一種基于轉錄組序列開發綠絨蒿SSR引物的方法與流程

本發明涉及一種基于轉錄組序列開發綠絨蒿SSR引物的方法，屬于分子標記技術領域。

背景技術：

綠絨蒿屬是罌粟科(Papavevaceae)中綠絨蒿屬(MeconpsisVig.)植物的總稱，為一年生或多年生草本植物。中國產38種，約占全屬總數的80％，主要分布于四川西南部、云南西北部、西藏東南部和東喜馬拉雅南坡，其中西藏和云南分布種類最多，資源十分豐富。綠絨蒿屬植物花大、且顏色豐富，是著名而有巨大育種潛力的高山野生花卉，為云南八大名花之一，名揚海內外。同時也是傳統藏醫藥用植物，有清熱解毒、利尿、消炎、止痛等功效。我國西南高山及喜馬拉雅山山脈為綠絨蒿屬植物的分布中心，種內分化劇烈，遺傳多樣性豐富。但該屬內種的劃分仍存在爭議，結論存在不一致。屬內親緣關系比較混亂。因此，該屬植物SSR引物的開發，將為其遺傳多樣性、品種鑒定，親緣關系，以及完善該屬植物的分類系統，種質資源收集、保存和利用等奠定基礎。

分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，能在DNA水平上反映植物遺傳基礎的差異，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。常用于遺傳多樣性研究的分子標記主要有等位酶、隨機擴增多態DNA(RAPD)、簡單序列重復(SSR)、簡單重復序列區間(ISSR)、PCR特異擴增ITS序列和擴增片段長度多態性(AFLP)等技術。簡單重復序列(SSR)廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，由于SSR的重復次數不同和重復程度不同，使其呈現高度的多態性。與其它分子標記技術相比，SSR標記具有多態信息含量高、共顯性遺傳、技術簡單、重復性好、特異性強、操作便利、并在基因組中分散分布等優點已成為最受人們歡迎的分子標記之一，被認為是可靠性最高的分子標記類型之一。在許多領域廣泛應用。但SSR標記的主要缺點是首先要從該物種中獲取重復序列兩側的序列信息，并設計引物，而后才能被利用。

SSR標記可分為基因組SSR(gSSR)和表達序列標簽SSR(EST-SSR)，EST-SSR標記源于基因的轉錄區，與gSSR標記相比，其多態性可能與基因功能直接相關，因此，比gSSR標記具有更高通用性，更經濟，更高效率。隨著轉錄組測序技術的日益成熟和測序成本的下降，利用二代測序技術可以對全基因組范圍內的轉錄本進行大規模的高通量測序，并能產生較之EST測序更為海量的轉錄組數據，這為功能基因組SSR標記的開發提供了更豐富和極有價值的可利用資源，也是快速、高效的獲得SSR引物的最便捷的途徑。

目前綠絨蒿屬尚無全基因組序列信息，已開發的SSR引物數量較少。對于無參考基因組的轉錄組分析，可先將測序所得的序列拼接成轉錄本，以轉錄本為參考序列，進行后續分析。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種基于轉錄組序列開發綠絨蒿SSR引物的方法，利用第二代高通量測序技術獲得綠絨蒿轉錄組序列信息，批量開發SSR引物，將會對綠絨蒿植物重要性狀基因的定位、克隆及分子標記輔助選擇育種和比較基因組學研究等起重要推動作用。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。

一種基于轉錄組序列開發綠絨蒿SSR引物的方法，具體步驟如下：

(1)構建轉錄組文庫：采用Trizol提取綠絨蒿花瓣總RNA，按照“TruSeq RNA Sample Preparation Guide”對純化后的總RNA進行mRNA的分離、片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成，利用AMPure XP beads純化cDNA；純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPureXPbeads進行片段大小選擇；最后通過PCR富集得到cDNA文庫；所建測序文庫經0Fluorometer和Agilent2100系統檢測合格后，在IlluminaHiSeq2000測序儀上完成雙端測序；

(2)測序完成后，利用軟件Trinity將測序序列拼接成一個完整的轉錄組，取每條基因最長的轉錄本作為Unigene，并對Unigene序列進行生物信息學分析；

(3)采用軟件MISA1.0對上述Unigene進行SSR檢測，進行單堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復SSR位點和混合SSR位點搜索；

(4)采用軟件Primer3進行SSR引物設計，并鑒定引物的多態性。SSR引物設計使用的參數為：引物長度18-22bp，GC含量為30％-70％，退火溫度為50-70°C，Tm55-65℃，產物大小100-300bp。

(5)SSR引物對采集自不同地理位置的8種綠絨蒿的DNA多態性進行鑒定。

(6)從開發的13356對SSR引物中合成適合擴增，且不重復的96對SSR引物。

(7)選取特定樣品進行第一輪引物篩選，具體為：

(7a)選取差異性大的樣品8個，分別是全緣葉綠絨蒿、多刺綠絨蒿、總狀綠絨蒿、大花綠絨蒿、綠絨蒿藍花鈴蔻、綠絨蒿紫花鈴蔻、秀麗葉綠絨蒿和橫斷山綠絨蒿；用選取的不同引物進行擴增，體系如下：酶mix：7.5ul；正向引物加接頭：1ul，濃度10P；反向引物：1ul，濃度10P；DNA模板：1ul；ddH2O：4.5ul；擴增條件：94℃5min，94℃30S，63℃30S，共30個循環；72℃20S，72℃10min，4℃；

(7b)將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用2ul樣品+6ul溴酚藍，300V電壓下12分鐘，獲取鑒定膠圖；

(7c)根據膠圖確定是否擴增出目的DNA片段，選取了21對擴增條帶較好的引物準備二次擴增。

(8)二次擴增及二次篩選：用帶熒光的接頭引物和反向引物對一次擴增的產物進行二次擴增，擴增體系及條件與一次相同；將上步獲得的PCR產物進行電泳鑒定，獲取鑒定膠圖；通過膠圖確定模板濃度，加水稀釋到電泳所需濃度；上機毛細管電泳及結果獲取：(8a)將HiDi與500bp的內標按130：1混合，配成mix；(8b)用國產96孔反應板分裝mix，每個孔中加入10ulmix；(8c)對應著在96孔板中加入0.5ul樣品模板，離心到4000rpm即停；(8d)用金屬浴加熱器將混合板95℃加熱預變性5分鐘，拿出后立即放入-20℃；(8e)冷卻后拿出，4000rpm離心，解凍、混勻；(8f)上3730測序儀進行毛線管電泳；(8g)獲取下機結果并分析，篩選出多態性較好的位點。

(9)位點分析和篩選：共篩選出21對引物，分別如下：

該發明的有益效果在于：本發明通過獲得的轉錄組序列，極大地增加了用于引物開發的原始數據；采用生物信息學途徑可以大批量開發SSR標記，大大提高了開發的效率，而且本發明所提供的SSR標記引物是穩定存在的新標記，可直接用于綠絨蒿屬植物的相關研究，解決了綠絨蒿屬SSR引物少問題，為利用SSR分子標記進行綠絨蒿屬遺傳多樣性、品種鑒定及親緣關系研究等奠定基礎。

附圖說明

圖1、本發明實施例中的不同種綠絨蒿的DNA膠圖。

圖2、本發明實施例中的第一輪引物篩選的鑒定膠圖。

圖3、本發明實施例中的第二輪引物篩選的鑒定膠圖。

圖4、本發明實施例中的94號引物對4種綠絨蒿的毛細管電泳檢測圖。

圖5、本發明實施例中的52號引物對3種綠絨蒿的毛細管電泳檢測圖。

圖6、本發明實施例中的部分引物對不同綠絨蒿的相關分析數據。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明的具體實施方式進行描述，以便更好的理解本發明。

實施例

本實施例中的基于轉錄組序列開發綠絨蒿SSR引物的方法，具體步驟如下：

(1)構建轉錄組文庫：采用Trizol提取綠絨蒿花瓣總RNA，按照“TruSeq RNA Sample Preparation Guide”對純化后的總RNA進行mRNA的分離、片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成，利用AMPureXP beads純化cDNA；純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPureXP beads進行片段大小選擇；最后通過PCR富集得到cDNA文庫；所建測序文庫經0Fluorometer和Agilent2100系統檢測合格后，在IlluminaHiSeq2000測序儀上完成雙端測序；共檢測出6，614個SSR分布于17，311個Unigene中。

(2)測序完成后，利用軟件Trinity將測序序列拼接成一個完整的轉錄組，取每條基因最長的轉錄本作為Unigene，并對Unigene序列進行生物信息學分析；

(3)采用軟件MISA1.0對上述Unigene進行SSR檢測，進行單堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基重復SSR位點和混合SSR位點進行搜索；

(4)采用軟件Primer3進行SSR引物設計，并鑒定引物的多態性。SSR引物設計使用的參數為：引物長度18-22bp，GC含量為30％-70％，退火溫度為50-70°C，Tm55-65℃，產物大小100-300bp。

(5)SSR引物對采集自不同地理位置的8種綠絨蒿的DNA多態性進行鑒定。圖1為不同種綠絨蒿的DNA膠圖。

(6)從開發的13356對SSR引物中合成適合擴增，且不重復的96對SSR引物。

(7)選取特定樣品進行第一輪引物篩選，具體為：

(7a)選取差異性大的樣品8個，分別是全緣葉綠絨蒿、多刺綠絨蒿、總狀綠絨蒿、大花綠絨蒿、綠絨蒿藍花鈴蔻、綠絨蒿紫花鈴蔻、秀麗葉綠絨蒿和橫斷山綠絨蒿；用選取的不同引物進行擴增，體系如下：酶mix：7.5ul；正向引物加接頭：1ul，濃度10P；反向引物：1ul，濃度10P；DNA模板：1ul；ddH2O：4.5ul；擴增條件：94℃5min，94℃30S，63℃30S，共30個循環；72℃20S，72℃10min，4℃；

(7b)將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用2ul樣品+6ul溴酚藍，300V電壓下12分鐘，獲取鑒定膠圖；圖2為第一輪引物篩選的鑒定膠圖。

(7c)根據膠圖確定是否擴增出目的DNA片段，選取了21對擴增條帶較好的引物準備二次擴增。圖3為第二輪引物篩選的鑒定膠圖。

(8)二次擴增及二次篩選：用帶熒光的接頭引物和反向引物對一次擴增的產物進行二次擴增，擴增體系及條件與一次相同；將上步獲得的PCR產物進行電泳鑒定，獲取鑒定膠圖；通過膠圖確定模板濃度，加水稀釋到電泳所需濃度；上機毛細管電泳及結果獲取：(8a)將HiDi與500bp的內標按130：1混合，配成mix；(8b)用國產96孔反應板分裝mix，每個孔中加入10ulmix；(8c)對應著在96孔板中加入0.5ul樣品模板，離心到4000rpm即停；(8d)用金屬浴加熱器將混合板95℃加熱預變性5分鐘，拿出后立即放入-20℃；(8e)冷卻后拿出，4000rpm離心，解凍、混勻；(8f)上3730測序儀進行毛線管電泳；(8g)獲取下機結果并分析，篩選出多態性較好的位點。

4位點分析和篩選：(1)圖4為94號引物對4種綠絨蒿的毛細管電泳檢測圖，4種綠絨蒿分別為大花綠絨蒿(M.grandis)，橫斷山綠絨蒿(M.pseudointegrifolia)，全緣葉綠絨蒿(M.integrifolia)，綠絨蒿藍花鈴蔻(M.‘lingholm’)。圖示特異性高，多態性好，則該位點可用。(2)圖5為52號引物對3種綠絨蒿的毛細管電泳檢測圖，3種綠絨蒿分別為全緣葉綠絨蒿(M.integrifolia)，綠絨蒿紫花鈴蔻(M.lingholm‘purple’)，多刺綠絨蒿(M.horridula)。圖示，若結果只有一種片段大小，則引物的多態性不理想。該引物舍棄。

(9)根據上述方法，共篩選出21對引物。每對引物單獨分析并分析出數據，表格如下。Allele1表示該樣品該位點的第一個片段，Allele2表示第二個片段。其余數據為位點的附帶數據，可作為判斷位置指導。圖6為部分引物對不同綠絨蒿的相關分析數據截圖。

以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。