DMD基因捕獲探針及其在DMD基因突變檢測中的應用的制作方法

本發明涉及生物
技術領域：
中，DMD基因捕獲探針及其在DMD基因突變檢測中的應用。
背景技術：
：DMD基因是假肥大型肌營養不良綜合征致病基因(DMD/BMD)，位于X染色體Xp21.2區域，是目前已知的最大的人類基因，含有79個外顯子，基因突變概率較高，在新生兒男嬰中達到約1:3500。DMD基因含有多種突變類型，單個或多個外顯子缺失突變最為常見，約占60～70％，單個或多個外顯子重復擴增突變，約占5～10％，點突變包括單個或數個核苷酸置換、缺失或插入等，約占DMD所有突變的25％～35％。DMD基因龐大，突變發生率高，突變類型多樣，各種各樣的突變加在一起據統計達到四、五千種之多，這就給臨床上DMD基因檢測帶來了很大的困難。傳統的DMD基因突變檢測方法，對于不同的突變類型需要選擇不同的檢測技術，對于點突變，需要應用Sanger測序進行檢測，對于外顯子重復或缺失突變，需要應用微陣列比較基因組雜交技術(a-CGH)、MLPA或多重PCR等技術進行檢測，上述檢測策略和方法檢測效率低，而且不能確定外顯子缺失的精確位點與片段大小，因此，本領域需要能同時檢測DMD多種突變類型的更準確和效率更高的方法。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何檢測DMD基因全基因的突變。為解決上述技術問題，本發明首先提供了DMD基因捕獲探針。所用DMD基因的序列為人類參考基因組版本Hg19(更新日期為2015年8月6日)的chrX:31137345-33357726。本發明所提供的DMD基因捕獲探針，按照捕獲探針的制備方法制備，所述捕獲探針的制備方法包括：制備N個亞探針，連接所述N個亞探針，得到DMD基因捕獲探針；N為大于等于2的一個自然數；所述N個亞探針滿足所述N個亞探針能覆蓋所述DMD基因的全部序列。上述DMD基因捕獲探針中，所述亞探針均可為單鏈DNA。上述DMD基因捕獲探針中，在所述DMD基因上任何兩個相鄰的亞探針均可滿足上游亞探針的下游有一個或多個核苷酸與下游亞探針的上游重疊。在所述DMD基因上任何兩個相鄰的亞探針具體均可滿足上游亞探針的下游有3個核苷酸與下游亞探針的上游重疊。上述DMD基因捕獲探針中，所述N個亞探針的長度均可為50-150bp。所述N個亞探針的長度具體均可為60bp。所述N個亞探針可為38954個亞探針。上述DMD基因捕獲探針中，所述N個亞探針的序列均可滿足：第1條亞探針的序列為DMD基因的第1-60位；第2條亞探針的序列為DMD基因的第58-117位；第3條亞探針的序列為DMD基因的第115-174位；……第n條亞探針的序列為DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位；……第38953條亞探針的序列為DMD基因的第2220265-2220324位；第38954條亞探針的序列為DMD基因的第2220322-2220381位；其中，n為1-38954中的任一個自然數。上述DMD基因捕獲探針中，所述連接所述N個亞探針可包括下述A1)和A2)：A1)連接所述N個亞探針，得到長鏈DNA和/或環狀DNA；A2)將所述長鏈DNA和/或所述環狀DNA進行擴增，得到所述DMD基因捕獲探針。所述制備方法在連接所述N個亞探針前還可包括對所述N個亞探針進行磷酸化修飾。對所述N個亞探針進行磷酸化修飾具體可為在所述N個亞探針的5′端進行磷酸化修飾。所述磷酸化修飾可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進行所述磷酸化修飾的反應體系可為：所述N個亞探針10μl、10×反應緩沖液5μl、10mMATP5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H2027.5μl。所述反應體系中所述N個亞探針的濃度可為5ng/μl。所述反應體系中10×反應緩沖液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均為NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑。所述磷酸化修飾的反應條件可為37℃30min。所述連接所述N個亞探針可利用ssDNA連接酶或epicentre的ssDNA連接試劑盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)進行。所述連接的反應體系可為：所述N個亞探針的磷酸化產物或所述N個亞探針20μl、CircLigaseII10×ReactionBuffer5μl、50mMMnCl22.5μl、5MBetaine10μl、CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5μl和H2O10μl。所述連接的反應條件可為60℃60min。步驟A2)中，在進行將所述長鏈DNA或所述環狀DNA進行擴增時還可包括利用生物素對擴增產物進行標記。進行所述擴增可采用隨機引物進行。所述隨機引物可為由A、C、G和T這四個核苷酸隨機組成的長度均為6bp的46條單鏈DNA所形成的混合物。所述隨機引物中所有單鏈DNA的摩爾數均可相同。將所述長鏈DNA和/或所述環狀DNA進行擴增以及利用生物素對擴增產物進行標記可利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行。利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行反應的反應體系可為：所述長鏈DNA和/或所述環狀DNA10μl、2×反應緩沖液25μl、Bio-16-dUTP5μl、Replig_Enzyme1μl和H2O9μl。其中，2×反應緩沖液中含有所述隨機引物。利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行反應的反應溫度可為37℃。利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行反應的時間可不小于16小時。為解決上述技術問題，本發明還提供了所述N個亞探針。為解決上述技術問題，本發明還提供了DMD基因突變檢測系統。本發明所提供的DMD基因突變檢測系統，包括所述DMD基因捕獲探針或所述N個亞探針。上述系統可由所述DMD基因捕獲探針或所述N個亞探針與檢測基因突變所需的儀器和/或試劑組成。所述檢測基因突變所需的試劑不包括所述DMD基因捕獲探針或所述N個亞探針。所述檢測基因突變所需的儀器和/或試劑可為構建全基因組文庫所需的儀器和/或試劑，和/或，捕獲DMD基因所需的儀器和/或試劑，和/或，進行測序所需的儀器和/或試劑。所述捕獲DMD基因所需的儀器和/或儀器可為MyOne磁珠和/或邁基諾基因科技股份有限公司的緩沖液HY、2X結合緩沖溶液、WB1緩沖液、WB3緩沖液和/或稀釋緩沖溶液。所述進行測序所需的儀器和/或試劑可為利用二代測序所需的儀器和/或試劑。所述二代測序可為利用Illumina測序平臺或其他測序平臺進行的測序，如IlluminaHiSeq2000、IlluminaHiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或XTen。所述系統可為僅包括相關試劑的試劑或試劑盒。所述系統也可為含有所述DMD基因捕獲探針或所述N個亞探針的生物芯片。為解決上述技術問題，本發明還提供了所述捕獲探針的制備方法。為解決上述技術問題，本發明還提供了DMD基因突變檢測方法。本發明所提供的DMD基因突變檢測方法，包括利用所述DMD基因捕獲探針捕獲待測樣本的DMD基因，然后對捕獲的DMD基因進行測序，根據所述待測樣本的測序結果確定所述待測樣本的DMD基因的突變。上述DMD基因突變檢測方法中，所述確定所述待測樣本的DMD基因的突變可將所述待測樣本的測序結果與對照樣本的DMD基因的檢測結果進行比較確定；所述對照樣本的DMD基因未發生突變。所述對照樣本的DMD基因的檢測結果的檢測方法可包括：利用所述DMD基因捕獲探針捕獲對照樣本的DMD基因，然后對捕獲的DMD基因進行測序，得到所述對照樣本的測序結果。上述DMD基因突變檢測方法中，所述對捕獲的DMD基因進行測序可利用現有技術中的測序方法(如二代測序的方法，但不僅限于二代測序的方法)進行，只要能達到對捕獲的DMD基因測序的目的即可。所述二代測序可為利用Illumina測序平臺或其他測序平臺進行的測序，如IlluminaHiSeq2000、IlluminaHiSeq2500、Hiseq4000、Nextseq500或XTen。所述DMD基因突變檢測方法可為非診斷目的的DMD基因突變檢測方法。為解決上述技術問題，本發明還提供了下述任一應用：X1、所述DMD基因捕獲探針或所述N個探針在檢測DMD基因突變中的應用；X2、所述DMD基因捕獲探針或所述N個探針在制備檢測DMD基因突變產品中的應用；X3、所述DMD基因捕獲探針或所述N個探針在診斷或輔助診斷假肥大型肌營養不良綜合征中的應用；X4、所述DMD基因捕獲探針或所述N個探針在制備診斷或輔助診斷假肥大型肌營養不良綜合征產品中的應用；X5、所述系統在檢測DMD基因突變中的應用；X6、所述系統在制備檢測DMD基因突變產品中的應用；X7、所述系統在診斷或輔助診斷假肥大型肌營養不良綜合征中的應用；X8、所述系統在制備診斷或輔助診斷假肥大型肌營養不良綜合征產品中的應用；X9、所述DMD基因突變檢測方法在診斷或輔助診斷假肥大型肌營養不良綜合征中的應用。實驗證明，利用本發明的DMD基因捕獲探針及DMD基因突變檢測方法可以實現對檢測待測樣本DMD基因的突變進行檢測：利用本發明的DMD基因捕獲探針檢測待測樣本的DMD基因缺失/重復擴增突變的結果與利用MLPA的檢測結果完全一致，利用本發明的DMD基因捕獲探針檢測待測樣本的DMD基因點突變，其結果與利用Sanger測序對突變位點上下游引物對待測樣本進行PCR擴增的PCR產物進行測序的結果完全一致。與現有的MLPA技術只能檢測DMD基因外顯子是否存在缺失/重復擴增突變相比，利用本發明的DMD基因捕獲探針及DMD基因突變檢測方法對DMD基因進行檢測不僅可以檢測DMD基因是否存在缺失/重復擴增突變，還可以精確定位斷裂點區域以及片段大小，還可以檢測待測樣本的DMD基因的點突變。因此，與現有技術中的方法(MLPA、Sanger等)相比，本發明的DMD基因捕獲探針與DMD基因突變檢測方法具有一次檢測多種突變類型以及檢測DMD基因全基因所有突變的優勢，且準確性高，避免假陰性、假陽性出現，能提高臨床DMD基因突變檢測的效率與準確性。另外，本發明的DMD基因捕獲探針對DMD基因的捕獲均達到了92％以上覆蓋，在沒有缺失的情況下最高達到了99.92％；其捕獲效率均在40％以上，從至少覆蓋到4X、10X和20X的參數來看，平均覆蓋比例分別達到92％、90％和84％以上,覆蓋率根據缺失情況表現不同，探針的整體均一性非常好，具有很好的穩定性。表明，本發明的DMD基因捕獲探針可以用于捕獲DMD基因及DMD基因突變位點的檢測。附圖說明圖1為臨床樣本DMD基因突變檢測高通量測序圖譜。圖2與圖3為樣本C161206C01401的MLPA檢測結果圖。圖4與圖5為樣本C161201C02901的MLPA檢測結果圖。圖6與圖7為樣本C161001C04601的MLPA檢測結果圖。圖8與圖9為樣本C161027C03701的MLPA檢測結果圖。圖10與圖11為樣本C161105C03201的MLPA檢測結果圖。圖12為Sanger測序驗證待測樣本DMD基因點突變。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、DMD基因捕獲探針的制備1、單鏈亞探針的序列設計及制備所用DMD基因的序列為人類參考基因組版本Hg19(更新日期為2015年8月6日)的chrX:31137345-33357726。根據DMD基因序列設計DMD基因捕獲單鏈亞探針的序列，每條單鏈亞探針的長度為60bp，各單鏈亞探針的序列如下：第1條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第1-60位(即chrX:31137345-31137404)；第2條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第58-117位；第3條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第115-174位；……第n條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第【57(n-1)+1】-【57(n-1)+60】位；……第38953條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第2220265-2220324位；第38954條單鏈亞探針的序列為DMD基因的第2220322-2220381位(即chrX:33357667-33357726)。其中，n為1-38954中的任一個自然數。利用原位合成的方法，根據序列分別為上述各探針序列在芯片合成寡核苷酸探針，得到捕獲DMD基因的38954條單鏈亞探針。利用35％的氨水，將固定在芯片上的38954條單鏈亞探針洗脫下來，收集到離心管中，利用真空濃縮儀濃縮后，加入超純水溶解，成為一個DMD基因的38954條單鏈亞探針的混池；調整探針濃度到50ng/μl。2、可以捕獲DMD基因全基因的DMD基因捕獲探針的制備1)單鏈亞探針的5′磷酸化修飾：利用NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進行。5′磷酸化修飾的反應體系如下：組分體積(μl)38954條單鏈亞探針的混池(50ng/μl)1010×反應緩沖液(ReactionBuffer)510mMATP5T4PolynucleotideKinase(T4多聚核苷酸激酶)2.5H2027.5總反應體積50μl，該反應體系中，除38954條單鏈亞探針的混池和H2O外的試劑均為T4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑。混合均勻后，恒溫加熱器或PCR儀器上37℃恒溫孵育30min。反應結束后，利用微量PCR產物回收試劑盒按照其操作流程進行產物純化回收，洗脫體積20μl，得到磷酸化產物；2)連接反應：將步驟1)得到的磷酸化產物，利用商業的ssDNA連接試劑盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)連接，連接反應體系如下：組分體積(μl)步驟1)得到的磷酸化產物20CircLigaseII10×ReactionBuffer550mMMnCl22.55MBetaine10CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5H2O10總反應體積為50μl，該反應體系中，除步驟1)得到的磷酸化產物和H2O外的試劑均為ssDNA連接試劑盒中試劑。混合均勻后，60℃反應1小時。反應產物利用微量DNA回收試劑盒按照其操作流程進行產物純化回收，回收產物，得到連接產物(長鏈DNA和環狀DNA)。通過凝膠電泳，鑒別連接產物片段，結果顯示得到了成功連接的連接產物。3)標記生物素與擴增：利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒，反應體系如下：組分體積(μl)步驟2)得到的連接產物102×反應緩沖液(2×ReactionBuffer)25Bio-16-dUTP5Replig_Enzyme1H2O9總體積50μl，該反應體系中，除步驟2)得到的連接產物和H2O外的試劑均為全基因組擴增試劑盒中試劑，其中，2×反應緩沖液中含有隨機引物，隨機引物為由A、C、G和T這四個核苷酸隨機組成的長度均為6bp的46條單鏈DNA所形成的混合物，該混合物中所有單鏈DNA的摩爾數均相同。混合均勻后，37度恒溫孵育16小時以上。反應產物采用DNA回收試劑盒，按照試劑盒的標準操作流程，進行DNA純化，得到DMD基因捕獲探針。采用Nanodrop2000進行定量，并將DMD基因捕獲探針稀釋到150ng/μl，形成最終的DMD基因捕獲探針溶液。實施例2、DMD基因突變檢測方法的建立1.待測樣本全基因組文庫構建1.1超聲片段化：將起始量為0.5-3μg的待測樣本全基因組DNA，用1×lowTEBuffer(Thermo)稀釋到30ng/μL。采用CovarisS2超聲儀進行超聲片段化，按標準設定Covaris系統的值,6次循環×60s，水浴溫度:5℃,占空比:20％，強度:5,模式:Frequencysweeping，得到片段化的DNA。1.2末端補平：分別取100μL步驟1.1的片段化的DNA、8μLdNTPs、2μLEndPolishing酶I(10U/μL，Agilent)和16μLEndPolishing酶II(5U/μL，Agilent),加水到總體積為200μL，25℃孵育30min后，用PureLinkPCR純化試劑盒(Invitrogen)進行純化，得到末端補平的DNA。1.3連接P1和P2接頭：分別取SOLiD接頭1(PleA)50μmol/L和接頭2(P2eA)50μmol/L各26μL(AppliedBiosystems)、步驟1.2的末端補平的DNA48μL、T4DNA連接酶10μL(50U)，加水到總體積為200μL，室溫孵育15min。然后利用PureLinkPCR純化試劑盒(Thermo)進行純化，得到連接接頭的DNA。1.4DNA片段回收：采用預制的2％SizeSelectGel(AppliedBiosystems),放到E-GeliBase上。將連接接頭的DNA分3份各20μL加入上樣孔，分子量對照用0.2μg的50bpladder，無樣品孔及回收孔分別用20μL、25μL水填滿,電泳約12min,吸出進入樣品回收孔的150～200bp之間的DNA片段，得到回收的純化DNA片段。1.5缺口平移：步驟1.4的回收的純化DNA片段需要采用切口平移法進行文庫模板量的平衡的線性擴增。每100μL步驟1.4的回收的純化DNA片段加400μL的mastermix(Agilent),按程序進行反應:72℃20min,95℃5min；然后95℃15s，54℃15s，70℃1min進行10到12個循環；70℃再延伸5min；4℃保存。然后利用PureLinkPCR純化試劑盒(Thermo)進行純化并定量至35ng/μL，得到待測樣本全基因組文庫，取1μL待測樣本全基因組文庫進行FlashGel(2.2％,Lonza公司)電泳,約10min。2.DMD基因全基因捕獲將步驟1中得到的1μg(50ng/ul，20ul)待測樣本全基因組文庫與5μL實施例1的DMD基因捕獲探針溶液混合，在PCR儀上95℃孵育7分鐘，65℃孵育2分鐘，加入65℃預熱的緩沖液HY23μL，65℃雜交22小時，然后加入64μL2X結合緩沖溶液混合后，得到混合液，將混合液轉移至含有50μLMyOne磁珠(Thermo)的管中，旋轉1h，然后將MyOne磁珠用WB1緩沖液常溫清洗15min，然后用WB3緩沖液65℃洗3次，每次15分鐘，得到捕獲DMD基因的MyOne磁珠。將上述捕獲DMD基因的MyOne磁珠用稀釋緩沖溶液重懸，得到得到磁珠懸液，然后以磁珠懸液中磁珠上捕獲的DMD基因為模板、用擴增引物(Illumina測序通用引物)進行PCR擴增，擴增程序為：98℃30s，1個循環；98℃25s,65℃30s,72℃30s，15個循環；72℃5min，1個循環。將PCR產物用SPRI珠子(BeckmanCoulter,USA)進行純化，得到捕獲的DMD基因全基因。其中，緩沖液HY、2X結合緩沖溶液、WB1緩沖液、WB3緩沖液和稀釋緩沖溶液分別為邁基諾基因科技股份有限公司產品。3.測序與分析將步驟2中得到的捕獲的DMD基因全基因通過IlluminaHiSeq2000進行高通量測序,得到測序的數據，然后對測序數據進行分析。測序數據分析的過程包括單核苷酸位點變異(SNV)分析過程、插入缺失標記分析(InDel分析)流程和外顯子大片段缺失/重復分析流程。單核苷酸位點變異(SNV)分析過程包括如下步驟：(1)測序儀(IlluminaHiSeq2000)獲取原始短序列；(2)去除測序數據中的接頭和低質量數據；(3)把短序列(用SOAPaligner軟件)定位到人類基因組數據相應的位置上(所用到參數：soap2.20-a-b-t-v3-142-s63-m100-x400,其中序列錯配數為3)；(4)統計測序結果信息，短序列數量、目標區域覆蓋大小、平均測序深度等；(5)過濾低質量值(質量值>＝20)和低覆蓋度(深度>＝10)的單核苷酸；(6)利用CCDS、人類基因組數據庫(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息對單核苷酸變異進行注釋，確定突變位點發生的基因、坐標、mRNA位點、氨基酸改變、單核苷酸功能(錯義突變/無義突變/可變剪切位點)、SIFT預測單核苷酸影響蛋白功能預測；(7)根據疾病樣品和正常樣品信息,選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的單核苷酸變異作為候選的單核苷酸變異，在候選的單核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人類基因組、其他外顯子測序項目中出現的單核苷酸變異。同時過濾掉SIFT預測對蛋白功能無影響的單核苷酸變異作為最后疾病相關的候選單核苷酸變異位點；插入缺失標記分析(InDel分析)流程包括如下步驟：(1)把去除接頭序列和低質量的測序數據用Burrows-WheelerAligner(BWA)比對到人類基因組上(所以到參數：bwaaln-L-l31–I10-k2-t7-e40)；(2)用GATK軟件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；(3)利用CCDS、人類基因組數據庫(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息對InDel進行注釋，確定突變位點發生的基因、坐標、mRNA位點、編碼區域序列的改變、對氨基酸的影響、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移碼突變)；(4)根據疾病樣品和正常樣品信息，選出檢測樣品所共有的而在正常組中不存在的InDel作為候選的InDels，在候選的InDels中去除掉在dbSNP、其他外顯子測序項目中出現的InDel,最后篩選出疾病相關的候選InDels；外顯子大片段重復/缺失分析流程包括如下步驟：(1)測序儀(IlluminaHiSeq2000)獲取原始短序列；(2)去除測序數據中的接頭和低質量數據；(3)把短序列(用SOAPaligner軟件)定位到人類基因組數據相應的位置上(所用到參數：soap2.20-a-b-t-v3-l42-s63-m100-x400,其中序列錯配數為3)；(4)統計目標區域覆蓋大小，然后根據每個目標區域位點的位置信息為橫坐標，每個位置相應的覆蓋度為縱坐標作圖，通過每個位點的讀取深度，進行位點統計分析得出重復擴增和缺失的分析圖，同時通過末端配對作圖法(paired-endmapping，PEM)得到相關的斷裂點位置。實施例3、利用實施例1的DMD基因捕獲探針與實施例2的DMD基因突變檢測方法檢測臨床樣本的DMD基因突變經知情同意，選擇DMD基因存在外顯子缺失/重復擴增突變的5例患者的DNA樣本(經MLPA檢測驗證，圖2-圖11)作為待測樣本，利用MLPA檢測陰性的DNA樣本作為正常對照(陰性對照)，應用實施例2的DMD基因突變檢測方法檢測DMD基因突變。MLPA檢測DMD基因是否存在外顯子缺失/重復擴增突變所用試劑盒為MLPAP052檢測試劑盒(HRC-Holland)。結果顯示，5例MLPA檢測陽性的樣本高通量測序圖見圖1，數據分析結果見表1和表3。圖1中，陰性對照是指MLPA檢測陰性的樣本的高通量測序圖。結果發現待測樣本中有3例外顯子缺失突變和2例外顯子重復擴增突變，陰性對照中不含有缺失突變和重復擴增突變。通過利用本發明的DMD基因捕獲探針和DMD基因突變檢測方法進行檢測的結果與MLPA驗證結果的比較，發現結果一致，無差異。說明利用本發明的DMD基因捕獲探針和DMD基因突變檢測方法檢測DMD全基因突變效果可靠。另外，現有的MLPA技術只能檢測DMD基因外顯子是否存在缺失/重復擴增突變，而本發明的DMD基因突變檢測方法還能精確定位斷裂點區域以及片段大小。表1、DMD外顯子缺失/重復擴增突變檢測另選取4個樣本經實施例2的方法檢測為DMD基因點突變樣本，其檢測結果如表2和表3所示。這四個樣本中均不存在缺失/重復擴增突變。利用MLPAP052檢測試劑盒對這四個樣本進行檢測也均未檢測到任何缺失/重復擴增突變。根據實施例2的方法的檢測結果在各突變位點上下游設計引物，對相應樣本的基因組DNA進行PCR擴增，并對PCR擴增產物進行Sanger測序，結果發現，各PCR擴增產物的Sanger測序結果(圖12)與利用實施例2的方法檢測的點突變的結果完全一致。表2.DMD基因點突變檢測因此，與現有技術中的方法(MLPA、Sanger等)相比，本發明的DMD基因捕獲探針與DMD基因突變檢測方法具有一次檢測多種突變類型以及檢測DMD基因全基因所有突變的優勢，且準確性高，避免假陰性、假陽性出現，能提高臨床DMD基因突變檢測的效率與準確性。表3、測序數據表3中參數說明：A.測序數據量是指完成DMD基因捕獲的樣本進行測序時產生的總的測序數據；B.覆蓋率：覆蓋目的堿基數/目的堿基數；C.目的堿基數：指探針設計所要覆蓋到的目的區域的總堿基數；D.覆蓋目的堿基數：指經過富集測序后，能夠成功比對到設計所要覆蓋的堿基區域的堿基數；E.捕獲效率(有效數據量)：覆蓋目的堿基數/測序數據量F.測序平均深度：指目的區域測序時，平均所讀取到的次數；G.平均覆蓋4X比例：指最少讀到4次以上的堿基數占比；H.平均覆蓋10X比例：指最少讀到10次以上的堿基數占比；I.平均覆蓋20X比例：指最少讀到20次以上的堿基數占比；探針質量評估：DMD基因捕獲探針對DMD基因的捕獲均達到了92％以上覆蓋，最高達到了99.92％；其捕獲效率均在40％以上，從至少覆蓋到4X、10X和20X的參數來看，平均覆蓋比例分別達到92％、90％和84％以上，探針的整體均一性非常好，具有很好的穩定性。表明，本發明的DMD基因捕獲探針可以用于捕獲DMD基因及DMD基因突變位點的檢測。當前第1頁1 2 3