一種可降解環境激素雙酚A的紅球菌DSH及其應用的制作方法

本發明涉及生物工程技術領域，具體是一種可降解環境激素雙酚a的紅球菌dsh及其應用。

背景技術：

在過去半個世紀，環境激素對人類和野生動物賴以生存的自然環境造成了嚴重的危害，已經成為全球范圍內共同亟待解決的環境污染問題，引起了人們的廣泛關注。環境激素作為一種常見的內分泌干擾物，與機體正常情況下分泌的雌性激素在結構和功能上類似。一旦進入機體，不僅可以擾亂機體正常的內分泌激素的合成與代謝，影響生長發育和性別分化，還能引起神經、內分泌、免疫等多系統發育異常和生殖障礙，甚至致畸和致癌等。

環境激素能夠利用洋流作用從低緯度地域轉移至高緯度地域，乃至能夠到達極地生態系統。另外，由于環境激素能通過食物鏈在高等生物體內富集和放大，對人類健康和動物生態安全產生巨大威脅。雙酚a(bisphenola，bpa)，在眾多的外源性內分泌干擾物中被公認為是對環境的潛在影響和危害最大的幾種雌激素之一。首先，污染范圍廣，在空氣、土壤以及河流中都檢測到bpa，且濃度達到ng/l級。其次，在人體內沒有特定的代謝系統，難以降解，去除上有較大困難，對人類健康危害較大。因此，受到了國內外研究者的廣泛關注。

目前，去除環境中bpa的方法總體上可以分為物理方法、化學方法以及生物方法。物理方法主要是采用活性炭等吸附劑對bpa進行吸附去除；化學方法是采用高級氧化法氧化處理bpa，主要有電化學氧化法及催化氧化法等；生物方法主要是篩選、分離和馴化bpa降解菌對bpa進行去除。生物方法具有運行成本低、污染物去除徹底等優點，同時也是治理污水處理廠以及環境中受雌激素污染的水體和土壤的主要途徑。關于用生物方法去除環境中雌激素的課題，國內研究起步相對較晚，而且，研究者對環境激素的研究也主要集中在雌激素的毒理學研究、檢測方法探索以及雌激素污染的風險評價上，對環境激素的微生物降解特性及降解機理的研究較少，急需開展廣泛深入的研究。隨著環境激素污染的日益加劇，探尋一種高效、經濟、綠色的環境激素去除方法，對控制和治理環境激素污染具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種能夠穩定、高效的可降解環境激素雙酚a的紅球菌dsh及其應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種可降解環境激素雙酚a的紅球菌dsh，紅球菌屬(rhodococcussp.)，命名為紅球菌dsh，其保藏編號為cgmccno.12392；該紅球菌dsh于2016年4月25日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

所述紅球菌dsh的16srdna的片段的序列如序列表中seqidno：1所示。

作為本發明進一步的方案：上述紅球菌dsh，按以下步驟制備：

1)采集藥廠污水處理廠的活性污泥作為微生物源；

2)以雙酚a為唯一碳源，將菌株dsh培養在雙酚a的濃度為5mg/l的無機鹽培養基中，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中培養72h。

3)從每個無機鹽培養基中取200μl菌液置入新鮮的無機鹽培養基中(其中該無機鹽培養基中bpa濃度為10mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中連續培養7d。然后，再從每個無機鹽培養基取200μl菌液置入新鮮的無機鹽培養基(其中該無機鹽培養基中bpa濃度為20mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中連續培養7d。

4)按上述步驟繼續將菌液接種到含有bpa濃度分別為40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l(重復三次)的新鮮無機鹽培養基中培養。

5)取1ml菌液用無菌水稀釋成梯度為10^-2～10^-8，將經過不同梯度稀釋的菌液涂布到lb瓊脂培養基上，經過反復劃線，最終得到純化的紅球菌dsh。

其中，所述無機鹽培養基的成分包括：na2hpo44.260g/l；kh2po42.650g/l；mgso4·7h2o0.200g/l；(nh4)2so41.500g/l；cacl20.020g/l；用0.1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl調ph為7.0；加入1ml的微量元素。

其中，微量元素的成分包括：nicl2·6h2o0.024g/l；cocl2·6h2o0.190g/l；h3bo30.006g/l；zncl20.070g/l；cucl2·2h2o0.002g/l；mnso4·h2o0.061g/l；na2moo4·2h2o0.024g/l。

lb瓊脂培養基的成分包括：胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；nacl10g/l；待lb瓊脂培養基完全溶解后，調ph為7.4。

本發明另一目的是提供所述紅球菌dsh在降解環境激素中的應用。

作為本發明進一步的方案：環境激素為雙酚a。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

本發明通過對生產雙酚a的藥廠的活性污泥進行富集馴化、純化分離以及復篩，得到紅球菌dsh。本發明篩選出的紅球菌對雙酚a具有很強的降解能力，將紅球菌dsh培養在以雙酚a為唯一碳源的培養基中連續培養7天，能將濃度為100mg/l的雙酚a快速降解，降解率在96％以上，該紅球菌dsh能穩定、高效的降解雙酚a，可將其應用于處理環境中雙酚a的生物降解與環境修復。

附圖說明

圖1是本發明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh在lb瓊脂培養基上形態圖。

圖2是本發明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh革蘭氏染色圖。

圖3是本發明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh在電子顯微鏡下的形態圖。

圖4是本發明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh的系統發育樹。

圖5是本發明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh對雙酚a的降解率和od值的結果圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明所提供的紅球菌dsh來源于藥廠的污水處理廠活性污泥中，經過富集馴化、純化分離及復篩所得。紅球菌dsh在lb瓊脂培養基上，菌落呈圓形，表面圓潤，邊緣完整，呈淺粉色，不透明，直徑約1.5～3.0mm(圖1)，革蘭氏染色呈陽性(圖2)，在掃描電鏡下觀察菌株的形態為：呈球形，無鞭毛(圖3)。吲哚、v-p、半乳糖陰性，能將明膠液化，能水解蔗糖、果糖、葡糖糖，鳥氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶呈陽性。將菌株的16srdna的基因序列輸入到ncbi在線blast比對程序與基因庫中的核酸數據進行同源性比對檢索。比對結果表明，紅球菌dsh的16srdna基因序列與紅球菌屬(rhodococcus)中的多株紅球菌和馬紅球菌的16srdna的基因序列有較高的同源性。選取紅球菌屬中的18株細菌的16srdna基因序列，并選取分支桿菌屬(mycobacterium)中的2株細菌16srdna基因序列做外群，使用mega軟件并根據neighbor-joining進行系統進化樹分析，構建的無根系統發育樹(圖4)，結合紅球菌dsh的形態特征和生理生化指標，初步鑒定dsh為紅球菌，命名為紅球菌(rhodococcussp.)dsh。該紅球菌dsh于2016年4月25日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.12392。

具體操作過程如下所述。

實施例1紅球菌(rhodococcussp.)dsh菌株的獲取與保藏

采集藥廠和污水處理廠的泥樣、水樣作為微生物源，冷藏運回實驗室。并對樣品進行唯一碳源培養。取15mg雙酚a溶于30ml甲醇中，制成濃度為500mg/l的雙酚a母液。取1ml雙酚a母液加入到盛有100ml無機鹽培養基的三角瓶中，使無機鹽培養基中雙酚a的終濃度為5mg/l。無機鹽培養基組成(g/l)：na2hpo44.260；kh2po42.650；mgso4·7h2o0.200；(nh4)2so41.500；cacl20.020。用0.1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl調ph為7.0，加入1ml的微量元素。微量元素組成(g/l)：nicl2·6h2o0.024；cocl2·6h200.190；h3bo30.006；zncl20.070；cucl2·2h2o0.002；mnso4·h2o0.061；na2moo4·2h2o0.024。將三角瓶放入恒溫水浴鍋中，60℃水浴30min，使甲醇完全揮發。將三角瓶瓶口用紗布、牛皮紙密封后放入高壓滅菌鍋中，溫度121℃，高壓滅菌20min。將泥樣按體積比10％加入到盛有已滅菌的培養基的三角瓶中(培養基體積為90ml)；將水樣按體積比10％加入到另一盛有已滅菌的培養基的三角瓶中(培養基體積為90ml)。在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中培養72h，每個培養基取200μl菌液加入新鮮培養基(雙酚a濃度為10mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中連續培養7d。然后，從每個培養基取200μl菌液加入新鮮培養基(雙酚a濃度為20mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中連續培養7d。按此法將菌液接種到含有雙酚a濃度分別為40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l(重復三次)的新鮮無機鹽液體培養基中培養。將經過不同梯度稀釋的菌液涂布到lb瓊脂培養基上，每個梯度做3個平行組。將lb瓊脂培養基放入恒溫培養箱，30℃，培養3d，觀察菌落長勢。挑取顏色、形態等不同的菌落在lb瓊脂培養基上進行多次劃線，直至分離出單個菌落。菌株dsh的平板劃線圖如圖1所示。菌株dsh經過擴大培養后，一部分于-80℃甘油混合液保藏，一部分于4℃試管斜面保存。本發明的紅球菌dsh已于2016年4月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，登記入冊編號為cgmccno.12392。

實施例2紅球菌(rhodococcussp.)dsh菌株的鑒定

用細菌的通用引物通過pcr擴增技術擴增dna。測序結果利用ncbi中的blast工具與genbank數據庫中的16srdna基因序列進行同源性比對檢索。比對結果表明，紅球菌dsh的16srdna基因序列與紅球菌屬(rhodococcus)中的多株紅球菌和馬紅球菌的16srdna的基因序列有較高的同源性。選取紅球菌屬中的18株細菌的16srdna基因序列，并選取分支桿菌屬(mycobacterium)中的2株細菌16srdna基因序列做外群，使用mega軟件并根據neighbor-joining進行系統進化樹分析，構建的無根系統發育樹，結合紅球菌dsh的形態特征和生理生化指標，初步鑒定菌株dsh為紅球菌，命名為紅球菌(rhodococcussp.)dsh。

實施例3紅球菌(rhodococcussp.)dsh對雙酚a的降解能力

將菌株接種到含有濃度為50mg/l雙酚a的無機鹽培養基中，培養24h。將菌液倒入滅菌的離心管中，4000rpm離心10min，棄上清液，加入ph為7的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，再4000rpm離心15min，倒去上清液。如此反復洗滌3次，用漩渦混合器將菌體打散，最后，用磷酸鹽緩沖溶液將菌液稀釋到od600值為1.0，制成菌懸液備用。從每株細菌的菌懸液中取出200μl的菌液接種到以雙酚a為唯一碳源，濃度為50mg/l的無機鹽培養基中，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養箱中連續培養7d，每天取一次樣。將培養基經過預處理后，用高效液相色譜儀(high-performanceliquidchromatography，hplc)檢測各株細菌對雙酚a的降解能力(圖5)。檢測器uv(dualλabsorbancedetector，water2487)，色譜柱為zorbaxeclipseplusc18柱(150×4.6mm，3.5mm)。流動相體積比為乙腈∶水＝1∶1，檢測器波長為275nm，流速為0.8ml/min，進樣量為10μl。并用酶標儀檢測細菌的生長狀況，細菌的生長狀況用od600表示。

對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。