一種利用ISSR反應體系分析草果遺傳多樣性的方法與流程

本發明屬于分子生物學dna標記技術與應用領域，具體地說，涉及一種利用issr反應體系分析草果遺傳多樣性的方法。

背景技術：

草果(amomumtsaokocrevostetlemaire)是姜科豆蔻屬植物中一種多年生草本植物，不僅是我國食品加工業和輕工業的重要原料，而且是一種傳統的中藥材，有燥濕、健胃、祛痰、溫中、順氣、抗瘧等功能，還是大眾的調料食品，國際、國內市場需求量大。草果對生長環境條件要求較高，一般生長在海拔800～1500m的北熱帶和中、南亞熱帶中低山區，年降雨量在1200～1600mm，年平均氣溫在16～22℃，冬季多霧、濕度大、透光度在40％～50％的陰濕山坡溝谷森林環境下，主要分布在我國云南、廣西和貴州三省局部地區，其中云南是草果主產區，產量約占全國的95％，主要分布在紅河、文山、西雙版納、德宏、保山、思茅、臨滄7個地(州)的31個縣(市)。

分子標記是一種以dna序列差異性為標記的檢測遺傳多樣性的方法，具有不受外界環境及基因表達與否的影響，不影響實驗材料的性狀、可標記數量大及分辨率高等特點，目前被廣泛應用于生物遺傳研究。issr(簡單序列重復區間擴增多態性，intersimplesequencerepeat)分子標記技術是zietkeiwitcz等(zietkiewicze,rafalskia,labudad(1994)genomefingerprintingbysimplesequencerepeat(issr)-anchoredpolymerasechainreactionamplification.genomics20:176–183)于1994年發展起來的一種基于微衛星序列的分子標記。以其簡便迅速、多態性高、重復性好等優點被廣泛應用于動植物的品種鑒定、dna指紋圖譜構建和種質資源多樣性研究等領域，同時在中草藥種內和種間鑒定等方面得到廣泛運用。目前在姜科植物砂仁中有過利用issr標記分析不同產地砂仁遺傳多樣性的報道，但在草果中，應用issr分子標記技術進行種質資源鑒定、遺傳多樣性分析的方法尚未見報道。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明針對上述的問題，提供了一種利用issr反應體系分析草果遺傳多樣性的方法，該方法是一種簡單、易于操作的分子標記技術，可為草果資源鑒定、遺傳多樣性分析等科學研究提供很好的技術指導和理論支持。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種用于草果遺傳多樣性分析的issr分子標記引物體系，所述引物序列包括：

ubc807：其核苷酸序列如seqidno.1所示；

ubc809：其核苷酸序列如seqidno.2所示；

ubc835：其核苷酸序列如seqidno.3所示；

ubc836：其核苷酸序列如seqidno.4所示；

ubc841：其核苷酸序列如seqidno.5所示；

ubc842：其核苷酸序列如seqidno.6所示；

ubc847：其核苷酸序列如seqidno.7所示；

ubc862：其核苷酸序列如seqidno.8所示；

ubc873：其核苷酸序列如seqidno.9所示；

ubc885：其核苷酸序列如seqidno.10所示；

ubc888：其核苷酸序列如seqidno.11所示。

本發明還公開了一種用于草果遺傳多樣性分析的issr-pcr反應體系，每25μl的反應體系中含有不含mg²⁺的10×pcrbuffer3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l和模板dna50ng；將上述反應混合液按如下程序進行擴增：95℃預變性5min，95℃變性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。

進一步地，所述引物選自上述seqidno.1～11中的任一條。

進一步地，所述退火溫度根據所選擇的引物來確定，具體如下：

seqidno.150℃

seqidno.252℃

seqidno.353℃

seqidno.453℃

seqidno.554℃

seqidno.654℃

seqidno.753℃

seqidno.858℃

seqidno.954℃

seqidno.1053℃

seqidno.1152℃。

本發明還公開了一種利用issr反應體系分析草果遺傳多樣性的方法，其步驟包括：

(1)dna的提取：采集嫩葉用于全基因組dna提取；

(2)采用issr-pcr反應體系對步驟(1)中提取的dna樣品進行擴增；

(3)將pcr擴增產物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，電泳結束后銀染檢測條帶；

(4)利用issr分子標記引物體系將不同來源的草果進行聚類及主坐標分析；

(5)遺傳多樣性分析：計算草果實驗材料遺傳多樣性參數。

進一步地，步驟(1)中的dna的提取具體為：采用2*ctab法提取dna，并將提取的dna樣品溶于te緩沖液后存儲于-20℃備用，擴增前用雙蒸水將dna樣品稀釋成20ng/μl的工作液，作為pcr擴增反應的模板。

進一步地，步驟(2)中issr-pcr反應體系具體為：每25μl的反應體系中含有不含mg²⁺的10×pcrbuffer3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l和模板dna50ng；將上述反應混合液按如下程序進行擴增：95℃預變性5min，95℃變性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。

進一步地，步驟(3)中將pcr擴增產物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳進行分離，電泳結束后銀染檢測條帶。具體為：電泳結束后，將膠體從玻璃板上取下，蒸餾水漂洗，轉入含有0.2％硝酸銀的染色液中，振蕩10min，蒸餾水漂洗1次約1min，轉入含2％氫氧化鈉和0.4％甲醛的顯色液中，輕輕振蕩待條帶顯色完全，將膠體轉入蒸餾水中；在凝膠成像系統下對膠體進行拍照保存。

進一步地，步驟(4)中聚類分析和主坐標分析具體為：讀取步驟(3)獲得的譜帶信息，將電泳圖譜上100～2000bp范圍內清晰且重復出現的條帶記為1，同一位置沒有條帶記為0，由此生成0和1原始矩陣；統計每條引物擴增出的總條帶數和多態性條帶數；用ntsys-pc(2.10e)軟件中simqual程序計算相似系數矩陣，以clustering程序中shan進行upgma聚類；用treeplot模塊生成聚類圖，構建分子進化樹；根據計算的相似系數矩陣進行decenter數據轉換，進而進行主坐標分析。

進一步地，步驟(5)中遺傳多樣性分析具體為：根據01二元數據矩陣，統計issr擴增產物的條帶總數和多態性條帶數(npb)，計算多態性條帶所占的比率(ppb)和引物多態性信息含量(pic)，pici＝2fi(1－fi)，公式中pici表示第i個位點的多態性信息含量，fi表示有帶所占的頻率，(1－fi)表示無帶所占的頻率；對每條引物來說，pic＝∑pici/n，式中n表示每條引物的多態性條帶數；對每條引物而言，標記指數(mi)按下述公式計算：mi＝npb*pic；釆用popgene32軟件對所有試驗材料進行遺傳多樣性參數計算：等位基因數、有效等位基因數、shannon's信息指數、基因多樣性指數、多態位點比率。

與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：

1)本發明優化了草果基因組dna的issr反應條件；

2)采用5％的非變性聚丙烯酰胺凝膠對issr-pcr擴增產物進行分離，分辨率較瓊脂糖凝膠更高；

3)利用優化的pcr反應體系，篩選出的11條issr引物在草果中pcr擴增反應穩定，擴增片段清晰，多態性高；

4)本發明可加快草果資源的鑒定速度，縮短實驗時間，結果穩定可靠，彌補了傳統形態學鑒定方法的不足；

5)本發明成本低，在短時間內可完成大批試驗材料鑒定。

6)利用該技術能很好的揭示草果居群間的遺傳多樣性，分辨草果種質資源間的親緣關系，對草果資源的保護及利用具有重要意義。

當然，實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發明ubc835引物擴增效果圖，其中，m，2000bpmarker；1-25所對應原始編號及采樣點見表1；其中1-25分別代表采自金平的j8、j48、j55、j59、j64、j84、j91、j103、j108、j109、j118、j119、j128和采自元陽的y3、y5、y9、y14、y18、y22、y32、y36、y44、y45、y47、y48；

圖2是本發明基于issr標記的91份草果樣品聚類圖。

圖3是本發明基于issr標記的91份草果樣品主坐標分析。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。

實施例1dna的提取

(1)實驗材料

本試驗所用的91份草果采自云南省8個草果居群，其中金平縣13份、元陽縣12份、綠春縣11份、屏邊縣9份、瀾滄縣13份、保山市11份、梁河縣12份、云縣10份，具體見表1。

表1試驗材料編號及采樣點

(2)dna的提取

在種質資源調查同時采集嫩葉用于全基因組dna提取。采用2*ctab法提取dna，并將提取的dna樣品溶于te緩沖液后存儲于-20℃備用。擴增前用雙蒸水將dna樣品稀釋成20ng/μl的工作液，作為pcr擴增反應的模板。

實施例2本發明issr-pcr反應體系及引物的篩選

(1)采用正交設計方法，對mg²⁺、dntps和引物濃度、taqdna聚合酶及模板dna用量等5個因素進行篩選，得到適于草果的issr標記pcr反應體系。issr-pcr的正交設計如表2。所選issr-pcr引物為ubc888，試驗重復3次。經評分比較后，25μl反應體系中10×pcrbuffer(不含mg²⁺)3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l(每條)和模板dna50ng綜合擴增效果最好。

表2issr-pcr反應l16(4⁵)正交試驗設計表

(2)上述反應體系的pcr擴增反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。

在試驗確定最佳反應體系基礎上，在梯度pcr儀上進行引物篩選及最佳退火溫度確定，issr引物序列及最佳退火溫度信息見表3。利用上述反應體系和反應程序共篩選出11條帶型穩定、清晰且重復性好的多態性引物：ubc807、ubc809、ubc835、ubc836、ubc841、ubc842、ubc847、ubc862、ubc873、ubc885、ubc888。圖1為ubc835對1-25號樣品擴增效果圖，表明本發明所建立的草果issr-pcr反應體系擴增出的條帶更具有多態性高、特異性強、背景清楚及穩定性強的優點，適合草果遺傳多樣性分析。

表3篩選的issr引物序列

(3)電泳和銀染體系

pcr擴增產物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離。電泳結束后銀染檢測條帶，具體操作如下：電泳結束后，將膠體從玻璃板上取下，蒸餾水漂洗，轉入含有0.2％(質量百分濃度)硝酸銀的染色液中，振蕩10min，蒸餾水漂洗1次約1min，轉入含2％氫氧化鈉和0.4％甲醛(10gnaoh定容至500ml，使用前加入2ml甲醛)的顯色液中，輕輕振蕩待條帶顯色完全，將膠體轉入蒸餾水中。在凝膠成像系統下對膠體進行拍照保存。

實施例3issr-pcr反應體系在91份草果品種遺傳多樣性分析中的應用

(1)聚類分析和主坐標分析

將電泳圖譜上100～2000bp范圍內清晰且可重復出現的條帶記為1，同一位置沒有條帶記為0，由此生成0和1原始矩陣。統計每條引物擴增出的總條帶數和多態性條帶數。用ntsys-pc(2.10e)軟件中simqual程序計算相似系數矩陣，以clustering程序中shan進行upgma(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans)聚類；用treeplot模塊生成聚類圖，構建分子進化樹。根據計算的相似系數矩陣進行decenter數據轉換，進而進行主坐標分析。

基于issr標記，利用ntsyspc2.10e軟件對8個居群的91份草果進行聚類分析和主坐標分析。聚類分析中除j119和l49沒能被成功聚類外，其余樣本根據親緣關系遠近均被分到不同類群中，在閾值0.738處可將樣本分為7類，yx1、y14、l44、l34、b4各為1類，l12、l50、ye和yx4聚在一起，剩余的80份樣本聚在一起，d23和d25親緣關系最近(圖2)。

對91份草果樣本的issr標記的原始矩陣進行主坐標分析，issr標記提取的前2個主坐標所能解釋的遺傳變異分別為7.12％和3.98％，二維排序圖能夠直觀的表示91份樣本之間的親緣關系遠近，保山和德宏在親緣關系上最近，主坐標分析結果與聚類結果基本一致(圖3)。

(2)遺傳多樣性分析

根據01二元數據矩陣，統計issr擴增產物的條帶總數和多態性條帶數(npb)，計算多態性條帶所占的比率(ppb)和引物多態性信息含量(pic)，pici＝2fi(1－fi)，公式中pici表示第i個位點的多態性信息含量，fi表示有帶所占的頻率，(1－fi)表示無帶所占的頻率；對每條引物來說，pic＝∑pici/n，式中n表示每條引物的多態性條帶數；對每條引物而言，標記指數(mi)可以按下述公式計算：mi＝npb*pic。假定所研究的草果居群都處于hardy-weinberg平衡，釆用popgene32軟件對所有試驗材料進行遺傳多樣性參數計算：等位基因數、有效等位基因數、shannon's信息指數、基因多樣性指數、多態位點比率等。11條issr引物共擴增402個條帶，其中多態性條帶402條，占總條帶的100％，平均每條引物擴增36.545條帶；不同引物所揭示的pic(多態性信息含量)在0.232～0.301之間，平均為0.258；mi(標記指數)最高的是引物ubc842，為13.56，表明該引物在11條引物中的擴增效率最高；有效等位位點數ne、nei基因多樣度及shannon's信息指數i最高的引物為ubc842，分別為1.302、0.208和0.347，最低的為ubc841，分別為1.186、0.145和0.264(表4)。issr引物擴增多態性表明云南草果遺傳多樣性較低。居群間比較分析表明遺傳多樣性由高到低依次為金平居群、瀾滄居群、綠春居群、云縣居群、元陽居群、屏邊居群、德宏居群、保山居群。在物種水平上，多態性位點百分率p、觀測等位基因數na、有效等位位點數ne、nei基因多樣度h和shannon's信息指數i分別為100％、2.00、1.215、0.159、0.279(表5)。表明草果無論在居群水平還是物種水平遺傳多樣性都較低，亟需我們加大保護力度。

表411條issr引物擴增結果

注：tnp：擴增總條帶數；npb：多態性條帶數；ppb：多態性比率；na：觀測等位基因數；ne：有效等位基因數；h：nei基因多樣度；i：shannon's信息指數；pic：多態性信息含量；mi：標記指數。

表5草果居群issr遺傳多樣性分析

注：p：多態性位點百分率；na：觀測等位基因數。

上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權利要求的保護范圍內。

序列表

<110>紅河學院

<120>一種利用issr反應體系分析草果遺傳多樣性的方法

<130>2017

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagagagagagagagt17

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agagagagagagagagg17

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agagagagagagagagyc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agagagagagagagagya18

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gagagagagagagagayc18

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gagagagagagagagayg18

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cacacacacacacacarc18

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

agcagcagcagcagcagc18

<210>9

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gacagacagacagaca16

<210>10

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

bhbgagagagagagaga17

<210>11

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

bdbcacacacacacaca17