骨髓間充質干細胞作為治療正己烷致周圍性神經病的藥物的應用的制作方法
【專利摘要】本發明所述的骨髓間充質干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）的具體應用，解決了傳統上沒有針對正己烷致周圍性神經病進行有效治療的藥物的問題，為治療該種神經病提出了新的思路和具體應用，它以患有正己烷致周圍性神經病的大鼠作為實驗對象，通過步態評分，神經電生理（神經傳導潛伏期、神經傳導速度），脊髓和坐骨神經的砂羅鉻花青染色、掃描電鏡、髓鞘堿性蛋白和低分子量神經絲為檢測指標；結果顯示，MSCs作為一種藥物，對正己烷致周圍性神經病大鼠有顯著的修復作用，它將在職業中毒致周圍性神經病的治療中發揮重要作用。
【專利說明】骨髓間充質干細胞作為治療正己烷致周圍性神經病的藥物
的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種骨髓間充質干細胞的應用，特別是一種骨髓間充質干細胞作為治療正己烷致周圍性神經病的藥物的應用。
【背景技術】
[0002]慢性正己烷中毒患者的神經系統損傷(正己烷致周圍性神經病)，是由正己烷的最終代謝產物和終毒物2，5-己二酮(HD)所引起。其病理特點為軸索的神經絲積聚和節段性腫脹，并繼發節段性脫髓鞘改變，以長、粗纖維最為明顯。許多學者從軸索骨架蛋白、能量代謝障礙以及NGF信號轉導通路等方面，對正己烷中毒性周圍神經病的發病機制進行了研究，但迄今尚未十分明了。目前慢性正己燒中毒患者的治療，包括脫離接觸、保證患者有足夠營養、給予B族維生素、能量合劑、活血化瘀、通絡補腎的中藥、及輔以針灸、理療、和四肢運動功能鍛煉，尚無特效藥物治療。因此現在需要找到或開發出一種能夠治療正己烷致周圍性神經 病的藥物。
【發明內容】
[0003]本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種能夠治療正己烷致周圍性神經病藥物的相關應用，特別是骨髓間充質干細胞作為治療正己烷致周圍性神經病的藥物的應用。
[0004]本發明的技術解決方案是:一種骨髓間充質干細胞作為治療正己烷致周圍性神經病的藥物的應用。
[0005]本發明同現有技術相比，具有如下優點:
本發明所述的骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的具體應用，解決了傳統上沒有針對正己烷致周圍性神經病進行有效治療的藥物的問題，為治療該種神經病提出了新的思路和具體應用，它以患有正己烷致周圍性神經病的大鼠作為實驗對象，通過步態評分，神經電生理(神經傳導潛伏期、神經傳導速度)，脊髓和坐骨神經的砂羅鉻花青染色、掃描電鏡、髓鞘堿性蛋白(MBP)和低分子量神經絲(低分子量神經絲)為檢測指標；結果顯示，MSCs作為一種藥物，對正己烷致周圍性神經病大鼠有顯著的修復作用，它將在職業中毒致周圍性神經病的治療中發揮重要作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0006]圖1骨髓間充質干細胞的生物學特性。
[0007]圖2 MSCs移植對大鼠行為能力的影響。
[0008]圖3 MSCs移植對大鼠神經電生理的影響。
[0009]圖4脊髓橫切面的砂羅鉻花青染色(X 200)。
[0010]圖5坐骨神經橫切面的砂羅鉻花青染色(X200)。[0011]圖6脊髓橫切面的掃描電鏡檢測。
[0012]圖7坐骨神經橫切面的掃描電鏡檢測。
[0013]圖8 MSCs移植對髓鞘堿性蛋白mRNA表達的影響。
[0014]圖9 MSCs移植對髓鞘堿性蛋白表達的影響。
[0015]圖10 MSCs移植對低分子量神經絲mRNA表達的影響。
[0016]圖11 MSCs移植對低分子量神經絲蛋白表達的影響。
【具體實施方式】
[0017]首先進行骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離培養:
大鼠脫白處死，75%乙醇浸沒消毒，無菌剝離股骨及脛骨，去掉干骺端，使骨髓腔暴露，PBS反復沖洗，收集細胞過篩網并離心，用含10%血清的DMEM培養液重懸細胞并接種于培養皿中，在37 °C、CO2飽和濕度培養箱中培養，24h后換液。以后3d換液I次，待細胞達到80%~90%融合時傳代，利用差速貼壁法逐步純化MSCs。取第3代生長狀態良好的細胞，利用單克隆抗體⑶90、⑶45進行流式檢測，以對MSCs進行鑒定。
[0018]建立正己烷致周圍神經病的大鼠模型:
輕度疾病模型——200 mg/kg 2，5-己二酮大鼠腹腔注射，I天I次，I周5次，連續6周。
[0019]重度疾病模型-400 mg/kg 2，5_己二酮大鼠腹腔注射，I天I次，I周5次,連
續6周
建立正己烷致周圍神經病模型的檢測平臺:
一般情況觀察，包括發育情況、行動、皮毛、飲食、體重等。
[0020]神經電生理檢測:大鼠乙醚麻醉，俯臥位放置于大鼠固定器內，暴露尾部。在尾部距離尾部起始點的3cm、10cm、15cm處分別標記為A、B、C點，A點放置刺激電極,B點及C點放置記錄電極，記錄AB間、AC間的神經傳導潛伏期,按照公式MCV=Length BC/Latency BC(Length BC為BC兩點間距離，Latency BC為BC兩點間潛伏時間)計算神經傳導速度。
[0021]脊髓和坐骨神經的砂羅鉻花青染色:石蠟切片脫蠟至水，按照試劑盒說明，滴加砂羅鉻花青染色20min，流水洗2min，滴加硫酸鐵銨，至膠原纖維呈淡灰色，髓鞘呈清晰藍色，流水沖洗5min，滴加熒光桃紅復染數秒，稍水洗，常規脫水透明，中性樹膠封片。
[0022]脊髓和坐骨神經的掃面電鏡檢測:大鼠麻醉、固定，固定液為2.5%多聚甲醛+2.0%戊二醛0.lmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.4)，固定完成后取脊髓和坐骨神經。迅速將脊髓和坐骨神經，置于上述灌注液中繼續固定24h，IOg /L鋨酸固定lh，丙酮梯度脫水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在SOkV電壓下用H-600型透射電鏡觀察并攝片。
[0023]脊髓和坐骨神經的髓鞘堿性蛋白檢測:分別用real time PCR和Western blot檢測髓鞘堿性蛋白的mRNA水平和蛋白水平的表達。
[0024]脊髓和坐骨神經的低分子量神經絲檢測:分別用real time PCR和Western blot檢測低分子量神經絲的mRNA水平和蛋白水平的表達。
[0025]MSCs移植正己烷致周圍神經病大鼠:
每只模型大鼠尾靜脈移植IXlO6 MSCs0按照建立正己烷致周圍神經病模型檢測平臺的操作步驟進行檢測。
[0026]結果
大鼠骨髓骨髓間充質干細胞體外培養和鑒定:
原代細胞接種72h后，大部分細胞貼壁，10-15天后細胞達到80%~90%融合，進行傳代。培養3代以后，細胞形態趨向均一，類似成纖維細胞樣，呈束狀或漩渦狀有序排列(圖W。取第3代細胞進行流式檢測，表面分子⑶90和⑶45的陽性表達率分別為96.61%和0.40%(圖1B、1C)。培養所得細胞為移植可用的MSCs。
[0027]在圖1A中，第三代骨髓間充質干細胞，細胞形態均一，類似成纖維細胞樣，呈束狀或漩渦狀有序排列；在圖1B中，流式檢測顯示96.61%的細胞表達CD90 ;在圖1C中，流式檢測顯示0.40%的細胞表達⑶45。
[0028]正己烷致周圍神經病模型的建立:
對照組動物發育正常、行動迅速、毛色有光澤，實驗過程中無步態異常。中毒大鼠模型攝食減少、毛色晦暗、行動遲緩甚至癱瘓、體重增長緩慢甚至下降。至染毒第5周，輕度中毒大鼠出現明顯的以膝關節下降和拖尾為特征的運動異常，重度中毒大鼠后肢拖拉、完全無法站立、后掌上翻，步態評分均隨染毒時間的延長而逐漸增高。對照組大鼠步態始終正常。
[0029]MSCs移植對正己烷致周圍神經病的影響:
行為能力觀察=MSCs移植后，輕度及重度模型大鼠的行為能力都得到明顯改善(圖2)。
[0030]圖2A、圖2D為正常對照大鼠，活動自如；圖2B為輕度中毒大鼠，出現明顯的以膝關節下降和拖圖2A尾為特征的運動異常；圖2C為輕度中毒大鼠移植MSCs后，后肢外展程度減輕；圖2E為重度中毒大鼠，出現后肢拖拉和完全無法站立，后掌上翻；圖2F為重度中毒大鼠移植MSCs后，略有恢復，后掌上翻消失，后肢可以撐地，但有外展。
[0031]神經電生理檢測:MSCs移植后，輕度、重度模型大鼠的神經傳導潛伏期逐漸縮短，神經傳導速度逐漸變快(圖3A、3B)。MSCs移植能明顯改善正己烷致周圍神經病大鼠的神經電生理。
[0032]通過圖3A能夠看出，MSCs移植后，中毒大鼠的神經傳導速度逐漸加快,基本恢復正常；通過圖3B能夠看出，MSCs移植后，中毒大鼠的神經傳導潛伏期逐漸縮短，基本接近正
堂
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[0033]脊髓和坐骨神經的砂羅鉻花青染色:中毒大鼠的脊髓和坐骨神經均出現明顯的脫髓鞘和神經纖維排列紊亂，MSCs移植后脫髓鞘和神經纖維排列紊亂現象均得到明顯改善(圖4，圖5)。
[0034]圖4A，正常大鼠脊髓白質結構致密規整；圖4B，輕度中毒大鼠，脊髓白質結構疏松，部分區域出現脫髓鞘；圖4C，輕度中毒大鼠移植MSCs，脊髓白質結構較致密，脫髓鞘現象部分恢復；圖4D，重度中毒大鼠，嚴重脫髓鞘，部分區域有空泡結構形成；圖4E，重度中毒大鼠移植MSCs，脫髓鞘現象改善，空泡結構基本消失。
[0035]圖5A，正常大鼠，有髓纖維分布密集且均勻，單個纖維飽滿；圖5B，輕度中毒大鼠，軸索稀疏，部分軸突出現萎縮；圖5C，輕度中毒大鼠移植MSCs，軸突萎縮現象部分改善；圖5D，重度中毒大鼠，軸索稀疏排列，軸突出現明顯萎縮；圖5E，重度中毒大鼠移植MSCs，軸索間隙明顯縮小，軸突萎縮明顯改善。
[0036]脊髓和坐骨神經的掃描電鏡檢測:MSCs移植后，中毒大鼠的脊髓脫髓鞘和脊髓分層增多現象明顯改善，坐骨神經的髓鞘凹陷和神經絲密度不均勻現象基本消失(圖6，圖7)。
[0037]圖6A.正常大鼠，髓鞘結構完整；圖68，輕度中毒大鼠，部分髓鞘向軸突凹陷，出現輕度脫髓鞘；圖6C，輕度中毒大鼠移植MSCs，髓鞘凹陷部分恢復，脫髓鞘現象部分消失；圖6D，重度中毒大鼠，嚴重脫髓鞘，髓鞘分層明顯增多；圖6E，重度中毒大鼠移植MSCs，脫髓鞘現象部分恢復，髓鞘分層部分減少。
[0038]圖7A，正常大鼠，髓鞘結構完整；圖7B，輕度中毒大鼠，部分髓鞘向軸突凹陷，軸突輕度萎縮；圖7(:，輕度中毒大鼠移植MSCs，髓鞘凹陷部分恢復，軸突部分恢復正常；圖70，重度中毒大鼠，髓鞘凹陷，軸突明顯萎縮；圖7E，重度中毒大鼠移植MSCs，髓鞘凹陷部分恢復，軸突部分恢復正常。
[0039]脊髓和坐骨神經的髓鞘堿性蛋白檢測=Ptl是周圍神經髓鞘上的一種主要結構蛋白，占組織蛋白總量的50%以上，在周圍神經髓鞘組織中發揮了粘附、信號轉導等重要作用。real time PCR和WB檢測均顯示，MSCs移植后中毒大鼠脊髓和坐骨神經中髓鞘堿性蛋白的mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著恢復(圖8，圖9)。
[0040]圖8A和圖8B，MSCs移植對輕度、重度中毒大鼠脊髓髓鞘堿性蛋白mRNA表達的影響；圖8C和圖8D，MSCs移植對輕度、重度中毒大鼠坐骨神經髓鞘堿性蛋白mRNA表達的影響。
[0041]脊髓和坐 骨神經的低分子量神經絲(低分子量神經絲)檢測:NF在維持神經細胞的形態和運動功能、維持軸突的空間構型及其正常的神經信號傳導速度中發揮重要的作用。2，5-HD染毒干擾了 NF正常的組裝和去組裝之間的平衡，干擾了動態池中的NF單體和靜態池中的NF網狀骨架之間的動態交換，故引起神經絲結構紊亂。MSCs移植后，低分子量神經絲水平得到明顯恢復(圖10，圖11)。
[0042]圖1OA和圖10B，MSCs移植對輕度、重度中毒大鼠脊髓低分子量神經絲mRNA表達的影響；圖1OC和圖10D，MSCs移植對中毒大鼠坐骨神經低分子量神經絲mRNA表達的影響。
[0043]圖1lA和圖11B，MSCs移植中毒大鼠脊髓低分子量神經絲蛋白表達的影響；圖11C，和圖llD，MSCs移植對中毒大鼠坐骨神經低分子量神經絲蛋白表達的影響。
[0044]綜上所述，MSCs移植到正己烷致周圍性神經病大鼠體內，能顯著修復其受損神經組織的組織結構，改善神經電生理功能，并使其神經行為趨向正常。MSCs可作為治療正己烷致周圍性神經病的一種新方法。
【權利要求】
1.一種骨髓間充質 干細胞作為治療正己烷致周圍性神經病的藥物的應用。
【文檔編號】A61K35/28GK103919806SQ201410139573
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】樸豐源, 李雙月, 王哲敏, 董偉, 陳若霖, 戚媛, 劉爽 申請人:大連醫科大學