本發明屬于生物制劑領域，涉及一種促生長、增強免疫作用的促生長復合多肽及其應用。
背景技術：
：生長激素（growthhormone，gh）是動物自身垂體合成分泌的具有種屬特異性的單鏈多肽類激素，廣泛存在于脊椎動物中，通過促進蛋白質合成，加速脂肪代謝，間接刺激骨的生長等促進機體生長發育。gh的分泌受其他生長因子以自分泌或旁分泌方式相互作用，共同調節。在這些生長因子中gh釋放激素（ghrh）、gh釋放抑制激素（ghrih）和生長激素釋放肽（ghrelin）起主要調節作用，其中ghrelin和ghrh對促進下丘腦相關區域活動有協同作用，都能夠刺激機體釋放生長激素。ghrelin的發現是一個逆向的過程。首先報道的化學合成，是1982年由bowers等合成的生長激素釋放肽-6（ghrps-6）。1993年smith等在ghrps-6的基礎上合成出生長激素促分泌激素（ghss）。隨著生物技術的發展，1996年howard等克隆生長激素促分泌激素相應受體（growthhormonesecretagogues，ghs-r）cdna，證明ghs-r在人、豬、牛、大鼠中高度保守。1999年kojima等通過對大鼠不同內臟器官提取物檢測，從胃組織中得到最高活性的促生長激素分泌激素并純化出由28個氨基酸殘基組成具有相同活性的多肽，命名為ghrelin（ghre為原歐語，是生長的意思）。研究發現人和大鼠的ghrelin前體蛋白共117個氨基酸殘基，n端的前23肽為分泌信號肽；ghrelin最小活性中心由n端前4個氨基酸片段組成，c末端的p-r（脯氨酸-精氨酸）結構為其識別部位。ghrelin具有內源性活性位點的是第三個氨基酸殘基，因該氨基酸羧基被辛酰酯化，最初的研究表明辛酰酯化是ghrelin相關活性必需結構，但并非是唯一的，其他類型的酰酯化也有相應的功能。人和大鼠ghrelin第11和第12位氨基酸不同，具有89%的同源性。隨著研究深入，有報道表明人類血液中非辛酰酯化的ghrelin量遠大于辛酰酯化的ghrelin量，非辛酰酯化的ghrelin同樣具有內分泌功能，可以促進細胞增殖。在ghrps-6氨基酸序列中第二個氨基酸trp和第五個氨基酸phe均為d型氨基酸，即d-trp和d-phe，具有生物活性。現在應用的類似ghrps-6合成肽還有六肽生長激素釋放肽-2（ghrps-2），七肽生長激素釋放肽-1（ghrps-1）和d-2-methyltrp取代了d-trp的衍生物hexa。已知四種ghrps氨基酸序列如下：ghrps-1:ala-his-d-betanal-ala-trp-d-phe-lys-nh2ghrps-2:d-ala-d-betanal-ala-trp-d-phe-lys-nh2ghrps-6:his-d-trp-ala-trp-d-phe-lys-nh2hexa:his-d-2-methyltrp-ala-trp-d-phe-lys-nh2smith等認為這類肽中芳香族氨基酸如trp，d-phe和末端ala，his是肽活性重要組成部分。walker等通過ghrps-6po非腸道給藥和十二指腸內給藥方式，通過比較對猴子、狗和大鼠體內生長激素（gh）釋放活性的影響，表明ghrps-6進入腸道可促進gh釋放，即ghrps-6有望作為一種代替非腸道給藥的藥物使用。比較這四種肽，發現都有ala-trp-d-phe-lys-nh2結構。將合成肽共有部分（awfk）整合到ghrelin序列中，取代ghrelin序列第10位到第13位的氨基酸，得到一種新的具有促生長作用的多肽。釀酒酵母（saccharomycesserevisiae），是一種單細胞真核生物，長期應用在食品工業，最早的應用可追溯到幾千年前的釀酒業和面包業中，含有豐富的蛋白質、脂肪、糖類、維生素和其他代謝產物的生理性物質，是認定的gras生物（generallyrecognizedassafe）。因其在發酵過程中不產生毒素，安全可靠，成為最先使用的酵母表達系統。釀酒酵母表達外源蛋白優點在于：（1）菌體繁殖快，生長周期短，工藝簡單，培養條件普通，生產成本低。（2）遺傳背景清晰，基因組全序列測序早在1996年完成。（3）對表達的蛋白進行修飾，使重組蛋白結構接近天然構象，使之保持相應功能。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術中的不足而發明的一種促生長復合多肽及其應用。本發明是這樣實現的：一種促生長復合多肽，其特征在于：包含ghrelin和ghrps多肽序列。所述的促生長復合多肽的氨基酸序列如sqeidno.1所示。一種促生長復合多肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：步驟1）、促生長復合多肽的設計ghrelin一級結構為：gssflspehqrvqqrkeskkppaklqpr，ghrps的共有部分一級結構為：awfk；將ghrps共有氨基酸序列置換出ghrelin序列中第10個至第13個氨基酸序列；步驟2）、重組表達載體的構建1)引物設計根據多肽序列，參照釀酒酵母偏愛密碼子得到核苷酸序列，利用ncbiprimer-blast設計引物，得到引物序列如下：f:cgcgcatccggttcttctttcttgcatcc標記為酶切位點bamhir:tgcagatcatcttggttgcaactagatca標記為酶切位點xbaim1-f:cttctttcttgtctccagaacacgcttggttm1-r:ttagattcctttctttgcttgaaccaagcgtm2-f:gaaaggaatctaagaagccaccagctaagtm2-r:ttgcaacttagctggtggcttcttagattc2）pcr反應根據設計的引物，試驗中分4次pcr擴增得到目的基因；具體反應條件如下：m1基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m1-f1μl，m1-r1μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，35個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m1；m2基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m2-f1μl，m2-r1μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，66℃30s，72℃45s，35個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m2；g基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m11μl，m21μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，10個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為g；gm基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，f1μl，r1μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，30個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為gm；將pcr擴增得到的gm基因連接pmd19-t載體，轉入dh5α感受態細胞中進行藍白斑篩選和單克隆擴增；同時將pyes2載體質粒轉入dh5α感受態細胞中在氨芐青霉素培養基上進行單克隆擴增；3）表達載體的構建提取pmd19-t質粒和pyes2載體質粒；同時分別用bamhi和xbai雙酶切37℃條件下作用5h；瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因gm＇和pyes2＇載體；兩種酶切后的dna片段gm＇和pyes2＇，在t4連接酶作用下37℃條件下12h；將連接產物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為5.9kb的條帶，記為pyes2/gm＇；將pyes2/gm＇轉入dh5α中，在氨芐青霉素培養基上篩選表達載體成功轉入的菌體，并進行單克隆擴增；提取質粒，測序，測序結果和正確的堿基序列比對，序列一致的質粒標為pyes2/gm；步驟3）、工程菌的表達構建質粒提取試劑盒中提pyes2/gm質粒，電轉法轉化到感受態釀酒酵母中，涂布sd固體培養基培養72h后，挑取一個單克隆菌落，用yepd液體培養基培養72h后，按照1%的比例接種到yepd新鮮的液體培養基進行擴大培養；步驟4）、表達產物的鑒定工程菌發酵結束后，離心分離菌體和上清液；將誘導表達促生長復合多肽的菌體和同條件下誘導的原始菌體稀釋到同樣體積下同等菌體數，同條件破碎，離心后經hplc檢測，確定復合蛋白的表達況；步驟5）、發酵產物粗制備發酵結束后，將培養基靜置，使培養物靜置沉淀，過濾后得到含有復合蛋白的菌體；干燥，得到促生長復合多肽和酵母活菌混合的多肽菌粉。作為飼料添加劑添加在飼料或飲水中。本發明具有以下優點：1、本發明在酵母細胞內重組促生長肽的融合基因并表達出具有活性的促生長復合多肽，這種促生長復合多肽可以增加畜禽的抵抗力，加快畜禽生長，提高飼料利用率；2、促生長復合多肽表達菌株釀酒酵母可以直接作為飼料添加劑，可以調節胃腸菌群平衡，補充菌體蛋白，提高畜禽免疫力等作用；3、可將純化或未純化的促生長復合多肽直接制備成飼料添加劑，簡化生產過程，縮短生產周期，降低生產成本。附圖說明圖1為重組促生長復合多肽載體連接過程示意圖。具體實施方式實施例1：一種促生長復合多肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：步驟1）、促生長復合多肽的設計ghrelin一級結構為：gssflspehqrvqqrkeskkppaklqpr，ghrps的共有部分一級結構為：awfk；將ghrps共有氨基酸序列置換出ghrelin序列中第10個至第13個氨基酸序列；形成一種具有ghrelin和ghrps活性位點復合氨基酸多肽鏈。其一級結構為：gssflspehawfkqrkeskkppaklqpr，等電點為5.46，分子的量為6815da；步驟2）、重組表達載體的構建1)引物設計根據多肽序列，參照釀酒酵母偏愛密碼子得到核苷酸序列，利用ncbiprimer-blast設計引物，得到引物序列如下：f:cgcgcatccggttcttctttcttgcatcc標記為酶切位點bamhir:tgcagatcatcttggttgcaactagatca標記為酶切位點xbaim1-f:cttctttcttgtctccagaacacgcttggttm1-r:ttagattcctttctttgcttgaaccaagcgtm2-f:gaaaggaatctaagaagccaccagctaagtm2-r:ttgcaacttagctggtggcttcttagattc2）pcr反應根據設計的引物，試驗中分4次pcr擴增得到目的基因；具體反應條件如下：m1基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m1-f1μl，m1-r1μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，35個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m1；m2基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m2-f1μl，m2-r1μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，66℃30s，72℃45s，35個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為m2；g基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，m11μl，m21μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，10個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為g；gm基因片段擴增冰上操作混勻pcr反應體系：10×pcrbuffer5μl，dntp4μl，pfu酶0.25μl，f1μl，r1μl，補加滅菌水達到反應體積為50μl；放入預熱好的pcr擴增儀，按照以下程序進行擴增：94℃5min，94℃45s，65℃30s，72℃45s，30個循環，最后72℃10min，4℃保存；pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，反應產物瓊脂糖凝膠回收，目的基因記為gm；將pcr擴增得到的gm基因連接pmd19-t載體，轉入dh5α感受態細胞中進行藍白斑篩選和單克隆擴增；同時將pyes2載體質粒轉入dh5α感受態細胞中在氨芐青霉素培養基上進行單克隆擴增；3）表達載體的構建提取pmd19-t質粒和pyes2載體質粒；同時分別用bamhi和xbai雙酶切37℃條件下作用5h；瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因gm＇和pyes2＇載體；兩種酶切后的dna片段gm＇和pyes2＇，在t4連接酶作用下37℃條件下12h；將連接產物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為5.9kb的條帶，記為pyes2/gm＇；將pyes2/gm＇轉入dh5α中，在氨芐青霉素培養基上篩選表達載體成功轉入的菌體，并進行單克隆擴增；提取質粒，測序，測序結果和正確的堿基序列比對，序列一致的質粒標為pyes2/gm；步驟3）、工程菌的表達構建質粒提取試劑盒中提pyes2/gm質粒，電轉法轉化到感受態釀酒酵母中，涂布sd固體培養基培養72h后，挑取一個單克隆菌落，用yepd液體培養基培養72h后，按照1%的比例接種到yepd新鮮的液體培養基進行擴大培養；步驟4）、表達產物的鑒定工程菌發酵結束后，離心分離菌體和上清液；將誘導表達促生長復合多肽的菌體和同條件下誘導的原始菌體稀釋到同樣體積下同等菌體數，同條件破碎，離心后經hplc檢測，確定復合蛋白的表達況；檢測得出發酵罐發酵培養的最大表達量達到1.3g/l；步驟5）、發酵產物粗制備發酵結束后，將培養基靜置，使培養物靜置沉淀，過濾后得到含有復合蛋白的菌體；干燥，得到促生長復合多肽和酵母活菌混合的多肽菌粉。實施例2：促生長復合多肽效果實驗1）對保育豬促生長效果的試驗選用40頭體重約為30kg的健康三元雜交豬，按照公母各半的原則隨機分成實驗組和對照組。對照組飼喂基礎日糧，不添加任何添加劑；試驗組在飼喂基礎日糧同時，加入促生長復合多肽菌粉日糧，添加量為基礎日糧總量的0.5‰。對比飼養試驗期間保證實驗豬自由采食和自由飲水，并按照豬場常規方法進行飼養管理。試驗先進行7d預試期，觀察試驗豬對實驗條件的適應情況，確定適應后進行42d正式試驗期。試驗開始前和結束后分別停止喂料12h，對試驗豬進行空腹稱重。表1基礎日糧配方成分含量（質量分數）玉米60%豆餅25%魚粉1%麩皮12.5%貝殼粉0.5%骨粉0.7%食鹽0.3%表2促生長復合多肽對保育豬生長性能的影響組別日增重（g/頭）日均耗料（g/頭）料肉比對照組424.80±21.01250±1202.95±0.13實驗組453.28±29.61230±1102.72±0.14結果表明：促生長復合多肽可以有效的改善保育豬生長性能。在試驗期，添加促生長復合多肽的試驗組平均日增重顯著高于對照組平均日增重，兩組差異顯著（p<0.05）。實驗組和對照組平均日耗料量較接近，差異不顯著（p>0.05）；料肉比實驗組比對照組降低了7.8%，兩者差異顯著（p<0.05）。試驗結果表明，添加促生長復合多肽飼料可在不改變豬采食量情況下，提高飼料轉化率，提高日增重，顯著促進保育豬生長。序列表<110>河南金大眾生物工程有限公司<120>促生長復合多肽及其應用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>28<212>prt<213>人工序列<400>1glyserserpheleuserprogluhisalatrpphelysglnarglys151015gluserlyslysproproalalysleuglnproarg2025當前第1頁12