本發明屬于土壤生物修復
技術領域：
，特別涉及一種修復石油污染土壤的復合菌群、菌劑及培養、固定化方法和應用。
背景技術：
：石油及其加工品使用量逐年升高，導致了原油開采量增加，在此過程中原油泄露事故頻繁發生，造成的污染已經引起了廣泛關注。全球每年約開采40億t石油，其中7％左右最終進入環境，僅我國每年就有近60萬t。這些石油烴類污染物經過各種途徑最終進入土壤，我國目前石油污染的土地面積已達5×106ha。石油烴類污染物進入土壤，改變了土壤養分組成，影響了土壤微生物群落結構，導致作物減產，還可以與土壤顆粒粘連，堵塞孔隙，影響土壤通透性，阻礙作物根系的呼吸作用，引起根系腐爛，造成作物死亡。其中以石油芳香烴毒害最為嚴重，芳香烴類化合物具有苯環共軛結構，在環境中很難被降解，可以通過食物鏈在生物體內富集，產生遺傳毒性，而且絕大多數芳香烴及其衍生物具有致畸、致癌、致突變的作用。更嚴重的問題是這些石油污染物不僅僅污染土壤環境。由于土壤系統的開放性，石油污染物可以通過蒸發作用進入大氣環境，通過徑流和滲透等途徑進入水環境，再從大氣、土壤和水環境轉移到植物、動物和人體，對人類健康造成持久性危害。石油污染土壤修復的方法主要有化學、物理和生物修復三種。傳統的物理化學修復成本高，處理不當會引起二次污染，或者僅僅使污染物從一個環境體系轉移到另一個體系。生物修復技術成本低、效果好、無二次污染，被認為是最有前景的修復手段，其中，微生物修復技術以其種類多、繁殖快、比表面積大、易變異等優點，應用最為廣泛。目前，利用微生物修復石油烴類污染土壤的研究已有一些報道，汪杰等從山東、新疆和陜西油田分離獲得3株以柴油為唯一碳源的石油烴降解菌，其降解效果10天內可達60％以上(高效石油降解菌的篩選鑒定及修復能力研究，環境科學學報，2010)。李寶明等從石油污染土壤中富集分離獲得236株石油降解菌株，選擇其中4株構建了石油降解菌群，該菌群能有效降解石油中飽和烴和芳香烴烴類化合物，在石油濃度為0.5％的無機鹽培養液中，5天內對石油的降解率可達55.5％(石油降解菌的篩選、鑒定及菌群構建，中國土壤與肥料，2007)。相關專利文獻如下：公開號cn101724582a(中國，鞏宗強等，公開日2010-06-09)的一種修復pahs污染土壤的固定化菌劑及其制備方法；公開號cn101724566a(中國，臺培東等，公開日2010-06-09)的一種多環芳烴污染土壤修復菌劑的制備和使用方法；公開號cn102021132a(中國，楊玉楠等，公開日2011-04-20)的一種石油污染土壤生物修復菌劑的篩選及修復方法；公開號cn102250798a(中國，郭萍等，公開日2011-11-23)的一種假單胞菌屬和微生物菌劑及它們的應用；公開號cn102250797a(中國，郭萍等，公開日2011-11-23)的一種友好戈登氏菌和微生物菌劑及它們的應用；公開號cn102250796a(中國，郭萍等，公開日2011-11-23)的一種赤紅球菌和微生物菌劑及它們的應用；公開號cn102533709a(中國，高大文等，公開日2012-07-04)的原油污染土壤復合微生物修復菌劑及其使用方法；公開號cn103333823a(中國，王競等，公開日2013-10-02)的一種修復多鹵代烴污染土壤菌劑的制備方法及其應用；公開號cn104745511a(中國，宋佳宇等，公開日2015-07-01)的用于修復重油污染海岸線的復合菌劑及其制備方法與應用。在石油烴類污染土壤的微生物修復過程中，大多數具有石油降解能力的微生物只能代謝一種或幾種石油烴，而且石油烴類污染物的生物降解是分多步進行的，因此石油的降解需要多種微生物及其代謝產物協同完成。但是上述文獻中用于石油烴類污染土壤修復的微生物都是單菌株或幾個菌株通過簡單隨機組合的菌群，其協同作用的機理尚不明確。傳統的微生物篩選標準只注重菌株對石油烴類污染物的降解性能，忽略了其在修復體系中的生態效應，導致了篩選得到的微生物菌株雖然能很好的降解污染物，但在污染環境中定值較差，且對土著微生物的競爭作用以及環境因素敏感，造成其重新投入污染環境后難以生存和發揮修復作用。另一方面，石油通常以非水相液體污染土壤，使土壤顆粒表面有較強的疏水性，既減少了污染物與微生物的作用面，又不利于土壤中水溶性營養物質的運移和供給，影響了石油烴降解菌的生長代謝，制約著微生物修復技術的發展。因此篩選對石油烴類污染土壤具有高效、協同降解能力的微生物菌群，以及對該菌群進行固定化培養和應用仍然十分必要。技術實現要素：為了克服上述現有技術微生物在實際應用中定值差、效率低、與土著微生物競爭能力弱等缺點，本發明的目的在于提供一種修復石油污染土壤的復合菌群、菌劑及培養、固定化方法和應用，高效協同實現土壤修復。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種修復石油污染土壤的復合菌群，主要由假單胞菌屬(pseudomonassp.)和產堿菌屬(alcaligenaceaesp.)組成所述假單胞菌屬相對豐度為94.14％，產堿菌屬相對豐度為3.86％，其余物種包括無色桿菌屬、桿菌屬和短芽孢桿菌屬，總相對豐度為2.00％。所述修復石油污染土壤的復合菌群的培養方法：采用繼代連續培養法，以石油為唯一碳源，從石油污染土壤堆腐化修復體系中篩選分離獲得。基于所述修復石油污染土壤的復合菌群的復合菌劑：由無菌麩皮與上述復合菌群的發酵液(即培養液)混勻，經吸附培養后制備獲得。所述無菌麩皮與復合菌群的發酵液的質量體積比為1:1，30℃吸附培養24h。所述復合菌劑的固定化方法：將冷凍保存的所述復合菌群接種于50ml牛肉膏蛋白胨培養基中，30℃180r/min過夜培養獲得一級種子液，以5％的接種量將一級種子液接種于新鮮的牛肉膏蛋白胨培養基中，30℃180r/min過夜培養獲得二級種子液，以麩皮干重計，按體積質量比1:1的比例將二級種子液與滅菌麩皮混合均勻，30℃吸附培養24h，獲得石油污染土壤修復的固定化復合菌劑。所述牛肉膏蛋白胨培養基的成分為：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，其ph值在7.2～7.4之間。本發明復合菌群可用于修復石油污染土壤，基于堆腐化修復技術，石油濃度10g/l，30℃180r/min培養15d，復合菌群對石油烴類污染物的降解率達到18％～20％。堆腐化修復技術是利用自然界廣泛分布的微生物或接種外源高效降解菌，通過添加調理劑，有控制地促進有機物快速分解的固相反應過程，它結合傳統堆肥和生物修復的優點，可以有效克服污染物生物降解率低等缺陷。在石油污染土壤的堆腐化修復過程中可以通過微生物強化(microbialaugmentation)技術提高微生物代謝活動以達到高效降解污染物目的，常用的強化技術包括添加高效降解菌株、營養物質、電子受體、(生物)表面活性劑和共代謝底物。與現有技術相比，本發明的有益效果是：經過實驗證實，本發明石油污染土壤修復的固定化復合菌劑修復初始濃度為5000、10000和50000mg/kg的石油污染土壤，污染物降解率可達91.45％、91.83％和73.97％，半衰期分別為6.79、7.37和13.86d，土壤浸提液種子發芽指數分別提高18.26％、20.42％和36.41％。上述結果提示該復合菌劑是一種高效環保的土壤修復菌劑，具有廣闊的應用前景。附圖說明圖1是本發明復合菌群在屬水平上的物種相對豐度示意圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例詳細說明本發明的實施方式。土壤環境中的微生物極其豐富，受到石油污染后，微生物群落結構發生相應的變化，能適應污染環境的種群在石油的誘導下產生特異的酶系統，以石油烴為底物繁衍生存下來，形成具有協同作用的優勢同生菌群；不能適應污染環境的種群則受到抑制，甚至被完全淘汰。本發明利用這一自然馴化過程，采用繼代連續培養法，以石油為唯一碳源，從石油污染土壤堆腐化修復體系中分離獲得具有良好協同作用的石油污染土壤修復的復合菌群。本發明的具體過程如下：1、石油污染土壤修復復合菌群的篩選5g石油污染土壤樣品加入到50ml石油濃度為20g/l的無菌lb培養基中，30℃180r/min恒溫震蕩，富集培養7d。取富集培養液1ml接種于50ml相同石油-無機鹽培養基中，30℃180r/min恒溫震蕩，進行馴化培養，5-7天為一個周期，連續培養10代，獲得群落結構和降解功能穩定的復合菌群。2、石油降解復合菌群的組成分析2.1、石油降解菌群dna提取馴化培養后的混合培養液8000r離心5min，棄去上清液，收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌兩次，用fastdnaspinkitforsoil試劑盒(mpbiomedicals)提取菌群基因組總dna，詳細操作步驟參考試劑盒說明書。將提取得到的石油降解菌群總dna溶解于30μl無菌te緩沖液(10mmol/ltris-hcl，1mmol/ledta，ph8.0)。通過酶標儀(biotekelx808)測定菌群總dna的濃度和純度(od260/od280和od260/od230)。2.2、16srdna片段擴增擴增引物分別為27f和1492r27f：(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)1492r：(5′-ggttaccttgttacgactt-3′)pcr反應在thermocycler(biometra，tprofessional)中進行，反應程序如下：pcr反應體系為50μl，體系組成如下：其中dna模板的稀釋度根據其濃度計算。2.3、pcr擴增產物檢測pcr擴增產物在1％瓊脂糖(0.005％goldview染色劑)凝膠電泳上進行檢測，90v電泳20min后置于凝膠成像系統(bio-rad，geldoctmxr)上檢測是否有非特異性擴增條帶。pcr擴增產物保存于-20℃。2.4、高通量測序(illuminamiseq)數據分析菌群基因組高通量測序(16srdna)委托北京百邁客生物科技有限公司利用illuminamiseq平臺完成。高通量測序得到的圖像數據經堿基(bases)識別分析轉化得到原始序列(sequencedreads)，除去含接頭和低質量的序列得到高質量的reads。利用mothur(version1.34.4)軟件，將reads拼接成一條序列(rawtags)，通過去除模糊堿基(anbiguous)數大于0，單堿基高重復區(homologous)大于8、overlap區錯配(mismatch)數大于0以及長度大于97.5％的低質量tags等步驟，優化得到高質量的cleantags。根據平均鄰近聚類法(averageneighborclusteringalgorithm)在0.03(97％相似度)水平下對cleantags進行聚類分析，獲得菌群out個數。基于分類學數據庫對out進行物種注釋，若一個out中包含的51％以上的cleantags都注釋為同一物種，則out即為該物種，否則在上一個物種分類等級再進行out分析。統計每個out內所含的cleantags數，結合物種組成信息獲得在各分類學水平上每個物種的相對豐度。實驗結果如表1所示，本發明復合菌群在界、門、綱、目、科和屬分類水平上共產生的物種數目分別為1、2、3、4、5和6。結合物種注釋信息，獲得本發明復合菌群在屬水平上各物種的相對豐度(圖1)，假單胞菌屬(pseudomonas)占明顯優勢，相對豐度達94.14％；其次是產堿菌科無法鑒定的屬類別(alcaligenaceae.unclassified)，相對豐度達3.86％；其他屬類別還包括假單胞菌科無法鑒定的屬類別(pseudomonadaceae.unclassified)、無色桿菌屬(achromobacter)、桿菌屬(geobacillus)和短芽孢桿菌屬(brevibacillus)，這些物種的總相對豐度為2.00％。表1復合菌群在不同水平上的物種組成界門綱目科屬1234593、固定化復合菌群的降解能力分析3.1、固定化復合菌群修復石油污染土壤能力分析稱取相當于5.0g風干質量的新鮮土壤，加入10ml石油醚，25℃300w超聲10min，渦旋振蕩5min，6000r/min離心5min，反復提取5次，合并上清液，無水硫酸鈉除水，用石油醚定容后在225nm處讀數，3次重復，獲得固定化復合菌群修復后土壤中石油烴的含量，計算石油烴類污染物的降解率，結果如表2所示。表2固定化復合菌群修復過程石油烴類污染物的降解率結果表明，利用本發明固定化復合菌群修復初始濃度為5000、10000和50000mg/kg的石油污染土壤，污染物降解率可達91.45％、91.83％和73.97％，半衰期分別為6.79、7.37和13.86d。3.2、固定化復合菌群修復后土壤的種子發芽指數分析按質量體積比1:10的比例將固定化復合菌群修復后的土壤(濕質量)與蒸餾水混合均勻，濾液3000r/min離心10min，取5ml上清液于鋪有濾紙的9cm培養皿中，放置30粒上海青種子，以蒸餾水為對照，3次重復，30℃培養48h后測量根長，計算sgi(表3)。sgi(％)＝[(堆肥浸提液種子發芽率×種子根長)/(蒸餾水種子發芽率×種子根長)]。表3固定化復合菌群修復后土壤的種子發芽指數注：平均值±標準差(n＝3)，同列數據不同字母表示差異顯著(p<0.05)結果表明，利用本發明固定化修復菌群修復石油污染土壤后的種子發芽指數分別比修復初期提高了18.26％、20.42％和36.41％。綜上所述，本發明復合菌群及其固定化可用于石油污染土壤的修復，有效改善土壤生態環境，且具有快速、高效、環境友好等優點。當前第1頁12