生物法制備16,17α?環氧黃體酮的方法與流程

本發明涉及甾體類藥物中間體的生產方法，具體來說是利用微生物發酵3-羥基-5烯-16,17α-環氧物制備16,17α-環氧黃體酮的方法。

背景技術：

16,17α-環氧黃體酮作為中間體應用于幾乎所有甾體激素包括地塞米松、倍他米松、6α-甲基氫化潑尼松、潑尼松、氫化潑尼松等產品的制造。甾體激素類藥物是僅次于抗生素的一類重要藥物，具有抗炎、抗免疫、避孕、抗癌、調節內分泌等多種作用,廣泛應用于風濕、心血管病、膠原性病癥、淋巴白血病、人體器官移植、細菌性腦炎、皮膚病、內分泌失調、老年性疾病、激素依賴性腫瘤等疾病的治療。

目前16,17α-環氧黃體酮的制備方法，國內外報道均采用傳統的化學法制造，化學反應路線如下所示：

環氧反應

Oppenauer氧化

以雙烯孕酮醋酸酯為原料經雙氧水氧化形成3-羥基-5烯-16,17α-環氧物，通過Oppenauer氧化使3-羥基-5烯轉變成3-酮-4烯結構，再經水蒸汽蒸餾、萃取、濃縮、精制等最終獲得16,17α-環氧黃體酮。該工藝水平的限制性因素在于Oppenauer氧化的有效反應較低，造成了反應過程副產物多，影響了轉化率和收率，目前，投入100Kg雙烯孕酮醋酸酯,僅能獲取70～73Kg 16,17α-環氧黃體酮，再加上，傳統化學工藝使用大量的有機溶劑、反應條件劇烈，而且不得不采用水蒸汽蒸餾裝置，造成能耗大、排放高，致使16,17α-環氧黃體酮的Oppenauer氧化反應已成為整個甾體藥物工業發展的瓶頸，因此提供一種能夠提高16,17α-環氧黃體酮收率，并且反應溫和、能夠實現綠色制造的方法已成為亟待解決的問題。

技術實現要素：

本發明就是提供一種反應條件溫和、綠色環保，并且能夠提高16,17α-環氧黃體酮收率的微生物發酵3-羥基-5烯-16,17α-環氧物制備16,17α-環氧黃體酮的方法。

本發明的反應路線如下：

生物法制備17α-環氧黃體酮的方法，以3-羥基-5烯-16,17α-環氧物為底物，經簡單節桿菌Arthrobacter simplex AS1.94一步發酵制備16,17α-環氧黃體酮。本發明的簡單節桿菌Arthrobacter simplex AS1.94來自中國科學院微生物研究所。

所述的生物法制備16,17α-環氧黃體酮的方法，1L水中,發酵培養基還含有以下成分：葡萄糖10～15g,酵母提取物3～5g，玉米漿30～40g，磷酸二氫鉀0.8～1.2g，泡敵0.1～0.3g。

所述的生物法制備16,17α-環氧黃體酮的方法，1L水中,發酵培養基由以下成分組成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米漿30g，磷酸二氫鉀0.8g，泡敵0.1g。

所述的生物法制備16,17α-環氧黃體酮的方法，發酵培養基的初始pH5.8～8.0。

所述的生物法制備16,17α-環氧黃體酮的方法，簡單節桿菌的接種量為10～15％。

所述的生物法制備16,17α-環氧黃體酮的方法，簡單節桿菌的接種量為10％。

本發明的簡單節桿菌Arthrobacter simplex AS1.94通過常規的斜面培養和種子培養，得到轉化或發酵用菌。

斜面培養

斜面培養基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，瓊脂粉20g/L。

培養條件：33±1℃

培養時間：48h

種子培養

種子培養基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米漿12g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L。

無菌生理鹽水洗斜面培養物，制成菌懸液，菌體濃度大于1.0×108CFU/ml，2.5m³種子罐，接種量1％，轉速120r/min，通風1:0.5。種子罐壓力0.05MPa，培養時間22h。

所述的生物法制備16,17α-環氧黃體酮的方法，1L水中，發酵底物3-羥基-5烯-16,17α-環氧物2.5g，發酵培養基由以下成分組成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米漿30g，磷酸二氫鉀0.8g，泡敵0.1g，在通風機械攪拌發酵罐中配置發酵液，調節初始pH 5.8，蒸汽滅菌，冷卻至33±1℃，按照10％接種量在無菌條件下接種種子培養液于發酵罐的發酵液中，發酵罐轉速80r/min，通風量1:0.5，培養時間72h，轉化完畢，90℃發酵液滅活，冷卻到室溫，板框壓濾，濾餅用乙酸乙酯提取，濃縮，得到白色晶體，即16,17α-環氧黃體酮。

本發明的有益效果：與傳統的化學法制備16,17α-環氧黃體酮相比較，本發明提供的一種生物法制備16,17α-環氧黃體酮的方法具有以下優點，

1)本發明以3-羥基-5烯-16,17α-環氧物為底物，利用簡單節桿菌生物發酵制備16,17α-環氧黃體酮，反應條件溫和，發酵過程中不使用危險化學品原料，如異丙醇鋁、環己酮、甲苯等，實現了16,17α-環氧黃體酮的綠色制造。

2)本發明簡單節桿菌生物發酵制備16,17α-環氧黃體酮的方法，所得16,17α-環氧黃體酮的收率大于90％，純度大于98.5％，而傳統的化學法，在相同的純度下，16,17α-環氧黃體酮的收率僅為70～73％。

附圖說明：

圖1所示為本發明制備的16,17α-環氧黃體酮結構紫外光譜鑒定；

圖2所示為本發明制備的16,17α-環氧黃體酮結構紅外光譜鑒定；

圖3所示為本發明制備的16,17α-環氧黃體酮ESI-MS質譜圖；

圖4所示為本發明制備的16,17α-環氧黃體酮核磁共振H譜；

圖5所示為本發明制備的16,17α-環氧黃體酮核磁共振C譜。

具體實施方式：

為了更好地理解本發明，下面將通過實施例對本發明作進一步的描述，這些描述并不是對本發明內容作進一步的限定。相關技術人員應理解，對本發明的技術特征所作的等同替換，或相應的改進，仍屬于本發明的保護范圍之內。

實施例1

本發明的簡單節桿菌Arthrobacter simplex AS1.94來自中國科學院微生物研究所，通過斜面培養和種子培養，得到轉化或發酵用菌。

斜面培養

斜面培養基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，瓊脂粉20g/L。

培養條件：33±1℃

培養時間：48h

種子培養

種子培養基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米漿12g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L。

無菌生理鹽水洗斜面培養物，制成菌懸液，菌體濃度大于1.0×108CFU/ml，2.5m³種子罐，接種量1％，轉速120r/min，通風1:0.5。種子罐壓力0.05MPa，培養時間22h。

按照1L水中，發酵底物3-羥基-5烯-16,17α-環氧物2.5g，1L水中,發酵培養基由以下成分組成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米漿30g，磷酸二氫鉀0.8g，泡敵(消泡劑GPE，江蘇斯德瑞克化工有限公司)0.1g，在25m³的通風機械攪拌發酵罐中配置18m³發酵液，調節初始pH 5.8，常規濕熱蒸汽滅菌，冷卻至33±1℃，按照10％接種量在常規無菌條件下接種種子培養液于25m³發酵罐的發酵液中。發酵罐轉速80r/min，通風量1:0.5，培養時間72h，取樣，TLC分析,底物轉化完全,樣品用乙酸乙酯萃取,將上層乙酸乙酯常壓濃縮或揮發至干，HPLC法測定轉化結果，3-羥基-5烯-16,17α-環氧物含量1.2％，16,17α-環氧黃體酮含量98.2％，其它物質含量0.6％。

轉化完畢，90℃發酵液滅活，冷卻到室溫，板框壓濾，濾餅用乙酸乙酯提取，濃縮，得到白色晶體，粗品收率98.5％，16,17α-環氧黃體酮含量98.7％。

所得白色晶體，經紫外光譜、紅外光譜、ESI-MS質譜、核磁共振H譜、核磁共振C譜鑒定，為16,17α-環氧黃體酮(如說明書附圖所示)。

實施例2

斜面、種子培養方法如實施例1所述。

按照1L水中，發酵底物3-羥基-5烯-16,17α-環氧物2.5g，發酵培養基組分和重量為葡萄糖12g,酵母提取物4g，玉米漿35g，磷酸二氫鉀1.0g，泡敵(消泡劑GPE，江蘇斯德瑞克化工有限公司)0.2g的比例在25m³的通風機械攪拌發酵罐中配置18m³發酵液，調節初始pH 6.7，常規濕熱蒸汽滅菌，冷卻至33±1℃，按照12％接種量在常規無菌條件下接種種子培養液于25m³發酵罐的發酵液中。發酵罐轉速80r/min，通風量1:0.5，壓力0.05MPa，培養時間72h，取樣，TLC分析,底物轉化完全,樣品用乙酸乙酯萃取,將上層乙酸乙酯常壓濃縮或揮發至干，HPLC法測定轉化結果，3-羥基-5烯-16,17α-環氧物含量1.4％，16,17α-環氧黃體酮含量97.8％，其它物質含量0.8％。

轉化完畢，90℃發酵液滅活，冷卻到室溫，板框壓濾，濾餅用乙酸乙酯提取，濃縮，得到白色晶體，粗品收率98.8％，16,17α-環氧黃體酮含量98.5％。

所得白色晶體，經紫外光譜、紅外光譜、ESI-MS質譜、核磁共振H譜、核磁共振C譜鑒定，為16,17α-環氧黃體酮(如說明書附圖所示)。

實施例3

斜面、種子培養方法如實施例1所述。

按照1L水中，發酵底物3-羥基-5烯-16,17α-環氧物2.5g，發酵培養基組分和重量為葡萄糖15g,酵母提取物5g，玉米漿40g，磷酸二氫鉀1.2g，泡敵(消泡劑GPE，江蘇斯德瑞克化工有限公司)0.3g的比例在25m³的通風機械攪拌發酵罐中配置18m³發酵液，調節初始pH8.0，常規濕熱蒸汽滅菌，冷卻至33±1℃，按照15％接種量在常規無菌條件下接種種子培養液于25m³發酵罐的發酵液中。發酵罐轉速80r/min，通風量1:0.5，種子罐壓力0.05MPa，培養時間72h，取樣，TLC分析,底物轉化完全,樣品用乙酸乙酯萃取,將上層乙酸乙酯常壓濃縮或揮發至干，HPLC法測定轉化結果，3-羥基-5烯-16,17α-環氧物含量1.8％，16,17α-環氧黃體酮含量97.5％，其它物質含量0.7％。

轉化完畢，90℃發酵液滅活，冷卻到室溫，板框壓濾，濾餅用乙酸乙酯提取，濃縮，得到白色晶體，粗品收率97.8％，16,17α-環氧黃體酮含量98.7％。

所得白色晶體，經紫外光譜、紅外光譜、ESI-MS質譜、核磁共振H譜、核磁共振C譜鑒定，為16,17α-環氧黃體酮(如說明書附圖所示)。

盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。