一種工程化心肌組織中心肌細胞去分化重塑的方法與流程

本發明涉及一種心肌細胞，特別涉及一種工程化心肌組織中心肌細胞去分化重塑的方法。

背景技術：

近年來心肌組織工程發展迅速，以生物支架材料和種子細胞為基礎構建的組織工程化心肌組織技術已越來越成熟。工程化心肌組織具有很大的潛在發展空間。新近研究表明，通過體外組織工程手段構建的心肌組織不僅可以實現心肌細胞的損傷修復，心臟組織的重構等，而且還被認為是體外探討心肌生理病理問題的良好模型體系。在過去幾年中，已有大量文獻報道利用生物材料結合種子細胞來模擬天然心肌組織的結構，成功構建出能夠節律性收縮的心臟組織，并實現了對心肌細胞功能的調控。然而，在心肌組織的構建中仍然存在許多挑戰，且越來越多的研究者認為利用發育生物學原理指導工程化心肌組織的構建對于改善構建的心肌組織質量具有重要意義。

對于組織工程化心肌組織構建的研究，以往研究者大部分把落腳點放在如何構建出與在體組織高度相關的心肌組織模型。近十幾年，心臟干細胞作為種子細胞的來源已經吸引了大量的心肌組織工程研究者的關注，且已被證實在修復受損心臟組織中具有很大潛能。而受限于心臟干細胞的數量，當心臟組織受損超過一定程度其修復效果受到限制。近幾年研究者將目光集中在是否可以實現工程化心肌組織中終末分化的心肌細胞恢復再生能力的研究上。他們發現使用終末分化心肌細胞可以在體外構建具有節律性收縮的心臟組織且已經成為一個值得關注的研究問題，然而在這個過程中心肌細胞經歷了怎樣的發育過程并實現了心肌組織的重塑呢，這個科學問題還需要進一步討論。

在傳統意義上認為哺乳動物的心肌細胞是終末分化的細胞，且基本沒有增殖能力，其不能進入細胞周期進而不能通過去分化和再分化的過程恢復完整的功能。但新近研究表明，斑馬魚的心肌細胞在其發育的整個階段可以保持增殖潛力，成年斑馬魚可以在部分手術切除高達20％的心室后實現心臟的完全恢復，甚至發現心肌細胞可通過去分化促進細胞再進入周期實現細胞增殖。類似研究也表明，心肌去分化的現象也發生在心肌梗死邊界區。

與體內生理病理條件相比，模擬體內三維微環境，體外構建的工程化心肌組織確實在心肌組織重建中具有特殊意義。過去我們實驗室，已開展了大量的工程化心肌組織構建的研究，已成功構建了利用新生大鼠心肌細胞與膠原/matrigel混合的心肌組織。膠原和基質膠是常用的天然材料用于組織工程，它們是心肌組織工程構建中重要的支架材料。然而，基于膠原/matrigel構建的心肌組織中是心肌細胞如何發育，是否同樣存在心肌細胞的分化與去分化現象尚未有報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種工程化心肌組織中心肌細胞去分化重塑的方法。

一種工程化心肌組織中心肌細胞去分化重塑的方法，包括如下步驟：

(1)取哺乳動物肌腱，剪碎，溶于醋酸溶液中,12000rpm/4℃離心后取上清，制成ⅰ型膠原；

(2)將ⅰ型膠原，基質膠matrigel，dmem溶液混合，并用naoh溶液調為中性，制成混合物；

(3)取哺乳動物的心肌細胞，與步驟(2)制備的混合物混合，接種到孔板中，在的培養箱中預培養0.5-1h后，添加培養基，培養至心肌重塑形成。

所述醋酸溶液的質量分數為1％；所述ⅰ型膠原的濃度為2mg/ml。

所述ⅰ型膠原，基質膠，dmem的質量比為5:4:1；所述dmem溶液的質量濃度為0.1-10％。

所述naoh溶液的濃度為0.1m。

所述哺乳動物的心肌細胞的細胞密度為2-9×10⁶cells/ml。

所述孔板為12孔板，接種量為每孔1ml。

所述培養箱的培養條件為37uc/5％co2。

所述培養基的成分包括85wt％高糖dmem和15wt％fbs。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明以膠原/基質膠為支架材料，新生sd大鼠心肌細胞為種子細胞，體外構建了工程化心肌組織。利用免疫熒光染色的方式，對eht中巨噬細胞的變化規律做了初步探討，結果顯示，cd206陽性細胞數逐漸增加而cd86陽性細胞數則逐漸降低。本發明的方法將工程化心肌組織中心肌細胞去分化并且重塑，深入闡明心肌細胞的再生機制并提高eht的構建質量。

附圖說明

圖1是本發明的大鼠心肌細胞培養3天的eht中心肌細胞發生去分化電鏡圖。

圖2是tem分析工程化心肌組織中心肌細胞的重塑電鏡圖。

圖3是培養第10天ehts中發生重塑的心肌細胞形態學特征電鏡圖。

圖4為平面培養的細胞圖。

具體實施方式

下面結合附圖，對本發明的具體實施方式進行詳細描述，但應當理解本發明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。

一種工程化心肌組織中心肌細胞去分化重塑的方法，包括如下步驟：

(1)取成年sd大鼠鼠尾肌腱，剪碎，溶于1％的醋酸溶液中，12000rpm/4℃離心后取上清，制備2mg/ml的ⅰ型膠原；

(2)將膠原，基質膠matrigel，dmem溶液按質量比5:4:1混合，并用0.1m的naoh調為中性，制成混合物；所述dmem溶液的質量濃度為1％。

(3)取sd大鼠的心肌細胞，按8×10⁶cells/ml細胞密度與上述混合物混合，接種到12孔板中，每孔1ml，在37uc/5％co2的培養箱中預培養0.5-1h后，添加培養基(85wt％dmem高糖+15wt％fbs)。

實驗結果：

(1)培養3天的eht中心肌細胞發生去分化

通過h&e染色顯示出膠原/基質膠中的心肌細胞的形態特征。如圖1a所示，在h&e染色切片中觀察到新生大鼠心肌細胞逐漸喪失其形態特征，且大量心肌細胞在培養時呈橢圓形，細胞核偏向一側。為了進一步觀察心肌細胞在體外三維環境中去分化的程度，使用透射電子顯微鏡(tem)分析了eht中心肌細胞的顯微結構(見圖1中的c)。結果表明，在培養早期可以觀察到心肌細胞的去分化現象。在培養3天的eht中，心肌細胞的細胞質中釋放出肌原纖維；且與正常的心肌細胞相比z帶結構和周圍肌節逐漸消失。同時，心肌細胞釋放出大量的肌原纖維，通過胞吐進入細胞外基質，釋放的肌原纖維環繞在心肌細胞周圍。同時，我們利用免疫熒光檢測α-平滑肌-肌動蛋白(α-sm-a)的表達情況，結果顯示工程化心肌組織中有α-sm-a陽性表達的心肌細胞，間接說明發生了心肌細胞發生了去分化現象(見圖1中的b)。

(2)tem分析工程化心肌組織中心肌細胞的重塑

當心肌細胞發生去分化后，繼續培養至第七天，利用tem觀察心肌細胞在eht條件下的超微結構。結果顯示：隨著心肌細胞逐漸培養，去分化的心肌細胞在另一側開始形成新的細胞質，同時啟動了心肌細胞的重塑(見圖2中的a)。在培養第7天可以觀察到幼稚的心肌細胞。此時，我們發現心肌細胞經歷了新的表型變化。細胞顯示不成熟的形態和不規則的輪廓，發生了較短的延伸，圍繞核周圍發生肌節重組，且可以清晰的觀察到z帶及h帶。發生重塑的心肌細胞中存在許多線粒體和肌節絲(圖2中的b)。此外，在個別心肌細胞間形成細胞內連接，且透射電鏡結果可以清晰的觀察到心肌細胞邊緣有類囊泡物質與細胞膜相連(圖2中的c)。雖然在細胞質中有新的肌節細絲組裝，但仍然缺乏標志性的橫向和縱向肌節結構。

(3)培養第10天ehts中發生重塑的心肌細胞形態學特征

培養10天后，采用h&e染色可以清晰的觀察到典型的心肌細胞形態特征，細胞呈長梭形(見圖3中的b)，這些具有再分化表型的心肌細胞的比例增多，但也同時發現ehts中分布于膠原/基質膠邊緣的心肌細胞再分化程度與分布于中心的心肌細胞再分化程度不同，心肌細胞結構特征不清晰(見圖3中的a)。透射電鏡顯示心肌細胞的表型開始改變并且呈現極性。在細胞外基質中發現大量的線粒體和肌原纖維(見圖3中的d)。它們可能為心肌細胞再分化提供能量基礎。再分化心肌細胞呈現不連續的輪廓，雖然心肌細胞仍然不成熟，細胞輪廓和肌絲的形態接近正常心肌細胞的形態(見圖3中的c)。我們還可以觀察到材料(膠原/matrigel)和細胞膜之間的連接(見圖3中的d)。我們同樣發現不是所有的去分化心肌細胞都可以經歷再分化過程從而實現心肌細胞重構，但掃描電鏡結果已可證實工程化心肌組織中心肌細胞經歷去分化和再分化的過程恢復再生能力。

在發現ehts中心肌細胞去分化及重塑發生的同時，發明人檢測了其中巨噬細胞的標記物cd206，cd86，cd68的變化規律。結果顯示，在培養初期，ehts中有少量cd206的表達，但cd86表達較多。這意味著培養3天的eht發生炎癥反應。同時，隨著培養天數的增加，cd206的陽性細胞數量有顯著增加，發明人分析，cd206陽性細胞可能有利于心肌細胞的再分化；相反，cd86陽性細胞數逐漸減少，暗示心肌細胞再分化過程中炎癥反應減少。直到培養第14天，cd206陽性數量與第3天和第7天比最多，但幾乎不存在cd86的表達。期間，cd68陽性細胞數變化不明顯。

發明人也發現，平面培養的細胞中同樣有巨噬細胞的表達，其中除cd86陽性細胞數隨著培養天數的增加逐漸減少外，cd206及cd68陽性細胞數的變化并不明顯(圖4)。

本發明在體外構建工程化心肌組織，通過闡述工程化心肌組織中心肌細胞是否發生去分化進而實現心肌細胞的重塑，并最終恢復增殖能力，以期為構建高質量心肌組織，探討心臟再生機制提供理論依據。本發明以膠原/基質膠為支架材料，新生sd大鼠心肌細胞為種子細胞，體外構建了工程化心肌組織。采用h&e染色，透射電鏡及免疫熒光檢測手段證實了在培養第3天，心肌細胞發生去分化，觀察到細胞核偏向一側，肌原纖維被釋放出胞質。培養7天后，心肌細胞開始表現出幼稚的細胞形態，并在核周圍逐漸重新形成肌節。在培養第14天天，再分化表型的心肌細胞比例增加。進一步采用實時定量pcr，免疫熒光染色檢測了工程化心肌組織中心肌細胞特異性標記物的變化規律。結果表明α-actinin及ctnt隨著培養天數的增加先降低后升高，而心肌細胞特異性轉錄因子(gata4/nkx2.5)則隨著培養時間的延長升高后降低。利用免疫熒光染色的方式，對eht中巨噬細胞的變化規律做了初步探討，結果顯示，cd206陽性細胞數逐漸增加而cd86陽性細胞數則逐漸降低。本發明闡述了工程化心肌組織中心肌細胞的去分化及重塑現象，在深入闡明心肌細胞的再生機制并提高eht的構建質量方面發揮巨大潛能。

以上公開的僅為本發明的具體實施例，但是，本發明并非局限于此，任何本領域的技術人員能思之的變化都應落入本發明的保護范圍。