本領域屬于微生物及發酵工程技術領域，具體涉及一株發酵生產(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
乙偶姻(acetoin)，又名3-羥基-2-丁酮(3-hydroxybutanone)，是一種重要的天然香料，在白酒、蜂蜜、草莓、黃油等物質中都存在。由于手性碳原子的存在，乙偶姻具有兩種立體異構體，(3r)-乙偶姻和(3s)-乙偶姻。單一的乙偶姻異構體在不對稱合成領域具有廣泛用途，可作為藥物合成的中間體，也可用于合成具有光學活性的α-羥基酮類衍生物。
乙偶姻的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法。根據國標的規定，化學法合成得到的乙偶姻為合成香料，微生物發酵法獲得的乙偶姻屬于天然香料，二者的市場價格存在巨大差距。而且，化學合成的乙偶姻為外消旋混合物，而微生物發酵法可以獲得以某一異構體為主的產物，所以近年來微生物發酵法生產乙偶姻的研究頗受關注。
自然界可產乙偶姻的微生物很多，其中產量較高且生物安全的菌種主要有芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌。總所周知，天然菌株具有遺傳性能穩定的特點，工業上用的菌種大部分都是天然菌種或是自然突變篩選得到的菌種。因此，近年來發酵法生產乙偶姻的研究主要集中于天然菌株的篩選及其改造，目標以提高乙偶姻總產量為主，而單一構型乙偶姻的生產研究較少。以葡萄糖為碳源，利用生物安全的天然菌株或基因工程改造菌株發酵乙偶姻時高產菌株的乙偶姻產量通常在70g/l以上。例如，b.amyloliquefaciense-11發酵可產71.5g/l乙偶姻，生產強度1.63g/(l·h)(processbiochem.2014,49：1223–1230)；2,3-丁二醇脫氫酶過表達的b.subtilisjna3-10發酵可產73.6g/l乙偶姻，生產強度為0.77g/(l·h)(plosone2014,9(3):e91187)。但是所述菌株生產的乙偶姻為兩種構型的混合物，目前還沒有能夠發酵生產高純度、高含量單一構型乙偶姻的天然菌株。
在單一構型乙偶姻的生產方面，已有一些基因改造菌或人工構建的大腸桿菌基因工程菌發酵的相關專利，例如cn101565685b、cn102296094b、cn103388009b。這些菌生產的單一構型的乙偶姻濃度不高，普遍低于40g/l。2015年xu等發文報道了一株人工構建的大腸桿菌基因工程菌，將來自serratiamarcescens的budrab基因和lactobacillusbrevis的nadh氧化酶基因導入大腸桿菌，(3r)-乙偶姻的最高濃度為60.3g/l，立體異構體純度為97.3％(j.chem.technol.biotechnol.2015,90:93–100)，但這些菌株均為基因工程菌，存在遺傳性不穩定的缺點。
綜上所述，目前缺少產單一構型乙偶姻的天然菌株，獲得產高濃度、高立體異構體純度的乙偶姻的天然生物安全菌株對于工業化生產具有重要意義。
技術實現要素：
鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一株高產(3r)-乙偶姻的天然菌株。
本發明提供一株高產(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11，已于2016年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國科學院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，菌株dl11-11的保藏號為cgmccno.13141。
本發明以來自大連海域的海泥為土樣，從中篩選到一株產(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌，再經乙偶姻馴化，最終得到一株高產(3r)-乙偶姻的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11，利用該菌株發酵生產高純度(3r)-乙偶姻，發酵液中(3r)-乙偶姻純度高達96.5％，(3r)-乙偶姻生產強度達到1.1g/(l·h)，乙偶姻總濃度最高可達78.7g/l。
枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11具有下述性質：
1、菌落形態學特征：在lb營養瓊脂上，37℃培養24h出現直徑為1.5～2.5mm的菌落，菌落呈圓形、光滑、透明；繼續培養至48h，菌落直徑增加至6～8mm，表面透明、光滑，邊緣不整齊；繼續培養，菌落逐漸變呈白色，表面變得粗糙、干燥，中央凸起有褶皺。
2、生理與生化特性：a.革蘭氏染色陽性，產芽孢，好氧；b.耐較高濃度的葡萄糖和氯化鈉；c.培養溫度：25～39℃，最適溫度為37℃；d.可在ph5.5～7.2范圍內生長。
3、菌種16srdna鑒定：經過對該菌的16srdna序列的測定，通過與ncbi數據庫比對，結果顯示與已知芽孢桿菌屬的同源性大于99％，結合生理生化特性鑒定該菌為枯草芽孢桿菌。
本發明還提供利用所述的枯草芽孢桿菌dl11-11發酵生產(3r)-乙偶姻的方法，其具體的步驟為：將菌株接種于種子培養基，37℃搖床培養12～20h，然后接種于含碳源、氮源和無機鹽的發酵培養基中發酵生產(3r)-乙偶姻。其中，所述種子培養基含有20～40g/l葡萄糖、0.5～1.5g/l酵母粉、2～6g/l(nh4)2hpo4、2～8g/lk2hpo4、0.05～0.2g/lmgso4。發酵培養基的碳源為葡萄糖或糖蜜，其濃度為100～180g/l，優選120～140g/l；氮源包括有機氮源和無機氮源，其中的有機氮源為玉米漿干粉、酵母粉、蛋白胨中的一種或幾種，其濃度為1～5g/l，優選1.5～3g/l，無機氮源為硫酸銨、磷酸氫二銨、尿素中的一種或幾種，濃度為3～15g/l，優選5～10g/l；無機鹽為磷酸鹽和硫酸鹽中任意一種或幾種，其中磷酸鹽的濃度為1～10g/l,優選2～8g/l；硫酸鹽的濃度為0.05～5g/l，優選0.2～1g/l。
在上述利用菌株dl11-11發酵生產(3r)-乙偶姻的方法中，所述的發酵生產條件為：菌株種子培養液的接種量5～20％(v/v)，優選10～15％(v/v)；發酵初始ph為5.5～7.2，優選6.5～7.0；通氣量0.15～0.35vvm，優選0.2～0.3vvm；發酵溫度30～39℃，優選35～38℃；培養時間55～80h，優選58～72h。
本發明的有益效果：
1)本發明的菌株dl11-11為枯草芽孢桿菌，屬于生物安全菌種，該菌從海泥中篩選得到，屬于天然菌株，具有遺傳穩定性高、不易丟失的優點，有利于工業化應用。
2)本發明篩選到的菌株dl11-11生產(3r)-乙偶姻時發酵液中(3r)-乙偶姻的立體異構體純度達96.5％，(3r)-乙偶姻濃度達到63.8g/l，生產強度達到1.1g/(l·h)，目前還沒有如此高立體異構體純度、產物濃度和生產強度的產(3r)-乙偶姻的天然生物安全菌株。
3)本發明篩選到的菌株dl11-11也可用于生產乙偶姻，其濃度高于已知的天然菌株。
4)本發明篩選到的菌株dl11-11在發酵過程中所需的通氣量為0.15～0.35vvm，遠低于常規枯草芽孢桿菌1.0vvm左右的通氣量，降低了設備需求，有利于工業化。
附圖說明
圖1為利用菌株dl11-11發酵生產(3r)-乙偶姻58小時時發酵液的氣相色譜圖。按照出峰先后順序，圖中的5個峰依次為：溶劑、內標、(3r)-乙偶姻(10.156min)、meso-2,3-丁二醇(11.278min)、(3s)-乙偶姻(12.421min)。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用試劑等均可從化學或生物試劑公司購買。
以下結合技術方案詳細敘述本發明的具體實施方式。
以下實施例中使用的分析方法如下：
乙偶姻采用agilent7890agc分析，gc條件為：氫火焰檢測器220℃，進樣口溫度210℃，載氣n2，程序升溫。色譜柱：bgb-174,30m×0.25mmi.d.0.25μmdf(p/n:27430-025)。發酵液中葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀(sba-50，山東省科學院生物研究所)分析。
以下實施例中采用的種子培養基和發酵培養基如下：
種子培養基：葡萄糖40g/l；酵母粉1.5g/l；(nh4)2hpo46g/l；k2hpo48g/l；mgso40.2g/l；微量元素溶液3ml(feso40.4g/l；mncl2·4h2o5g/l；znso4·7h200.1g/l；h3bo30.8g/l；cuso4·5h2o0.04g/l；namoo4·2h2o0.04g/l；cocl2·6h2o0.06g/l；cacl20.75g/l)；ph7.0。
發酵培養基：葡萄糖120g/l；酵母粉1.5g/l；(nh4)2hpo49g/l；k2hpo48g/l；mgso40.2g/l；微量元素溶液3ml(組成同種子培養基)；ph7.0。
種子培養基與發酵培養基均在115℃高壓滅菌鍋中滅菌15min，且葡萄糖與無機鹽分開滅菌。
實施例1菌株的篩選
從遼寧省大連市黑石礁、星海公園、金石灘等地區采集海泥樣品。將上述樣品分別加入到無菌水中，快速攪拌并自然沉降10min，然后取上清液接入上述種子培養基中進行富集培養，37℃、200rpm搖瓶培養72h。對培養液進行梯度稀釋，涂布到添加瓊脂的上述種子培養基平板上，在37℃培養24h。挑取單菌落，分別接種到上述發酵培養基中，在37℃搖瓶培養48h，氣相色譜檢測產物，得到一株產(3r)-乙偶姻的菌株。該菌株用含10g/l乙偶姻的發酵培養基進行馴化，37℃、200rpm搖瓶培養24h，然后梯度稀釋涂布到添加瓊脂的上述種子培養基平板上，在37℃培養24h。挑取單菌落，分別接種到上述發酵培養基中進行復篩，其中高產的菌株經多次劃線分離純化得到純的菌株，命名為dl11-11。采用斜面傳代法、低溫甘油法等常規方法保存備用。
實施例2菌株的鑒定
將實施例1得到的菌株dl11-11生理生化檢驗結果如下：
1、菌落形態學特征：在lb營養瓊脂上，37℃培養24h出現直徑為1.5～2.5mm的菌落，菌落呈圓形、光滑、透明；繼續培養至48h，菌落直徑增加至6～8mm，表面透明、光滑，邊緣不整齊；繼續培養，菌落逐漸變呈白色，表面變得粗糙、干燥，中央凸起有褶皺。
2、生理與生化特性：a.革蘭氏染色陽性，產芽孢，好氧；b.耐較高濃度的葡萄糖和氯化鈉；c.培養溫度：25～39℃，最適溫度為37℃；d.可在ph5.5～7.2范圍內生長。
3、菌種16srdna鑒定：經過對該菌的16srdna序列的測定，通過與ncbi數據庫比對，結果顯示與已知芽孢桿菌屬的同源性大于99％，結合生理生化特性鑒定該菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。
枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dl11-11，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmcc-no.13141。
實施例3利用菌株dl11-11發酵生產(3r)-乙偶姻
將保存于20％甘油的菌株dl11-11菌液按2.5％接種于lb培養基中進行活化培養，37℃、200rpm搖床培養12h。將活化菌種按2％接種于種子培養基中，37℃、200rpm搖床培養12h。將200ml液體種子接種于含1.8l發酵培養基的5l機械攪拌發酵罐中進行批式補料發酵，溫度37℃，轉速250rpm，通氣0.2vvm，ph自動降至ph5.9后維持恒定，在34小時補葡萄糖200g，58h發酵結束。發酵液含2,3-丁二醇8.6g/l，(3r)-乙偶姻63.8g/l，(3s)-乙偶姻2.3g/l，(3r)-乙偶姻的立體異構體純度為96.5％(氣相色譜圖見圖1)，生產強度為1.1g/(l·h)。
實施例4利用菌株dl11-11發酵生產乙偶姻
將保存于20％甘油的菌株dl11-11菌液按2.5％接種于lb培養基中進行活化培養，37℃、200rpm搖床培養12h。將活化菌種按2％接種于種子培養基中，37℃、200rpm搖床培養12h。將200ml液體種子接種于含1.8l發酵培養基的5l機械攪拌發酵罐中進行批式補料發酵，溫度37℃，轉速250rpm，通氣0.2vvm，ph自動降至ph5.9后維持恒定，在34h、58h分別補加葡萄糖200g和108g，72h發酵結束。發酵液含2,3-丁二醇12.4g/l，(3r)-乙偶姻為70.9g/l，乙偶姻總濃度為78.7g/l，生產強度為1.09g/(l·h)。