廣泛地分布于背根神經節(dorsal root ganglia，DRG)和三叉神經節(trigeminal ganglia，TG)內.衛星膠質細胞包繞1-2個神經元形成膠質細胞鞘，在兩個相鄰的衛星膠質細胞之間存在著縫隙連接，通過縫隙連接可以實現膠質細胞之間的交流。DRG-SGC的培養為研究神經系統發育過程中突起的生長發育機制和影響因素、神經元如何形成特殊的突觸聯系、如何構成極其復雜的神經網絡以執行各種生理功能等這些問題提供了良好的模型。因此，建立一種穩定的、高效的、高純度的DRG-SGCs體外原代培養模型具有重要意義。

目前國內研究多集中于從DRG中體外分離培養神經元，常用的方法是取大鼠脊髓背根神經節，用酶消化后制成單細胞懸液，建立體外背根神經節單細胞培養體系。例如禹曉東等人在“大鼠脊髓背根神經節神經元的純化培養”一文中取新生SD大鼠的脊髓背根神經節，采用胰蛋白酶消化法，制成單細胞懸液，加入阿糖胞苷以純化細胞，培養于含10％胎牛血清與重組人膠質細胞源性神經營養因子的DF12培養基中，觀察神經元生長狀況。李全波等人在“大鼠背根神經節神經元細胞純化培養的模型建立”以及譚洪毅等人在“體外獲得高純度大鼠背根神經節神經元的原代培養”中通過胰蛋白酶+EDTA消化DRG、交替使用DF-12培養基和加有阿糖胞苷抗有絲分裂的DF-12培養基培養等方法，在體外獲得純化的背根神經節神經元。張軍等人在“胚胎大鼠背根神經節神經元的培養與純化”，以及隋峰等人在“一種原代培養大鼠DRG神經元的新方法”中把DRG置于0.25％胰蛋白酶液中消化20min(37攝氏度)，加入胎牛血清(FBS)終止消化，然后在DMEM中制成單細胞懸液，經差速貼壁50min去除成纖維細胞，獲得大鼠背根神經節單細胞培養體。上述方法只能從DRG中體外分離培養神經元，但未能分離培養衛星膠質細胞。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明提供一種原代培養背根神經節衛星膠質細胞的方法，所述方法采用鼠的DRG組織，不需要經過消化過程，直接培養衛星膠質細胞，操作簡單，可獲得大量高度純化和穩定的背根節衛星膠質細胞，可作為發育神經生物學、神經生物學和臨床神經病學等研究的重要模型。

本發明的技術方案如下：一種原代培養背根神經節衛星膠質細胞的方法，所述方法操作如下：

步驟(1)將新生小鼠或大鼠消毒后斷頭處死，解剖后取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪開脊柱，在體視顯微鏡下清理血管和脊髓并取出DRG，剔除DRG上的神經纖維和被膜；

步驟(2)將處理好的DRG采用DRG-SGCs培養液培養，誘導大量的衛星膠質細胞從DRG中遷出，培養結束后進行細胞傳代，加入胰蛋白酶消化，然后加入FBS終止消化，采用巴氏吹吸管輕輕吹打后，轉移至離心管中進行離心；

步驟(3)離心后棄上清液，然后加入DRG-SGCs培養液繼續培養，得到衛星膠質細胞；

所述DRG-SGCs培養液成分包括DMEM/F12、B27、青霉素-鏈霉素雙抗、L-谷氨酰胺、BSA(牛血清白蛋白)、NRG1-β1(神經調節蛋白)、地塞米松、Insulin(胰島素)、T3(三碘甲狀腺氨酸鈉)和T4(四碘甲狀腺原氨酸)。

獲得高純度的衛星膠質細胞培養體系有利于特定細胞的生物學特點和細胞功能的研究。背根神經節包含豐富的神經元以及衛星膠質細胞、雪旺細胞和成纖維細胞，如何獲得豐富的衛星膠質細胞依然是背根神經節分離培養的難點之一。

為了獲得更純凈和更均勻的衛星膠質細胞，首先解剖時，分離出背根神經節后要完全剝離表面的包膜和周圍的神經絲，這不僅有效去除成纖維細胞和雪旺細胞，并且還有利于背根神經節的生長。其次培養時，在培養基中添加L-谷氨酰胺,L-谷氨酰胺不僅可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝，并且可以抑制其它細胞如神經元的生長。L-谷氨酰胺使成熟的神經元由于興奮性中毒死亡，而對膠質細胞起著促進生長的作用。無血清培養基和B27添加劑結合抑制成纖維細胞和雪旺細胞的分裂增殖并且選擇性的促進的衛星膠質細胞的存活，青鏈霉素防止培養過程中的細菌和真菌污染，人重組神經調節蛋白是一種細胞間信號轉導蛋白,在腦組織內由神經膠質細胞和神經元產生，它能促進膠質細胞存活、遷移、增殖。地塞米松、三碘甲狀腺原氨酸、L-甲狀腺素作為激素共同調節衛星膠質細胞的生長和增值，采用上述解剖方法和培養液，衛星膠質細胞的純化率可達到95％以上。

作為優選，每50mL DRG-SGCs培養液中DMEM/F12含量為46～48mL，B27含量為0.8～1.2mL，青霉素-鏈霉素雙抗含量為0.4～0.6mg，L-谷氨酰胺含量為0.4～0.6mg，BSA含量為15mg～20mg，NRG1-β1含量為1～1.2ug，地塞米松含量為1.8～2ug，Insulin含量為280～300ug，T3含量為0.5～0.6ug，T4含量為20～24ug。

作為優選，所述新生小鼠或新生大鼠為出生0～24小時的乳鼠。

目前用于背根神經節培養的動物包括雞，貓和成年鼠，而人類的背根神經節由于醫學倫理和有限資源很少使用。對于大鼠脊髓背根神經節的培養多采用孕14-20天胚胎大鼠，胚胎時期的背根節屬于較幼稚的階段，較成年大鼠易于成活，但也存在獲得細胞數量少，不易剝離神經節表面筋膜、導致成纖維細胞等雜質細胞多的缺點。在本發明中優選新生24小時內的乳鼠，背根節較胎鼠成熟，易于剝離表明的被膜，使得所需細胞的純度更高，且背根節還處于幼稚階段，也易獲得細胞。在分離背根神經節的過程中，當清理脊柱內的脊髓和血管時要注意動作輕柔且快，全程冰上操作。由于它們位于深處并且體積很小，分離有一些困難，而背根神經節的采樣時間是成功培養衛星膠質細胞的關鍵影響因素，只有減少采樣時間才可以保證培養細胞的活性。

本發明快速取出DRG的具體方法：

首先用眼科剪沿新生/胚胎大鼠的背部正中線剪開皮膚(從尾椎至頸椎),用游絲鑷子小心向兩側分離皮膚,暴露椎骨,此時椎管輪廓清晰可見。然后將新生/胚胎鼠移至體視顯微鏡下,用眼科剪沿椎管走向從尾椎至頸椎剪開椎骨,使脊髓充分暴露。然后用游絲鑷子輕輕將脊髓取出,清理剩余的脊膜組織,此時可見圓形或橢圓形神經節完全暴露。于體視顯微鏡下用游絲鑷子從椎間孔內將神經節逐個取出。

進一步地，步驟(2)將處理好的DRG接種在六孔培養板中，培養板內有DRG-SGCs培養液，每個孔接種8～11個背根節，然后在36～38℃，5％CO₂培養箱中培養。

進一步地，步驟(2)將處理好的DRG在培養過程中隨著DRG遷出的SGCs占據培養板底部85％以上時停止培養。

進一步地，步驟(2)將將處理好的DRG采用DRG-SGCs培養液連續培養一次后，再轉移至新的DRG-SGCs培養液中，再次誘導衛星膠質細胞從DRG中遷出。

進一步地，步驟(2)培養結束后加入2.5％胰蛋白酶消化2～4min，然后加入10％FBS終止消化。

進一步地，步驟(2)離心轉速為1000～1200rmp，離心時間為5～7分鐘。

本發明通過直接培養DRG，不需要經過消化過程，獲取DRG來源的衛星膠質細胞，隨著培養時間的延長衛星膠質細胞從背根神經節不斷地遷出，當細胞遷出到一定數量時，便可傳代。此方法不需要取多個DRG消化后培養，只需將一個完整的DRG直接置于本發明提供的衛星膠質細胞培養液中培養，即可誘導大量的衛星膠質細胞從DRG中遷出。并且把此DRG再次置于另一個放置有衛星膠質細胞培養液的培養板中，還可以再次誘導衛星膠質細胞從DRG中遷出。本發明方法培養出的衛星膠質細胞的優點在于遷出的衛星膠質細胞數量多，純度高，穩定存活，可傳代多代。

本發明還提供所述方法中采用的DRG-SGCs培養液，所述培養液適宜將誘導衛星膠質細胞從DRG中遷出，不需經過消化步驟。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明模擬衛星膠質細胞體內的生理環境，采用DRG組織原代分離培養方法建立新生大鼠DRG-衛星膠質細胞的分離培養體系，可得到高純度DRG-衛星膠質細胞純化培養體系。培養和純化的DRG-衛星膠質細胞體外可存活較長時間，純度高，穩定存活，可傳代多代，形成細胞網絡。體外培養條件下的DRG-衛星膠質細胞結構類似于體內的DRG-衛星膠質細胞，可作為發育神經生物學、神經生物學和臨床神經病學等研究的重要模型。

附圖說明

圖1為背根神經節圖；

圖2為衛星膠質細胞從背根節中遷出的形態圖；

圖3為衛星膠質細胞傳代后的形態學圖；

圖4免疫熒光細胞化學法鑒定衛星膠質細胞圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案做進一步詳細說明，但本發明并不局限于以下技術方案。

實施例1

1材料與方法

1.1實驗動物

出生0～24小時的SD新生大鼠購自昆明醫科大學實驗動物學部，本發明得到昆明醫科大學醫學倫理委員會批準。

1.2取DRG所需器械

體視顯微鏡、眼科顯微直鑷、眼科顯微彎鑷、小剪刀、大剪刀、扁平尖鑷、大小游絲鑷子。

1.3 DRG-SGC培養的主要試劑

DMEM/F12(1：1)培養基、B-27添加劑(50×)、雙抗(青霉素及鏈霉素溶液)、L-谷氨酰胺、BSA(30mg/mL)、地塞米松(25ug/mL)、牛胰島素Insulin(5mg/mL)購自biosharp公司；T3(10ug/mL)、T4(400ug/mL)、NRG-β1購自abcam公司、胎牛血清、0.25％胰酶均購自美國Life Technology公司；L-賴氨酸、PBS均購自美國Genview公司；

1.3新生大鼠DRG的分離及DRG-SGC的培養

一天齡的新生SD大鼠(購自昆明醫科大學實驗動物學部)在75％酒精消毒后3-5分鐘后斷頭處死，將大鼠背部朝上，左手持扁平尖鑷固定大鼠，右手持剪刀剪開背部皮膚和剪斷大鼠肋骨，取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪開脊柱，在體視顯微鏡下清理血管和脊髓，用眼科顯微鑷夾取DRG(見圖1)，剔除DRG上的神經纖維并剝離DRG表面的被膜，將處理好的DRG放入盛有DRG-SGC培養液(見表1)的培養皿中，最后將取好的DRG直接接種在六孔板，每個孔大約十個背根節，放入37℃、5％CO₂培養箱中培養。

表1 DRG-SGC培養液配方

1、在培養基中可以加入HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養基pH迅速變動。在開放式培養條件下，觀察細胞時培養基脫離了5％CO2的環境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。

2、可改變培養基中加入BSA的含量，在培養基中添加的BSA的含量范圍可在15～30mg。

3、培養基中也可不加入青鏈霉素雙抗，除第一次從大鼠取背根節培養時，為防止污染，培養基可選擇性加雙抗，培養一段時間后沒有污染可不加雙抗。

1.4 SGC的傳代培養和觀察

隨著DRG遷出的SGC占據培養皿底部85％以上時，將DRG轉移至另一個用多聚賴氨酸包被好的六孔板培養皿中，加入培養液放入培養箱培養。每個孔加入0.5mL 0.25％胰酶，37℃消化3-5分鐘，在顯微鏡下可觀察到最外圍的SGC漂浮起來。加入等體積的10％FBS終止消化，用巴氏吹吸管輕輕吹打10-15次，可觀察到細胞從板上吹打下來。將液體移入15mL的離心管，離心機1200rmp離心5-7分鐘，棄上清液，加入3mLDRG-SGCs培養液，移至放有爬片并包被好的24孔板(300ul/每孔)。放入37℃、5％CO₂培養箱中培養，隔天換液。在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態和生長狀況，經鑒定為衛星膠質細胞。

2結果

2.1原代培養背根節遷出衛星膠質細胞的生長狀況

當背根神經節在DRG-SGCs培養液中培養時，DRG黏附于含培養皿的底部，SGC從DRG周圍遷移出，隨培養時間的延長而增多。SGC圍繞DRG呈放射狀分布，SGC有突起生成。(見圖2)。

圖2中衛星膠質細胞從背根節中遷出的形態，隨著培養時間的延長，衛星膠質細胞遷出率越高，分別觀察的是背根節培養3天、7天、14天、21天時衛星膠質細胞的形態和遷出率。

2.2衛星膠質細胞傳代后的形態(見圖3)

圖3表示衛星膠質細胞傳代后的形態，細胞胞體飽滿，呈橢圓形，胞體兩極有突起生成，細胞間突起存在相互連接。

2.3免疫熒光細胞化學法鑒定衛星膠質細胞

免疫熒光染色檢測出傳代后衛星膠質細胞標記物GS和GFAP的陽性表達。提示傳代后的細胞為衛星膠質細胞，且純度達到了95％以上，見圖4。

圖4中第一排中，DAPI標記的是細胞的核，GS是衛星膠質細胞的特異性標記物，Merge是第一排前兩幅圖的合圖；第二排中，DAPI標記的是細胞的核，GFAP是膠質細胞的標記物，Merge表示的是第二排前兩幅的合圖。

綜上所述，實驗研究結果表明使用新生大鼠可獲得方便分離背根神經節且純度更高的衛星膠質細胞。鑒定測試表明，DRG-SGCs在體外維持對GFAP和GS免疫熒光陽性的膠質細胞形態。用該培養方法培養衛星膠質細胞純度高、純化細胞簡單、時間較短，并且背根節可多次傳代。該方法培養DRG-SGCs，為衛星膠質細胞相關的研究提供了依據，為相關疾病的研究提供了更有利的實驗基礎。