本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種與植物抗逆性相關蛋白GsERF71及其編碼基因與應用。
背景技術：
：我國鹽堿地面積多達15億畝，東北地區達5500余萬畝，僅黑龍江省就高達2800余萬畝。因此，鹽堿逆境是制約我國農業生產的重大問題。如果能夠開發利用這些廣袤的鹽堿地資源，對保證我國農業持續高效發展和糧食安全，具有重大的戰略意義和現實意義，可創造巨大的經濟效益、社會效益和生態效益。我國的鹽堿地主要是堿性土壤，面積最大、造成的危害也最為嚴重，包括東北、華北、西北內陸等地區，其危害是在Na+引發離子毒害的基礎上，還增加了由碳酸鹽或碳酸氫鹽等堿性鹽引起的高pH值傷害及碳酸根離子和碳酸氫根離子本身造成的毒害。堿脅迫造成的混合性傷害能夠直接作用于植物根系，改變細胞結構和膜穩定性，干擾跨膜電位的形成，造成根細胞功能及代謝紊亂。高pH環境會使土壤中多種金屬離子Ca2+、Mg2+和Fe2+等離子發生沉淀，直接影響植物根系對于這些離子的吸收及利用，從而擾亂植物細胞內部的離子平衡，同時對植物的生長和光合作用產生不利影響。高pH值脅迫還能夠導致植物根中生長素不正常的累積，造成主根的生長和伸長受到抑制。已有報道表明多種經濟作物受到了由HCO3-引起的堿脅迫的嚴重傷害。綜上所述，堿脅迫相比鹽脅迫的作用機制更為復雜，對植物的生長發育，尤其是對直接接觸土壤的植物根系造成的危害更大。因此，如何提高植物的耐鹽堿性已成為現今科學研究的重點內容。目前，全世界提高鹽堿地利用率的主要方法之一就是利用耐鹽堿植物基因資源，挖掘出關鍵的耐鹽堿基因，進而培育出具有較高耐鹽堿能力的作物新品種。相較于栽培大豆，野生大豆具備較強的抗逆性和對外界環境的適應性。野生大豆為一年生草本植物，在世界范圍內的生長具有地域性特點，而在中國分布較為廣泛。由于中國不同地區環境異質性差異較大，因此形成了適合在不同生態條件下生存的野生大豆群體。野生大豆基因資源應用結果顯示，野生大豆不但能增加大豆的遺傳多樣性，應用于栽培大豆的育種程序，隨著分子生物學和基因工程技術的不斷發展，野生大豆作為大量耐逆基因挖掘的供體還可以更加廣泛地應用于作物育種過程中，發揮其更加重要的作用。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何調控植物抗逆性。為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種與植物抗逆性相關蛋白。本發明所提供的與植物抗逆性相關蛋白的名稱為GsERF71，為如下a)或b)或c)的蛋白質：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質；b)在序列2所示的蛋白質的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質；c)將序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。其中，序列2由300個氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1、標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質GsERF71，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質GsERF71可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質GsERF71的編碼基因可通過將序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。為解決上述技術問題，本發明又提供了與GsERF71蛋白質相關的生物材料。本發明提供的與GsERF71蛋白質相關的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：A1)編碼GsERF71蛋白質的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。上述相關生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼GsERF71蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼GsERF71蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列1由903個核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼GsERF71的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的GsERF71的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GsERF71且具有相同功能，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GsERF71的核酸分子的表達盒(GsERF71基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達GsERF71的DNA，該DNA不但可包括啟動GsERF71轉錄的啟動子，還可包括終止GsERF71轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用于本發明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子；組織、器官和發育特異的啟動子及誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S：來自西紅柿的創傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；來自煙草的化學誘導型啟動子，發病機理相關1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導)；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導)；熱休克啟動子(美國專利5，187，267)；四環素誘導型啟動子(美國專利5，057,422)；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉錄終止子包括但不限于：農桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。可用現有的表達載體構建含有所述GsERF71基因表達盒的重組載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標記基因(如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptII基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學試劑標記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。上述生物材料中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農桿菌。上述生物材料中，所述轉基因植物細胞系均不包括繁殖材料。為解決上述技術問題，本發明還提供上述蛋白質或上述相關生物材料的新用途。本發明提供了GsERF71蛋白質或上述相關生物材料在調控植物抗逆性中的應用。上述應用中，所述調控為提高。本發明還提供了GsERF71蛋白質或上述相關生物材料在培育抗逆性提高的轉基因植物中的應用。上述應用中，所述抗逆性為抗堿脅迫。為解決上述技術問題，本發明最后提供了一種培育抗逆性提高的轉基因植物的方法。本發明提供的培育抗逆性提高的轉基因植物的方法包括提高受體植物中GsERF71蛋白質的活性，得到轉基因植物的步驟；所述轉基因植物的抗逆性高于所述受體植物。上述方法中，所述提高受體植物中GsERF71蛋白質的活性的方法為在受體植物中過表達GsERF71蛋白質。上述方法中，所述過表達的方法為將GsERF71蛋白質的編碼基因導入受體植物；所述GsERF71蛋白質的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本發明的一個實施方式中，GsERF71蛋白的編碼基因(即序列1所示的核苷酸)通過含有GsERF71蛋白的編碼基因的表達盒的重組載體pCAMBIA2300-GsERF71導入農桿菌LBA4404中。所述重組載體pCAMBIA2300-GsERF71為將序列1所示的DNA分子插入pCAMBIA2300載體的SmaI和XbaI酶切位點之間，且保持pCAMBIA2300載體的其他序列不變得到的載體。所述重組載體pCAMBIA2300-GsERF71表達GsERF71蛋白。上述方法中，所述抗逆性為抗堿脅迫；所述抗堿脅迫具體為抗NaHCO3脅迫。上述方法中，所述抗NaHCO3脅迫具體體現為在不同濃度NaHCO3脅迫的條件下：(1)轉基因植物的展葉率高于受體植物；和/或，(2)轉基因植物的根長長于受體植物；和/或，(3)轉基因植物的葉綠素含量高于受體植物；和/或，(4)轉基因植物的丙二醛含量低于受體植物；和/或，(5)轉基因植物的堿脅迫相關基因的表達量高于受體植物；和/或，所述堿脅迫相關基因具體為H+-ATPase基因和/或COR47基因和/或KIN1基因和/或RD29A基因；和/或，所述NaHCO3濃度為6mM、8mM、50mM和100mM。上述方法中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述GsERF71基因轉化目的植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥。本發明發現了一個野生大豆AP2/ERF轉錄因子家族基因GsERF71，該基因不僅能夠響應堿脅迫應答還能提高植物的耐堿功能。對其進行組織定位分析，發現其在下胚軸及根尖中的表達量明顯高于其他組織。將其瞬時表達于洋蔥表皮細胞，發現其主要表達在細胞核中，進一步研究發現該蛋白具有自激活活性并且能夠與DRE或GCC順式作用元件特異性結合。本發明的實驗證明，將該基因超表達于擬南芥中，可增強擬南芥在萌發期、幼苗期和成苗期對堿脅迫的耐性，說明該蛋白可以為培育具有耐堿性的轉基因植物的研究奠定基礎。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。附圖說明圖1為野生大豆根和葉中GsERF71基因在50mMNaHCO3(pH8.5)和200mMNaCl處理下的表達模式。圖2為野生大豆不同組織中GsERF71基因的相對表達量。圖3為GsERF71基因的亞細胞定位分析。圖4為酵母細胞中GsERF71蛋白的轉錄激活活性分析。(A)為酵母載體pGBKT7-GsERF71構建的示意圖；(B)為通過檢測報告基因LacZ活性確定GsERF71蛋白轉錄激活活性；(C)為GsERF71蛋白不同缺失片段示意圖；(D)為通過檢測報告基因HIS活性確定GsERF71轉錄激活區；(E)為定量檢測報告基因β－半乳糖苷酶的活性。圖5為在酵母細胞中GsERF71蛋白與DRE或GCC順式作用元件的結合特性分析。a為用于酵母單雜交分析的DRE元件/突變，GCCbox/突變序列示意圖；b為酵母單雜交檢測GsERF71與DRE元件或GCCbox的結合特性。圖6為轉GsERF71基因擬南芥植株分子鑒定。其中，#30和#32均為T3代轉GsERF71基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。圖7為轉GsERF71基因擬南芥植株在6mMNaHCO3和8mMNaHCO3處理下的萌發期表型及展葉率統計分析。其中，#30和#32均為T3代轉GsERF71基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。a為野生型及超量表達擬南芥萌發期在堿脅迫下的表型；b為野生型及超量表達擬南芥幼苗在對照和處理條件下的生長情況；c為野生型及超量表達植株在正常情況下及6mM、8mMNaHCO3處理下展葉率統計。圖8為轉GsERF71基因擬南芥植株在6mMNaHCO3處理下的幼苗期表型及根長統計分析。其中，#30和#32均為T3代轉GsERF71基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。a為野生型及GsERF71基因超表達擬南芥幼苗期在堿脅迫處理下的表型；b為野生型及GsERF71超量表達植株在堿脅迫處理下根長統計分析。圖9為轉GsERF71基因擬南芥植株在100mMNaHCO3處理下的成苗期表型分析。其中，#30和#32均為T3代轉GsERF71基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。a為野生型及超表達植株在堿脅迫處理16天后的表型分析；b為野生型及超表達植株在堿脅迫處理16天后葉綠素含量測定；c為野生型及超表達植株在堿脅迫處理16天后丙二醛含量測定。圖10為堿脅迫條件下野生型擬南芥及轉基因擬南芥中脅迫響應Marker基因的表達量分析。其中，#30和#32均為T3代轉GsERF71基因擬南芥，WT為野生型擬南芥。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量驗，均設置三次重復實驗，數據為三次重復實驗的平均值。下述實施例中的野生大豆G07256在文獻“MingzheSun,XiaoliSun,YangZhao,HuaCai,ChaoyueZhao,WeiJi,HuiziDuanMu,YangYu,YanmingZhu.EctopicexpressionofGsPPCK3andSCMRPinMedicagosativaenhancesplantalkalinestresstoleranceandmethioninecontent.PLOSONE2014,9(2):e89578”中公開過，公眾可以從東北農業大學獲得。下述實施例中的pCAMBIA2300載體在文獻“AilinLiu,YangYu,XiangboDuan,XiaoliSun,HuiziDuanmu,YanmingZhu.GsSKP21,aGlycinesojaSphasekinaseassociatedprotein,mediatestheregulationofplantalkalinetoleranceandABAsensitivity.PlantMolBiol(2015)87:111–124”中公開過，公眾可以從東北農業大學獲得。下述實施例中的農桿菌LBA4404在文獻“AilinLiu,YangYu,XiangboDuan,XiaoliSun,HuiziDuanmu,YanmingZhu.GsSKP21,aGlycinesojaSphasekinaseassociatedprotein,mediatestheregulationofplantalkalinetoleranceandABAsensitivity.PlantMolBiol(2015)87:111–124”中公開過，公眾可以從東北農業大學獲得。下述實施例中的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH109在“孫曉麗；段小紅；才華；李勇；柏錫；紀巍；季佐軍；朱延明。利用酵母雙雜交技術篩選與AtbZIP1相互作用的蛋白質。中國生物化學與分子生物學報，2010，26(11)1050-1058”中公開過，公眾可以從東北農業大學獲得。下述實施例中的pGBKT7載體在文獻“XiaoLuo,NaCui,YanmingZhu,LeiCao,HongZhai,HuaCai,WeiJi,XuedongWang,DanZhu,YongLi,XiBaiOver-expressionofGsZFP1,anABA-responsiveC2H2-typezincfingerproteinlackingaQALGGHmotif,reducesABAsensitivityanddecreasesstomatasize.JournalofPlantPhysiology169(12)；1192-1202”中公開過，公眾可以從東北農業大學獲得。下述實施例中的pBSK-35S-eGFP載體在文獻“XiaoliSun,WeiJi,XiaodongDing,XiBai,HuaCai,ShanshanYang,XueQian,MingzheSun,YanmingZhu.GsVAMP72,anovelGlycinesojaR-SNAREprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandABAsensitivity.PlantCellTissOrganCult2013,113:199–215”中公開過，公眾可以從東北農業大學獲得。下述實施例中的大腸桿菌感受態Trans5αChemicallyCompetentcell是全式金公司公司的產品。實施例1、大豆轉錄因子GsERF71基因的克隆1、植物材料的處理挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理10min以去除泥膜，倒凈濃H2SO4，用無菌水沖洗3-4遍后放置于濕潤的濾紙上，25℃暗培養3d催芽，待芽長到約1-2cm時，將其轉移到盛有霍格蘭培養液的缽中，用太空棉固定，使芽浸入培養液中，并將其放置于人工氣候箱中培養。待幼苗長至3周齡，取其根部3cm放入EP管中，置于-80℃保存。2、RNA提取采用RNApreppure試劑盒(TRANSGENBIOTECH)提取上述3周齡野生大豆幼苗的根的總RNA。3、cDNA的獲得以上述總RNA為模板，反轉錄得到cDNA。4、PCR擴增以上述cDNA為模板，采用Primer-S和Primer-AS引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。引物序列如下：Primer-KS：5’-ATGTGTGGCGGTGCCAT-3’(序列3)；Primer-KAS：5’-CTAATCGAAACTCCAGAGAT-3’(序列4)。PCR擴增體系(50μl)：cDNA4μl，10×PSbuffer(Mg2+)10μl，dNTPMixture(2.5mM)4μl，Primer-KS1μl，Primer-KAS1μl，PrimeStarDNAPolymerase(TaKaRa)0.5μl，ddH2O29.5μl。PCR擴增條件：98℃8min；98℃10s，60℃10s，72℃1min10s，30個循環；72℃10min；4℃終止反應。將PCR擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量略小于1Kb的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TRANSGENBIOTECH)回收PCR擴增產物，將其與pEASY-BluntZero載體(TRANSGENBIOTECH)連接，得到重組質粒，將其命名為pEASY-BluntZero-GsERF71，并將其轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞后送交測序。測序結果表明：PCR擴增得到大小為903bp的擴增產物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，并將序列1所示的基因命名為GsERF71基因，GsERF71基因編碼序列表中序列2所示的蛋白質，將序列2所示的氨基酸序列命名為GsERF71蛋白。實施例2、大豆轉錄因子GsERF71基因的表達特性分析一、野生大豆根和葉中的GsERF71基因在堿脅迫處理下不同時間的表達模式分析1、植物材料的處理挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理10min以去除泥膜，倒凈濃H2SO4，用無菌水沖洗3-4遍后放置于濕潤的濾紙上，25℃暗培養3d催芽，待芽長到約1-2cm時，移出，用霍格蘭液體培養基進行水培。待野生大豆幼苗長至3周齡，分別在50mMNaHCO3(pH8.5)和200mMNaCl條件下對野生大豆幼苗進行堿脅迫和鹽脅迫處理，分別在0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h各個時間點選取3株野生大豆，剪取其根尖3cm和新的三出復葉作為待測組織樣品，迅速放于液氮中冷凍，然后置于-80℃保存。并以未處理樣品作為對照。2、總RNA的提取和cDNA的獲得采用RNApreppure試劑盒(TRANSGENBIOTECH)分別提取上述步驟1獲得的不同時間處理后的待測組織樣品的總RNA；以獲得總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA。3、Real-timePCR以上述cDNA為模板，采用Primer-qS和Primer-qAS引物，通過Real-timePCR對GsERF71基因進行表達量檢測。引物序列如下所示：Primer-qS：5’-GGAACGGTTATTTGGGTGGC-3’；Primer-qAS：5’-TCGTGGATTGTCCATCATAGTACG-3’。Real-timePCR反應的條件：95℃2min→[95℃15s→60℃30s]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。Real-timePCR采用比較CT法(ΔΔCT)計算基因表達量，以野生大豆GsGAPDH基因為內參基因，以未經處理的樣品作為對照。目標基因表達差異通過經過處理的樣本相對于每個時間點未經處理的樣本的倍數來表示。每個樣品包括3次生物學重復和3次技術重復，數據取3次生物學重復的平均值，如果有一個數值的偏差比較大則取兩個數據的平均值。原始數據經標準化處理。標準化處理后的數據經T-test進行差異顯著性分析。相對表達量計算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT處理-ΔCT對照)＝2-[(CT處理目的基因-CT處理內參基因)-(CT對照目的基因-CT對照內參基因)]。內參基因引物序列如下所示：GsGAPDHS：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；GsGAPDHAS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。結果如圖1所示：在50mMNaHCO3脅迫處理條件下GsERF71表達呈現先下調后上調再下降趨于平穩的趨勢，在根中脅迫處理1h時達到最高值，約為未處理樣品中GsERF71表達量的7倍，而在葉中脅迫處理6h時達到最高值，約為未處理樣品中GsERF71表達量的4倍。在200mMNaCl脅迫處理條件下GsERF71的轉錄水平在野生大豆中也呈現先上升后下降的趨勢，在根和葉中均在脅迫1h后達到最高值并逐漸恢復至正常表達水平。說明GsERF71基因的表達受堿脅迫和鹽的誘導并參與植物響應鹽、堿脅迫的信號傳導通路。二、野生大豆不同組織中GsERF71基因的相對表達量1、植物材料的處理挑選飽滿的野生大豆G07256種子于濃H2SO4中處理10min以去除泥膜，倒凈濃H2SO4，用無菌水沖洗3-4遍后放置于濕潤的濾紙上，25℃暗培養3d催芽，待芽長到約1-2cm時，將其轉移到盛有30％草炭土、70％普通土的育苗盆中于溫室進行培養。待幼苗長至成熟期，迅速取野生大豆不同組織(包括幼葉、老葉、莖、花、種莢、下胚軸、根尖)，液氮冷凍后分別置于-80℃保存。2、總RNA的提取和cDNA的獲得采用RNApreppure試劑盒(TRANSGENBIOTECH)分別提取上述野生大豆不同組織(包括幼葉、老葉、莖、花、種莢、下胚軸、根尖)的總RNA；以總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA。3、Real-timePCR以上述cDNA為模板，采用Primer-qS和Primer-qAS引物，通過Real-timePCR對GsERF71基因進行表達量檢測。引物序列如下所示：Primer-qS：5’-GGAACGGTTATTTGGGTGGC-3’；Primer-qAS：5’-TCGTGGATTGTCCATCATAGTACG-3’。Real-timePCR反應的條件：95℃2min→[95℃15s→60℃30s]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。Real-timePCR采用比較CT法(ΔΔCT)計算基因表達量，以野生大豆GsGAPDH基因為內參基因，以未經處理的樣品作為對照。目標基因表達差異通過經過處理的樣本相對于每個時間點未經處理的樣本的倍數來表示。每個樣品包括3次生物學重復和3次技術重復，數據取3次生物學重復的平均值，如果有一個數值的偏差比較大則取兩個數據的平均值。原始數據經標準化處理。標準化處理后的數據經T-test進行差異顯著性分析。相對表達量計算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT處理-ΔCT對照)＝2-[(CT處理目的基因-CT處理內參基因)-(CT對照目的基因-CT對照內參基因)]。內參基因引物序列如下所示：GsGAPDHS：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；GsGAPDHAS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。結果如圖2所示：GsERF71基因主要在野生大豆的營養組織中有所表達，且在下胚軸及根尖中表達量相對較高，約為新葉中的100-200倍。表明GsERF71基因主要參與野生大豆生長發育過程，尤其是根的生長發育或根部的營養物質及離子吸收轉運過程。實施例3、基因槍轟擊介導的GsERF71基因瞬時表達與目的蛋白的亞細胞定位分析1、亞細胞定位載體的構建以野生大豆總cDNA為模板，采用GsERF71-YS和GsERF71-YAS引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，即GsERF71基因，引物序列如下所示(下劃線標注引入的酶切位點序列，其左側為保護堿基)：GsERF71-YS：5'-CCGCTCGAGATGTGTGGCGGTGCCATCATC-3'；GsERF71-YAS：5'-GCTCTAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCAACC-3'。PCR擴增體系：20μL5×PrimeSTARTMHSPCR緩沖液，8μLdNTPmix(A、G、T、C、各2.5mM)，2μL上下游引物(10μM)，1μL稀釋100倍(含目的基因的質粒)的通用模板，1μL高保真酶[PrimeSTARDNAPolymerase(TaKaRa)]，無菌ddH2O補足體積(總體積100μL)。PCR反應條件：98℃8min；98℃10s，62℃10s，72℃1min，30個循環；72℃10min；4℃終止反應。用XhoI和XbaI限制性內切酶對上述PCR擴增產物和pBSK-35S-eGFP載體進行雙酶切，連接，得到含GsERF71基因的亞細胞定位載體。對含GsERF71基因的亞細胞定位載體進行測序驗證表明：含GsERF71基因的亞細胞定位載體為將pBSK-35S-eGFP載體的BamHI和SpeI酶切位點間的DNA片段替換為序列表中序列1所示的GsERF71基因，且保持pBSK-35S-eGFP載體的其他序列不變得到的載體。2、基因槍轟擊介導的GsERF71基因瞬時表達采用基因槍法將上述含GsERF71基因的亞細胞定位載體轟擊洋蔥表皮細胞(具體方法參見美國Bio-Rad伯樂Helios基因槍系統說明書)，以pBSK-35S-eGFP空載體為陽性對照，剪取轟擊過含GsERF71基因的亞細胞定位載體和空載體的洋蔥表皮細胞，裝片，利用激光共聚焦顯微鏡下觀察。結果如圖3所示：GFP陽性對照在細胞內的整個區域都有表達，整個細胞均能夠檢測到綠色熒光信號，而GsERF71都主要定位在細胞核中。實施例4、野生大豆轉錄因子GsERF71蛋白的轉錄激活活性分析1、GsERF71基因的獲得以pEASY-GsERF71質粒為模板，采用GsERF71-BDS和GsERF71-BDAS引物進行PCR擴增，得到大小為903bp的PCR擴增產物，即為GsERF71基因，引物序列如下所示(下劃線標注引入的酶切位點序列)：GsERF71-BDS：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；GsERF71-BDAS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCAACC-3'。2、重組載體pGBKT7-GsERF71的構建用限制性內切酶BamHⅠ和PstI分別對pGBKT7載體和上述PCR擴增產物進行雙酶切，連接，得到pGBKT7-GsERF71重組載體，重組載體的結構圖如圖4A所示，對pGBKT7-GsERF71重組載體進行測序驗證。測序結果表明：pGBKT7-GsERF71重組載體為將pGBKT7載體的BamHⅠ和PstI酶切位點間的DNA片段替換為序列表中序列1所示的GsERF71基因，且保持pGBKT7載體的其他序列不變得到的載體。pGBKT7-GsERF71重組載體表達GsERF71蛋白。3、表達目的蛋白GsERF71的酵母菌的獲得將pGBKT7-GsERF71重組載體轉化酵母菌AH109，得到含質粒pGBKT7-GsERF71的酵母菌AH109，酵母感受態細胞的制備(LiAc法)及小量LiAc/PEG法轉化酵母感受態細胞的具體步驟參見《分子克隆實驗指南》第三版及ClontechYeastProtocolsHandbook。4、報告基因β-半乳糖苷酶活性檢測將含質粒pGBKT7-GsERF71的酵母菌AH109用接種環在SD/-Trp固體培養基上劃線，以轉錄因子pGBKT7-AtDREB為陽性對照，以pGBKT7空載體為陰性對照，30℃培養3天后，將菌體影印到濾紙上，進行β-半乳糖苷酶活性檢測。GsERF71蛋白轉錄激活活性分析結果如圖4B所示：陰性對照不能使底物變藍，陽性對照和含pGBKT7-GsERF71的基因酵母菌AH109都能使底物變藍，說明報告基因β-半乳糖苷酶表達，GsERF71基因所表達蛋白具有自激活功能，這與其家族中大部分成員都具備轉錄激活活性是一致的。5、GsERF71蛋白不同缺失片段的酵母表達載體構建本研究還分別設計了四對引物對GsERF71蛋白的不同區域進行擴增，構建了含有GsERF71蛋白不同片段的重組載體。具體構建方法如下：(1)以pEASY-GsERF71質粒為模板，分別采用如下四對引物進行PCR擴增，分別得到PCR擴增產物，即為GsERF71蛋白的不同區域的編碼基因(如圖4C所示)。引物設計如下：GsERF71-BD(1-74)S：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；GsERF71-BD(1-74)AS：5'-AAAACTGCAGAGATTCTTCCTCTGCCTCTTCACC-3'；GsERF71-BD(1-131)S：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；GsERF71-BD(1-131)AS：5'-AAAACTGCAGCGGGGAAATTCACCTTAGCCTTTTT-3'；GsERF71-BD(74-300)S：5'-CGCGGATCCGTTACAGAGGGATTCGGCAGCG-3'；GsERF71-BD(74-300)AS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCA-3'；GsERF71-BD(131-300)S：5'-CGCGGATCCGTAACGAGGACGACGAATATTCC-3'；GsERF71-BD(131-300)AS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCA-3'；GsERF71-BD(71-141)S：5'-CGCGGATCCGTAGGAAGAATCTCTACAGAGGGATTC-3'；GsERF71-BD(71-141)AS：5'-AAAACTGCAGCTTGAATGGAATATTCGTCGTCC-3'。(2)用限制性內切酶BamHⅠ和PstI分別對pGBKT7載體和上述各個PCR擴增產物進行雙酶切，連接，分別得到如下含有GsERF71蛋白不同片段的重組載體：pGBKT7-GsERF71(1-74)重組載體、pGBKT7-GsERF71(1-131)重組載體、pGBKT7-GsERF71(74-300)重組載體、pGBKT7-GsERF71(131-300)重組載體、pGBKT7-GsERF71(71-141)重組載體。pGBKT7-GsERF71(1-74)重組載體表達序列2第1-74位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(1-131)重組載體表達序列2第1-131位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(74-300)重組載體表達序列2第74-300位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(131-300)重組載體表達序列2第131-300位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(71-141)重組載體表達序列2第71-141位氨基酸所示的蛋白。6、GsERF71蛋白轉錄激活區域分析采用上述步驟3中的方法，分別將獲得含有GsERF71蛋白不同片段的重組載體導入酵母菌AH09中，通過檢測報告基因HIS和LacZ的活性進一步分析GsERF71的轉錄激活區。將含有GsERF71蛋白不同片段的重組載體的酵母菌AH109以點點的方式接種在SD/-Trp/-His固體培養基上，以轉錄因子pGBKT7-AtDREB為陽性對照，以pGBKT7空載體為陰性對照，30℃培養3天檢測報告基因HIS的活性。結果如圖4D所示：陰性對照不能在雙缺的培養基上生長，陽性對照和含pGBKT7-GsERF71以及pGBKT7-GsERF71(74-300)和pGBKT7-GsERF71(131-300)重組載體的酵母菌都能在雙缺的培養基上生長，加入30mM3AT也沒有抑制其生長，說明在這些菌種中報告基因HIS表達。采用ONPG法定量檢測報告基因β-半乳糖苷酶活性，結果如圖4E所示。綜上，GsERF71蛋白第131-300位氨基酸含有GsERF71蛋白發揮轉錄激活功能必不可少的區域。實施例5、GsERF71與DRE或GCC元件的結合特異性分析1、DRE或GCC元件載體和突變載體的構建1)DRE或GCC元件載體構建A、DRE元件載體構建人工設計合成DRE順式作用元件，序列如下：DREsense：5'-AATTCTACCGACATTACCGACATTACCGACATGAGCT-3'；DREanti-sense：5'-CATGTCGGTAATGTCGGTAATGTCGGTAG-3'；用雙蒸水分別將人工合成的靶序列正義鏈寡核苷酸(DREsense：5'-AATTCTACCGACATTACCGACATTACCGACATGAGCT-3')和反義鏈寡核苷酸(DREanti-sense：5'-CATGTCGGTAATGTCGGTAATGTCGGTAG-3')配制成10μM的溶液，分別吸取5μL的靶序列正義鏈寡核苷酸和反義鏈寡核苷酸溶液在200μL離心管中，吹打混勻，94℃變性5min，然后緩慢冷卻至室溫，得到DRE順式作用元件片段。根據pHIS2.1載體(Clontech,VersionNo.PR732190)上多克隆酶切位點，在串聯三聯體兩端加入酶切位點，5’端為EcoRI，3’端為SacI。然后將1μLT4DNALigaseBuffer加入一個滅菌的EP管中，加入EcoRI和SacI酶切后的pHIS2載體和DRE順式作用元件片段，使摩爾比為1:3，室溫下加入1μLT4DNA連接酶，最后加水補足體積至10μL。輕彈外壁混勻，短暫快速離心，16℃孵育過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經酶切鑒定并測序獲得含有DRE順式作用元件的載體pHIS2.1-DRE。B、DRE元件載體構建人工設計合成GCC順式作用元件的序列設計如下：GCCsense：5'-AATTCTAGCCGCCGAGCCGCCGAGCCGCCGAGCT-3'；GCCanti-sense：5'-CGGCGGCTCGGCGGCTCGGCGGCTAG-3'。用雙蒸水分別將人工合成的靶序列正義鏈寡核苷酸(GCCsense：5'-AATTCTAGCCGCCGAGCCGCCGAGCCGCCGAGCT-3')和反義鏈寡核苷酸(GCCanti-sense：5'-CGGCGGCTCGGCGGCTCGGCGGCTAG-3')配制成10μM的溶液，分別吸取5μL的靶序列正義鏈寡核苷酸和反義鏈寡核苷酸溶液在200μL離心管中，吹打混勻，94℃變性5min，然后緩慢冷卻至室溫，得到GCC順式作用元件片段。根據pHIS2.1載體上多克隆酶切位點，在串聯三聯體兩端加入酶切位點，5’端為EcoRI，3’端為SacI。然后將1μLT4DNALigaseBuffer加入一個滅菌的EP管中，加入EcoRI和SacI酶切后的pHIS2載體和GCC順式作用元件片段，使摩爾比為1:3，室溫下加入1μLT4DNA連接酶，最后加水補足體積至10μL。輕彈外壁混勻，短暫快速離心，16℃孵育過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經酶切鑒定并測序獲得含有GCC順式作用元件的載體pHIS2.1-GCC。2)DRE或GCC元件突變體載體的構建C、DRE元件突變載體構建以DRE順式元件ACTCCG為基礎，設計突變元件，即將TACCGACAT中的第3位和第4位C突變為A。同樣，根據pHIS2.1載體上多克隆酶切位點，在串聯三聯體兩端加入酶切位點，5’端為EcoRI，3’端為SacI。人工設計合成的突變DRE順式作用元件，序列如下：mDREsense：5'-AATTCTATTGACATTATTGACATTATTGACATGAGCT-3'；mDREanti-sense：5'-CATGTCAATAATGTCAATAATGTCAATAG-3'。用雙蒸水分別將人工合成的靶序列正義鏈寡核苷酸(mDREsense：5'-AATTCTATTGACATTATTGACATTATTGACATGAGCT-3')和反義鏈寡核苷酸(mDREanti-sense：5'-CATGTCAATAATGTCAATAATGTCAATAG-3')配制成10μM的溶液，分別吸取5μL的靶序列正義鏈寡核苷酸和反義鏈寡核苷酸溶液在200μL離心管中，吹打混勻，94℃變性5min，然后緩慢冷卻至室溫，得到mDRE順式作用元件片段。根據pHIS2.1載體上多克隆酶切位點，在串聯三聯體兩端加入酶切位點，5’端為EcoRI，3’端為SacI。然后將1μLT4DNALigaseBuffer加入一個滅菌的EP管中，加入EcoRI和SacI酶切后的pHIS2載體和mDRE順式作用元件片段，使摩爾比為1:3，室溫下加入1μLT4DNA連接酶，最后加水補足體積至10μL。輕彈外壁混勻，短暫快速離心，16℃孵育過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經酶切鑒定并測序獲得含有DRE順式作用元件的載體pHIS2.1-mDRE。D、GCC元件突變載體構建將GCC元件保守序列AGCCGCC的第二位G突變為A，突變體的序列設計如下：mGCCsense：5'-AATTCTAACCGCCGAACCGCCGAACCGCCGAGCT-3'；mGCCanti-sense：5'-CGGCGGTTCGGCGGTTCGGCGGTTAG-3'。用雙蒸水分別將人工合成的靶序列正義鏈寡核苷酸(mGCCsense：5'-AATTCTAACCGCCGAACCGCCGAACCGCCGAGCT-3')和反義鏈寡核苷酸(mGCCanti-sense：5'-CGGCGGTTCGGCGGTTCGGCGGTTAG-3')配制成10μM的溶液，分別吸取5μL的靶序列正義鏈寡核苷酸和反義鏈寡核苷酸溶液在200μL離心管中，吹打混勻，94℃變性5min，然后緩慢冷卻至室溫，得到mGCC順式作用元件片段。根據pHIS2.1載體上多克隆酶切位點，在串聯三聯體兩端加入酶切位點，5’端為EcoRI，3’端為SacI。然后將1μLT4DNALigaseBuffer加入一個滅菌的EP管中，加入EcoRI和SacI酶切后的pHIS2載體和mGCC順式作用元件片段，使摩爾比為1:3，室溫下加入1μLT4DNA連接酶，最后加水補足體積至10μL。輕彈外壁混勻，短暫快速離心，16℃孵育過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經酶切鑒定并測序獲得含有GCC順式作用元件的載體pHIS2.1-mGCC。2、pGADT7-GsERF71酵母表達載體的構建以pEASY-GsERF71質粒為模板，采用GsERF71-ADS和GsERF71-ADAS引物進行PCR擴增，得到903bp的PCR擴增產物，即為GsERF71基因，引物序列如下所示(下劃線標注引入的酶切位點序列)：GsERF71-ADS：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；GsERF71-ADAS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCAACC-3'。用限制性內切酶BamHⅠ和PstI分別對pGADT7載體(Clontech，VersionNo.PR732196)和上述PCR擴增產物進行雙酶切，連接，得到pGADT7-GsERF71重組載體，并對重組載體進行測序驗證。3、空載體pGADT7/pHIS2.1的3-AT濃度的選擇采用LiAc法制備酵母感受態細胞，并用小量LiAc/PEG法將空載體pGADT7和pHIS2.1共轉化酵母感受態，得到重組酵母pGADT7/pHIS2.1，將轉化子分別接種到含不同濃度的3-AT濃度的SD/-Leu/-Trp/-His的平板培養基上30℃培養2-3天。發現重組酵母在含有0mM、10mM、30mM3-AT的SD/-Trp/-His固體培養基上可以生長出一些菌落，而在50mM3-AT的SD/-Trp/-His固體培養基上只能長出幾個菌落，在70mM3-AT的SD/-Trp/-His固體培養基上則不能生長。由于過高的3-AT會抑制或殺死剛轉化的酵母細胞，因此，將50mM的3-AT濃度作為抑制酵母HIS滲漏表達的最適濃度。4、GsERF71在酵母細胞內與DRE或GCC元件的結合特異性分析將重組載體pGADT7-GsERF71分別與含有不同順式作用元件的載體pHIS2.1-DRE、pHIS2.1-mDRE、pHIS2.1-GCC或pHIS2.1-mGCC及空載體pHIS2.1共轉化酵母菌株AH109，分別得到重組酵母GsERF71/DRE、GsERF71/mDRE、GsERF71/GCC、GsERF71/mGCC和GsERF71/pHIS2.1。分別將重組酵母pGADT7/pHIS2.1、GsERF71/pHIS2.1、GsERF71/DRE、GsERF71/mDRE、GsERF71/GCC和GsERF71/mGCC在含50mM3-AT的SD/-Leu/-Trp/-His平板上劃線，30℃培養3-7d。結果如圖5b所示，只有含有GsERF71蛋白和正常的DRE或GCC元件的重組酵母能夠正常生長，而其余重組酵母生長都受到明顯抑制。該結果表明GsERF71在酵母體內能夠特異性結合DRE或GCC元件，從而激活報告基因HIS的表達。實施例6、轉GsERF71擬南芥植株的獲得及在其堿脅迫下的表型分析一、轉GsERF71擬南芥植株的獲得1、GsERF71基因的獲得以實施例1中的步驟4得到的pEASY-BluntZero-GsERF71為模板，采用引物Primer-ES和Primer-EAS進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，即GsERF71基因。引物序列如下：Primer-ES：5’-TTACCCGGGATGTGTGGCGGTGCCAT-3’；Primer-EAS：5’-CCGTCTAGACTAATCGAAACTCCAGAGAT-3’。PCR擴增體系(10μl)：模板1μl，buffer1μl，dNTPMixture(2.5mM)0.4μl，Primer-UA0.5μl，Primer-UAS0.5μl，PfuCxDNAPolymerase(TaKaRa)0.2μl，ddH2O6.4μl。PCR擴增條件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環；72℃10min；4℃終止反應。2、植物表達載體的獲得用限制性內切酶SmaI和XbaI對pCAMBIA2300載體和上述PCR擴增產物進行酶切，連接，得到重組載體pCAMBIA2300-GsERF71。并對其進行測序驗證。測序結果表明：重組載體pCAMBIA2300-GsERF71為將pCAMBIA2300載體的SmaI和XbaI酶切位點之間的DNA片段替換為序列表中序列1所示的GsERF71基因，且保持pCAMBIA2300載體的其他序列不變得到的載體。重組載體pCAMBIA2300-GsERF71表達序列2所示的GsERF71蛋白質。3、轉化采用凍融法將重組載體pCAMBIA2300-GsERF71轉化至根癌農桿菌LBA4404中，經PCR鑒定得到陽性轉化子(含有序列表中序列1所示的GsERF71基因的轉化子)，用于侵染擬南芥植株。4、轉GsERF71擬南芥的獲得將含有重組載體pCAMBIA2300-GsERF71的農桿菌通過Floral-dip法侵染野生型擬南芥(哥倫比亞生態型col-0)，將侵染過的擬南芥進行培養，得到T0代轉GsERF71擬南芥種子。將T0代轉GsERF71擬南芥種子表面消毒后，播種于含25mg/L固殺草(glufosinate-ammonium，Sigma，45520)的1/2MS培養基上篩選，得到T1代轉GsERF71擬南芥幼苗。如此重復，直至得到T3代轉GsERF71擬南芥純合體株系。提取T3代轉GsERF71擬南芥幼苗的總RNA進行RT-PCR鑒定。具體步驟如下：提取T3代轉GsERF71擬南芥幼苗的總RNA，反轉錄得到cDNA；以cDNA為模板，分別采用Primer-qS和Primer-qAS引物對和ActinS和ActinAS引物對，通過RT-PCR對GsERF71基因進行表達量檢測，得到PCR擴增產物。引物序列如下所示：Primer-qS：5'-GGAACGGTTATTTGGGTGGC-3'；Primer-qAS：5'-TCGTGGATTGTCCATCATAGTACG-3'；ActinS：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；ActinAS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。PCR擴增體系：5μL2×EasyTaqDNAPolymerase，0.8μL上下游引物(10μM)，1μL稀釋100倍的cDNA，無菌ddH2O補足體積(總體積10μL)。PCR擴增條件：GsERF71：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×30→72℃10min→4℃終止反應；Actin2：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×28→72℃10min→4℃終止反應。將PCR擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，檢測結果如圖6所示：野生型擬南芥植株的RT-PCR無擴增產物，而T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32均可以擴增出目的條帶，表明外源基因GsERF71基因不但已順利整合到擬南芥的基因組上，而且能夠在轉基因擬南芥中正常轉錄表達。選取T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32用于下一步的表型分析。三、轉GsERF71擬南芥植株在堿脅迫下的表型分析1、轉GsERF71擬南芥在堿處理下的萌發期表型及存活率選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)、T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32種子，用5％次氯酸鈉消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，一部分播種于正常培養基，觀察表型并統計存活率；一部分播種于含有6mMNaHCO3的1/2MS固體培養基和含有8mMNaHCO3的1/2MS固體培養基上，每天觀察表型并統計存活率，七天后統計展葉率。所有實驗技術重復和生物學重復各3次。每次實驗每個株系播種90粒種子。結果如圖7所示：在正常條件下(即無任何脅迫未處理，control)，轉GsERF71擬南芥與野生型擬南芥種子的萌發狀態無顯著差異，說明導入的GsERF71基因并未對擬南芥萌發期的生長、發育造成影響；在6mMNaHCO3和8mMNaHCO3脅迫下，轉GsERF71擬南芥與野生型擬南芥的萌發都受到抑制，在種子萌發速率的統計結果中無顯著差異，但T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32的展葉率明顯高于野生型擬南芥，轉GsERF71擬南芥生長受抑制的程度明顯比野生型小。2、轉GsERF71擬南芥在堿處理下的幼苗期表型及根長統計選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)、T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32種子，用5％次氯酸鈉消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，播種于1/2MS固體培養基上。1周后，挑選長勢一致的轉GsERF71擬南芥和野生型擬南芥幼苗水平擺放于6mMNaHCO3脅迫培養基的平皿中，豎直生長，12d后觀察各處理組和非處理組的擬南芥長勢及根長，所有實驗技術重復和生物學重復各3次。每次實驗每個株系15株。結果如圖8所示：在正常條件下(即無任何脅迫未處理，control)，T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32與野生型擬南芥的生長發育并沒有顯著差異，表明導入的GsERF71基因并未在幼苗期對擬南芥的生長、發育造成影響；在NaHCO3脅迫處理條件下，轉GsERF71擬南芥與野生型擬南芥的生長都受到了抑制，但在6mMNaHCO3處理下，野生型生長抑制更明顯，轉GsERF71擬南芥的根長顯著長于野生型。因此超量表達GsERF71基因提高了擬南芥在幼苗期對堿脅迫的耐性。3、轉GsERF71擬南芥在100mMNaHCO3處理下的成苗期表型選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)、T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32種子，4℃春化3d后，播種于營養缽中(營養土，君子蘭土，蛭石按1：1：1混合)，置于溫室中培養(22℃，光照16h/d)。3周后，對于堿處理的苗每2-3d澆灌一次100mMNaHCO3溶液。16d后觀察各處理組和非處理組的擬南芥長勢，并測定處理組和非處理組葉綠素及丙二醛含量(檢測方法參見文獻“植物生理實驗/郝再彬等主編哈爾濱工業大學出版社，2004.9”)。所有實驗技術重復和生物學重復各3次。每次實驗每個株系40株。100mMNaHCO3處理下轉GsERF71擬南芥與野生型擬南芥的長勢情況如圖9a所示：在正常條件下(即無任何脅迫未處理，處理前)，T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32與野生型擬南芥的成苗生長發育情況并沒有顯著差異，表明導入的GsERF71基因并未在成苗期對擬南芥的生長、發育造成影響；對于澆灌100mMNaHCO3溶液的成苗，野生型大部分葉片發黃、卷曲最終死亡，但轉GsERF71擬南芥葉片發生輕度萎蔫，基本都完全存活并開始生殖生長，且轉GsERF71擬南芥的存活率明顯高于野生型。100mMNaHCO3處理下轉GsERF71擬南芥與野生型擬南芥的葉綠素含量及丙二醛含量測定結果如圖9b和9c所示：由圖9可見，在澆灌100mMNaHCO3溶液情況下，野生型葉片失綠程度要大于轉基因擬南芥，通過測定葉綠素含量可知，在脅迫處理下野生型與轉基因植株葉綠素含量都有所下降，但野生型的降低幅度明顯比轉基因株系要大，說明野生型植株的光合系統受到的傷害程度更大；丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產物之一，其含量可以反映植物遭受傷害的程度，如圖9所示，堿脅迫處理后，野生型與轉基因植株的MDA含量均有所上升，說明所有植株均受到不同程度堿脅迫的傷害，但是與野生型相比，轉GsERF71的擬南芥MDA含量上升的幅度顯著低于野生型，說明其膜脂氧化程度較低，受到脅迫的傷害較輕。成苗期堿脅迫實驗說明GsERF71基因可以正向調節擬南芥的耐堿性。4、轉GsERF71擬南芥植株中脅迫相關Marker基因的表達模式分析1)植物材料的處理選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態型)和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32種子，用5％次氯酸鈉消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，播種于1/2MS固體培養基上。10天后，挑選長勢一致的T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30、T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32和野生型擬南芥幼苗進行50mMNaHCO3脅迫處理，分別在處理0h、6h、12h時間點取材作為待測樣品，每個株系每個時間點取三株植株作為三次生物學重復。迅速放于液氮中冷凍，然后置于-80℃保存。2)總RNA的提取和cDNA的獲得采用RNApreppure試劑盒(TRANSGENBIOTECH)分別提取上述步驟獲得的不同時間處理后的待測組織樣品的總RNA；以獲得總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA。3)Real-timePCR以上述cDNA為模板，通過Real-timePCR分析了脅迫信號通路中可能起關鍵作用的marker基因包括堿脅迫相關基因H+-Ppase、NADP-ME、H+-ATPase和非生物脅迫應答基因COR47、KIN1、RD29A在野生型植株及轉GsERF71擬南芥植株中的表達量。引物序列如下所示：NADP-MES：5'-TGGTCTGATCTACCCGCCATT-3'；NADP-MEAS：5'-CGCCAATCCGAGGTCATAGG-3'；H+-PpaseS：5'-ATGACGATGATGAAGAAGAAGAAGAT-3'；H+-PpaseAS：5'-TTTTTTAACCACCTACGGTAAACG-3'；H+-ATPaseS：5'-GGCAGCCCTCTACCTACAAGTC-3'；H+-ATPaseAS：5'-AGCAATCATAAAAGCACCCAAT-3'；COR47S：5'-GGAGTACAAGAACAACGTTCCCGA-3'；COR47AS：5'-TGTCGTCGCTGGTGATTCCTCT-3'；RD29AS：5'-ATGATGACGAGCTAGAACCTGAA-3'；RD29AAS：5'-GTAATCGGAAGACACGACAGG-3'；KIN1S：5'-AACAAGAATGCCTTCCAAGC-3'；KIN1AS：5'-CGCATCCGATACACTCTTTCC-3'。Real-timePCR反應的條件：95℃2min→[95℃15s→60℃30s]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。Real-timePCR采用比較CT法(ΔΔCT)計算基因表達量，以擬南芥Actin基因為內參基因，以未經處理的樣品作為對照。目標基因表達差異通過經過處理的樣本相對于每個時間點未經處理的樣本的倍數來表示。每個樣品包括3次生物學重復和3次技術重復，數據取3次生物學重復的平均值，如果有一個數值的偏差比較大則取兩個數據的平均值。原始數據經標準化處理。標準化處理后的數據經T-test進行差異顯著性分析。相對表達量計算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT處理-ΔCT對照)＝2-[(CT處理目的基因-CT處理內參基因)-(CT對照目的基因-CT對照內參基因)]。內參基因引物序列如下所示：ActinS：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；ActinAS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。結果如圖10所示：在T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#30和T3代轉GsERF71擬南芥純合株系#32中H+-ATPase基因、COR47基因、KIN1基因和RD29A基因都能被堿脅迫顯著誘導表達，然而在野生型中表達量則顯著低于超量表達植株。以上結果表明GsERF71基因的超量表達能夠促進脅迫應答基因的表達，從而抵抗堿脅迫。序列表<110>東北農業大學<120>一種與植物抗逆性相關蛋白GsERF71及其編碼基因與應用<160>4<210>1<211>903bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atgtgtggcggtgccatcatcgctgacttcataccccgccgtgtaggccgccgcctcacg60gcctccgagctctggccaaactccttcggcaaagacgatgactttgacttggattactcc120cacatggctacccaacaaccctccactctcaaaaggtcccaacctcccaaagttagcgag180caggttgagaataagccggtgaagaggcagaggaagaatctctacagagggattcggcag240cgtccgtggggcaaatgggccgcggagattcgcgatcctagaaaaggggttcgtgtctgg300ttgggcacctttaacaccgcagaagaagccgcgagagcctacgatcgtgaagctcgaaaa360atccgaggcaaaaaggctaaggtgaatttccccaacgaggacgacgaatattccattcaa420gctcgtaatccaattctaccccttcctttcgctccacaacaccctcccctgtaccagcaa480cagtaccgttgcgatctcaacaatgcccctaaaaatctcaactttgagttcggttacgac540ctgaaccacgcggaggcgtttccatcccgcgtggacgccgtcaacgctgactcggtggtt600gtctccgttgatgaaaattcggggtcagcgtcgggttcagagggtgcttattcgacaacg660gagttcatggggtccgttcagaacgggaacggttatttgggtggtacggtaatggagaag720aaggagaaagagacagaggttattgaagctgaagaagaaaagaacgaagtgctggagctt780tctgaggagctgatggcgtacgaaaattacatgaagttttatcagattccgtactatgat840ggacaatccacgacgaataatgttcaggaaagcttggttggggatctctggagtttcgat900tag903<210>2<211>300<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2MetCysGlyGlyAlaIleIleAlaAspPheIleProArgArgValGly151015ArgArgLeuThrAlaSerGluLeuTrpProAsnSerPheGlyLysAsp202530AspAspPheAspLeuAspTyrSerHisMetAlaThrGlnGlnProSer354045ThrLeuLysArgSerGlnProProLysValSerGluGlnValGluAsn505560LysProValLysArgGlnArgLysAsnLeuTyrArgGlyIleArgGln65707580ArgProTrpGlyLysTrpAlaAlaGluIleArgAspProArgLysGly859095ValArgValTrpLeuGlyThrPheAsnThrAlaGluGluAlaAlaArg100105110AlaTyrAspArgGluAlaArgLysIleArgGlyLysLysAlaLysVal115120125AsnPheProAsnGluAspAspGluTyrSerIleGlnAlaArgAsnPro130135140IleLeuProLeuProPheAlaProGlnHisProProLeuTyrGlnGln145150155160GlnTyrArgCysAspLeuAsnAsnAlaProLysAsnLeuAsnPheGlu165170175PheGlyTyrAspLeuAsnHisAlaGluAlaPheProSerArgValAsp180185190AlaValAsnAlaAspSerValValValSerValAspGluAsnSerGly195200205SerAlaSerGlySerGluGlyAlaTyrSerThrThrGluPheMetGly210215220SerValGlnAsnGlyAsnGlyTyrLeuGlyGlyThrValMetGluLys225230235240LysGluLysGluThrGluValIleGluAlaGluGluGluLysAsnGlu245250255ValLeuGluLeuSerGluGluLeuMetAlaTyrGluAsnTyrMetLys260265270PheTyrGlnIleProTyrTyrAspGlyGlnSerThrThrAsnAsnVal275280285GlnGluSerLeuValGlyAspLeuTrpSerPheAsp290295300<210>3<211>17bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3atgtgtggcggtgccat17<210>4<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4ctaatcgaaactccagagat20當前第1頁1 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