1.抗除草劑海帶孢子體的制備方法,具體步驟如下:
(1)選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細胞團,研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團,細胞密度在5×105-2×106個/mL,轉化時用60mm的無菌培養皿,將雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部,形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈;
(2)轉化載體的來源和質粒DNA的提取,用生工生物小量DNA提取試劑盒提取質粒pBA002-Bar的DNA,用以基因槍轟擊后的共培養和目標基因的轉化;
(3)基因槍操作技術過程:擋網與材料間距3cm時轟擊,轟擊壓力為1100psi;
(4)共培養與基因轉化:向轟擊后的品系13號的雌配子體細胞加入步驟(2)中提取的質粒pBA002-Bar的DNA,在11-13℃條件下共培養48小時;然后加入質量濃度為40mg/L的草丁膦,連續培養三周,篩選出轉化的雌配子體細胞;
(5)抗除草劑海帶孢子體的獲得:將抗除草劑的雌配子體與同型非轉化體雄配子體細胞進行共培養獲得交雜孢子體細胞,經過連續11-13℃低溫條件培養,獲得抗除草劑的孢子體;
抗除草劑海帶孢子體共培養和低溫培養的營養液的組成:滅菌海水中添加NaNO3和KH2PO4,滅菌海水中NaNO3的終濃度為8-12mg/L,滅菌海水中KH2PO4的終濃度為0.8-1.1mg/L。
2.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(1)中選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細胞團,研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團,細胞密度在1×106個/mL。
3.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(4)中向轟擊后的品系13號的雌配子體細胞加入步驟(2)中提取的質粒pBA002-Bar的DNA,在12℃條件下共培養48小時。
4.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(5)中將抗除草劑的雌配子體與同型非轉化體雄配子體細胞進行共培養獲得交雜孢子體細胞,經過連續12℃低溫條件培養。
5.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(5)中滅菌海水中NaNO3的終濃度為10mg/L,滅菌海水中KH2PO4的終濃度為1.0mg/L。
6.如權利要求1-5任一項所述制備方法制備的抗除草劑海帶孢子體。
7.抗除草劑的海帶幼小種苗的培育方法,具體步驟如下:
(1)將如權利6所述除草劑海帶孢子體的幼胚置于培養液中進行培養;培養液的組成為:滅菌海水中添加NaNO3和KH2PO4,滅菌海水中NaNO3的終濃度為8-12mg/L,NaNO3與KH2PO4的質量比為10:0.8-1.1;培養條件為每兩天更換一次培養液,11-12℃低溫光照培養箱培養,光照強度為800Lux,培養8-10天,光照培養與暗培養的時間比例為14小時:10小時;
(2)對抗除草劑的海帶幼小種苗進行培養,同時進行PCR檢測,實施10mg/L、20mg/L、40mg/L梯度條件下的除草劑篩選,測試轉化的幼小種苗對除草劑草丁膦的耐性,建立完整的海帶抗除草劑孢子體細胞無性繁殖體系。
8.根據權利要求7所述的培育方法,其特征在于,所述步驟(1)中滅菌海水中NaNO3的終濃度為10mg/L。
9.根據權利要求7所述的培育方法,其特征在于,所述步驟(1)中NaNO3與KH2PO4的質量比為10:1。