體外規模化培養臍帶間充質干細胞的方法與流程

本發明涉及一種干細胞培養的方法，尤其涉及一種臍帶間充質干細胞的培養方法，以實現體外規模化培養。

背景技術：

根據美國國立衛生研究院管理的臨床研究登記系統(Clinicaltrials.gov)數據顯示，截止至2016年5月，全球已登記的間充質干細胞臨床研究項目已有612項，其中中國有125項。世界已注冊MSCs的臨床試驗分析567項，除了用來促進恢復造血，與造血干細胞共移植提高白血病和難治性貧血等以外，還用于心腦血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、腦和脊髓神經損傷、老年癡呆及紅斑狼瘡和硬皮病等自身免疫性疾病的治療研究，已經取得的部分臨床試驗結果令人鼓舞。臍帶制備的間充質干細胞的臨床研究在國內外也已經廣泛開展，為了獲得足量高效的間充質干細胞滿足即將到來的臨床治療，臍帶間充質干細胞規模化生產已經勢在必行，但受到技術和科技水平的限制，從臍帶提取的間充質干細胞數量較少，提取后由于雜細胞含量高、細胞的數量級小等問題無法直接用于臨床和大量研究，對于臍帶間充質干細胞的安全高效擴增已經成為干細胞行業的研究熱點。

臍帶間充質干細胞具有免疫調控、造血支持、連續傳代和長期凍存后仍有自我復制和多向分化潛能等特點。在特定誘導條件下，可分化為多種組織細胞，可作為種子細胞用于組織器官損傷修復和抗衰老。但有關間充質干細胞的安全性存在一定的爭議，因此臍帶間充質干細胞是否具有致瘤型也是目前研究的熱點。

細胞離體后，失去了神經體液的調節和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態平衡相對穩定的環境中，易發生分化現象減弱；形態功能趨于單一化或生存一定時間后凋亡；或發生轉化獲得不死性，可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。因此，培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養后，這種差異就開始發生，為了減少體外培養的臍帶間充質干細胞分化、衰退、死亡和癌變等差異的影響，在培養的過程中應當嚴格控制時間。

根據國內外文獻報道臍帶間充質干細胞體外傳代培養染色體核型正常穩定，但也報道了最早發生變異的一例為第8代(中國優生與遺傳雜志，2012(10)：42～44)。其制備方法是將臍帶無菌條件下用PBS沖洗干凈，用剪刀剪細，放入培養瓶中，加入完全培養基(DMEM/F-12)培養，4天～5天后全量換液，棄去非貼壁細胞后每3天～4天半量換液，觀察細胞到80％融合時，胰酶消化傳代。

國家863計劃資助項目有研究采用膠原酶II消化法體外擴增3個代次(P3、P5、P7)臍帶間充質干細胞，通過三個代次細胞生長形態、染色體核型、免疫表型和誘導分化觀察體外連續傳代培養臍帶間充質干細胞染色體核型的穩定性(軍事醫學，2012，36(8)：599～602)。結果顯示，此法在體外擴增P7代內的間充質干細胞未發生染色體結構的異常改變，保持了正常人體二倍體核型，為臨床應用臍帶間充質干細胞提供了遺傳學的試驗依據。

康寧公司推出HYPERFlask^TM高密度細胞培養容器，其包括10層大小相同的培養片，每個培養片都經過康寧CellBIND^TM表層處理，細胞附著度和生長速度得到提升，每片還設有一個透氣良好的細胞生長層，各層空間設有空氣分隔帶，以達到最佳的氣體交換效果。10個生產層被連載一起，組成一個多層培養容器。該產品尺寸與標準T175培養瓶無異，采用新型多層設計使得培養細胞的數量是T175培養瓶的10倍。選用康寧新一代細胞培養容器，可顯著減少加工和處理耗時并降低對空間和廢棄處理的要求。

通過采用康寧HYPERFlask細胞培養瓶，能夠擴增生產大量用于研究的脂肪干細胞。脂肪干細胞在HYPERFlask細胞培養瓶中很容易擴增，并且具有類似成纖維細胞的形態，這一點和帶通氣蓋的T175培養瓶中培養的脂肪干細胞一樣。培養以后的脂肪干細胞流式細胞儀鑒定證明擴增后的間充質特征和多向分化潛能(中國醫藥生物技術，2015，V10(5)：466～468)。此報道讓臍帶間充質干細胞利用HYPERFlask多層培養瓶規模化擴增成為一種可能。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種培養臍帶間充質干細胞的方法，以實現在體外對間充質干細胞進行規模化培養。

一種體外規模化培養臍帶間充質干細胞的方法，包括如下步驟：

步驟一，清洗去大部分臍帶的殘留血液，并保留10v/v％～20v/v％的殘留未凝固血液；

步驟二，將臍帶制成2mm³～5mm³大小組織碎塊，并用0.2w/v％膠原酶II37℃消化，如：2小時；

步驟三，去除消化后的組織塊，加入洗脫液進行離心，離心采用四步法，分別為：首先10分鐘300r/min，然后15分鐘1800r/min，接著10分鐘1000r/min，以及最后10分鐘1000r/min，分離出未提純初代臍帶間充質干細胞；

步驟四，將5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²獲得的初代臍帶間充質干細胞接種于生長面積為55cm²的培養容器，培養體系為含有10w/v％胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培養基；

步驟五，待底層貼壁細胞融合80％以上后，利用含有胰蛋白酶和EDTA·4Na的Trypsin-EDTA溶液消化，消化分散后的細胞按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度傳代接種于生長面積148cm²培養容器，重復步驟四和步驟五傳代步驟4次直至獲得第4代細胞(記為：P4代)將第4代細胞按0.8×10⁷～1.2×10⁷個/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養容器(康寧公司，美國)中，生長面積為1720cm²；直至第五代細胞(記為：P5代)或者第六代細胞(記為：P6代)數量級達到10⁸以上終止培養；

步驟六，將P5或P6代按照慢凍的規則降溫并保存(如：ZENOAQ CELLBANKER 2使用手冊，置氣相液氮MVE罐中)，從制備到凍存時間嚴格控制在15天～25天之間；

步驟七，對生產出的間充質干細胞進行流式檢測CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、無菌檢測、支原體檢測和傳染病檢測，篩選出合格的臍帶間充質干細胞，建立可供檢索的干細胞細胞信息檔案，以備臨床和研究使用。

本發明的方法，步驟一中，使用緩沖液清洗去大部分臍帶的殘留血液，該緩沖液如：但不僅限于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，含有青霉素10萬單位/L和鏈霉素100mg/L。

本發明技術方案實現的有益效果：

與現有臍帶間充質干細胞的小規模培養方法相比，本發明提供的體外規模化培養臍帶間充質干細胞的方法：

按0.8×10⁷～1.2×10⁷個/瓶的濃度傳代到HYPERFlask細胞培養容器，根據細胞增殖特點、細胞生長體積提供生長最佳濃度，使試劑耗材可控制和臍帶間充質干細胞制備生產標準化。

臍帶間充質干細胞從進入制備周期到凍存時間嚴格控制在15天～25天，保證了臍帶間充質干細胞的生物原性和安全性，可控地獲得優質的產品。

在臍帶間充質干細胞P5、P6代終止培養，P5代、P6代細胞較完整地保存了干細胞的生物特性，同時將臍帶間充質干細胞的數量擴增至億以上，臍帶間充質干細胞在體外連續傳代培養控制在6代以內，以保證擴增細胞的染色體結構穩定，降低分化、衰退、死亡和癌變等的概率。

在臍帶間充質干細胞P5代、P6代采用康寧公司推出的多層細胞培養容器，培養面積可達1720cm²，多層的細胞培養容器具有透氣性的材料上在維持細胞貼壁生長的同時可進行氣體交換。所有的液體操作可通過瓶頸連接至所有的培養層，理想的生長表面采用康寧獨特的CeIIBIND培養表面，大大的提高了細胞的吸附性和生長速度，提高了細胞的產率。

附圖說明

圖1A為實施例1獲得P1代臍帶間充質干細胞規模培養細胞圖，圖中單個細胞呈纖維樣，視野明顯可見雜細胞；

圖1B為實施例1獲得P3代臍帶間充質干細胞規模培養細胞圖，圖中單個細胞呈纖維樣，整體呈流線型，細胞體積較P1代有所增大；

圖1C為實施例1獲得P5代臍帶間充質干細胞規模培養細胞圖，圖中單個細胞呈纖維樣，整體呈流線型，細胞體積較P3代有所增大；

圖2為實施例4獲得P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質干細胞的增殖曲線圖，圖中橫軸為細胞代數，縱軸為細胞數量；樣本1、樣本2和樣本3為三個平行細胞數量樣本隨著傳代變化；

圖3為實施例5的P5代臍帶間充質干細胞傳代后生長曲線，圖中橫軸為時間，縱軸為細胞計數；

圖4A為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液進行流式細胞儀檢測，而得陰性對照散點圖；

圖4B為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液進行流式細胞儀檢測，而得強表達散點圖；

圖5A為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液，進行流式細胞儀檢測而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105陰性對照圖；

圖5B為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液，進行流式細胞儀檢測而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105強表達曲線圖。

具體實施方式

以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。

本發明以下實施例所用實際和儀器詳見如下表1，其它所用的試劑若未經說明，均購自康寧(Corning)公司。

表1

實施例1

(1)按照國家規范采集足月嬰兒臍帶及臍帶血，酒精對臍帶進行消毒；

(2)用新鮮緩沖液(含有1.00v/v％青霉素/鏈霉素)清洗掉大部分殘留血液，保留10v/v％以上的殘留未凝固血液。利用儀器裝置進行碎化處理臍帶，獲得1mm³大小組織碎塊在低濃度膠原酶II環境下消化足夠時間；

(3)棄消化后殘剩組織塊，加入洗脫液采用四步離心法，分離出未提純原臍帶間充質干細胞，離心分離的參數分別為：300r/min10分鐘、1800r/min15分鐘、1000r/min10分鐘、1000r/min10分鐘；

(4)將獲得的初代臍帶間充質干細胞計數后按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²種于生長面積為55cm²的塑料培養容器，培養體系為含有10％FBS的LG-DMEM；

(5)待底層貼壁細胞融合80％以上，利用含有胰蛋白酶和EDTA·4Na的Trypsin-EDTA消化，消化分散后的細胞按2.0×10⁴/cm²-3.0×10⁴/cm密度傳代接種于生長面積148cm²培養容器，重復上述10％FBS的LG-DMEM體系培養步驟4次傳代直至P4代；

(6)將P4代細胞按1.0×10⁷/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養容器中，HYPERFlask培養容器生長面積為1720cm²，直至P5代臍帶間充質干細胞數量級達到億以上終止培養；

(7)將P5代或者P6代臍帶間充質干細胞按照慢凍的規則降溫，置氣態液氮中保存，從制備到凍存時間嚴格控制在15～25天之間；

(8)對生產出的間充質干細胞進行流式檢測CD34，CD45，CD73，CD90，CD105、無菌檢測、支原體檢測、傳染病檢測；

(9)篩選出合格臍帶間充質干細胞，建立可供檢索的干細胞細胞信息檔案(參見表2)，以備臨床和研究使用。

表2

實施例2，將實施例1中步驟(6)按1.0×10⁷/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養容器對照成按1.25×10⁷/瓶、1.0×10⁷/瓶、0.75×10⁷/瓶、0.5×10⁷/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養容器。

實施例3，將實施例1中步驟(6)接種于HYPERFlask培養容器對照成接種于HYPERFlask培養容器和普通細胞培養容器。

實施例4，將實施例1中步驟實驗于三個臍帶樣本，擴增至P5代。

實施例5，將實施例1中步驟實驗于三個臍帶樣本，取P5代細胞接種，每8小時計數，直至細胞完全融合后24小時。

取實施例1P1代、P3代和P5代細胞進行拍照，各代的細胞形態分別參見圖1A、圖1B和圖1C。

取實施例4的P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質干細胞的增殖情況進行驗證(參見圖2)，由圖2可見，隨著傳代代數的增加，細胞數量呈倍數增加。

取實施例5的臍帶間充質干細胞繪制生長曲線，由圖3可見，細胞按照2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm傳代，經過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過24小時左右的潛伏期，即進入大量分裂的指數生長期，在細胞48小時左右完全融合，進入平定期細胞基本不再分裂。細胞經過了虛弱潛伏期和旺盛指數生長期，在平頂期初消化傳代，無需額外進行更換完全培養基，節約了培養基。

不同傳代濃度接種于HYPERFlask培養容器性狀對比

實施例2細胞分別按1.25×10⁷/瓶、1.0×10⁷/瓶、0.75×10⁷/瓶、0.5×10⁷/瓶四種濃度進行傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞的貼壁時間，細胞形態，折光性，融合時間和細胞活率的差別等詳見表3，接種密度越小，融合時間越長，過長的融合時間會出現邊緣模糊、白色絮狀物、空泡等老化現象。

表3

普通細胞培養容器與HYPERFlask培養容器特性比較

實施例3細胞1.0×10⁷個分別接種到HYPERFlask培養容器和普通細胞培養容器(148cm²細胞培養皿)，普通細胞培養容器相對HYPERFlask培養容器需要消耗更多的數量，消化時間更長，酶消耗增加，空間占據大，均一較性較差，結果詳見表4。

表4

臍帶間充質干細胞表面標志性抗原檢測

取實例一HYPERFlask細胞培養容器內P5代細胞，制成細胞懸液，流式細胞儀檢測CD34、CD45、CD73、CD90和CD105等5個表面標記物(參見圖4A和圖4B)。用流式分析軟件Flow Jo進行分析，P5或P6收獲時，強表達標記細胞達95％以上，不表達細胞小于2％(參見圖5A和圖5B)。