本發明涉及一種發掘及驗證具有累積效應的水稻株高等位基因的方法，該方法屬于水稻生物技術領域，該方法發掘出來的株高等位基因具有累積效應，這些等位基因可應用于水稻分子標記輔助選擇等領域。
背景技術：
水稻是我國非常重要的糧食作物，因為水稻生產關系著我國的糧食安全。水稻的很多重要的農藝性狀都是數量性狀。檢測水稻數量性狀基因座位(quantitativetraitlocus，qtl)已經有區間作圖、復合區間作圖等方法。目前在水稻上已通過qtl分析檢測出大量的與各種各樣的農藝性狀相關的qtl。但是，如何檢測出與水稻某個性狀相關的具有累積效應的qtl，并發掘這些具有累積效應的等位基因？在此背景下，本發明提出一種發掘及驗證具有累積效應的水稻株高等位基因的方法，該方法發掘出來的株高等位基因具有累積效應，這些等位基因在水稻遺傳學上對研究等位基因之間的關系提供了研究資源，此外，這些等位基因在水稻分子標記輔助育種等領域具有重要的生產應用前景。
技術實現要素：
本發明采用的是利用水稻f2群體發掘及驗證具有累積效應的株高等位基因的方法。本發明主要解決了如何發掘及驗證具有累積效應的水稻株高等位基因這一問題。本發明可以為研究等位基因之間的關系提供基因資源，也可以為分子標記輔助育種提供具有累加效應的株高等位基因。
本發明包括以下步驟：
(1)將水稻品種1與水稻品種2雜交并構建f2分離群體；
(2)用分布于水稻12條染色體的、在品種1和品種2之間具有多態性的分子標記pcr擴增步驟(1)獲得的f2分離群體內的不同單株的葉片dna，并在成熟收獲期測量f2分離群體內每個單株的株高，利用多區間作圖法檢測與株高相關的數量性狀基因座位(qtl)；
(3)用步驟(2)檢測出的與株高qtl最近的分子標記來分別代表每一個株高qtl的基因型，利用雙向方差分析法檢測各個株高qtl兩兩之間是否存在極顯著(p＜0.01)的互作，排除具有極顯著兩兩互作效應的qtl，保證留下的qtl均不存在兩兩間的極顯著的互作；
(4)用和每個qtl最近的分子標記基因型來代表步驟(3)得到的無極顯著兩兩上位性互作效應的qtl的基因型，計算步驟(1)描述的f2分離群體每一個單株的無極顯著兩兩上位性互作效應的qtl的累計基因型值，用相關分析檢測步驟(1)描述的分離群體內所有單株的累計基因型值和株高之間是否有極顯著(p＜0.01)的正相關，如果有極顯著的正相關，則步驟(3)得到的無極顯著兩兩上位性互作效應的qtl上的等位基因就是具有累積效應的株高等位基因；
(5)驗證步驟(4)用相關分析得到的具有累積效應的株高等位基因的方法是，假定步驟(2)檢測出的不同株高qtl上的等位基因具有相同效應，即假定不同qtl上使株高相對增高的不同座位上的等位基因的效應一致，假定不同qtl上使株高相對降低的不同座位上的等位基因的效應也一致，將攜帶相同數目相同類別等位基因的單株進行歸類，分析累積效應是否成立。
進一步地，所述步驟(1)中，水稻品種1與水稻品種2可以都是秈稻，也可以都是粳稻，或者一個是秈稻、一個是粳稻；f2分離群體內的單株數目在150個至250個之間。
進一步地，所述步驟(2)中，分布于水稻12條染色體、在品種1和品種2之間具有多態性的分子標記的數目應該達到保證標記間的平均間距小于12厘摩爾；本發明專利特別強調，步驟(2)檢測株高qtl的方法必須使用多區間作圖方法，不能使用區間作圖法或者復合區間作圖法。
進一步地，所述步驟(3)中，雙向方差分析的目的是排除具有上位性互作效應的qtl，使留下的所有的qtl兩兩之間均不存在極顯著的上位性互作效應；假如步驟(2)檢測出的株高qtl數目有3個，假定分別為qtla，qtlb，qtlc，則雙向方差分析需要進行3次，分別在qtla和qtlb之間，qtla和qtlc之間，qtlb和qtlc之間各進行一次雙向方差分析；假如步驟(2)檢測出的株高qtl數目有4個，假定分別為qtla，qtlb，qtlc，qtld，則雙向方差分析需要進行6次，分別在qtla和qtlb之間，qtla和qtlc之間，qtla和qtld之間，qtlb和qtlc之間，qtlb和qtld之間，qtlc和qtld之間各進行一次雙向方差分析；步驟(2)檢出的株高qtl數目為其他數目的情況依此類推：進行雙向方差分析時，用與株高qtl最相近的分子標記基因型來分別代表每一個株高qtl的基因型。
進一步地，所述步驟(4)中，f2分離群體每一個單株的無極顯著兩兩上位性互作效應的qtl的累計基因型值的計算方法為，首先計算某個單株某個qtl的基因型值，將一個特定qtl的等位基因中，具有相對另一個等位基因的使株高增高的效應的等位基因的基因型值設定為1，將另一個具有使株高相對降低效應的等位基因的基因型值設定為-1，則在這個qtl座位上，攜帶純合的兩個株高增高效應的等位基因的基因型值為2，攜帶純合的兩個株高降低效應的等位基因的基因型值為-2，雜合子的基因型值為0；其次，再將所有qtl座位的基因型值相加，獲得f2分離群體內每一個單株的無極顯著兩兩上位性互作效應的qtl的累計基因型值。
進一步地，該方法可以簡單歸納成以下4個核心步驟：第一步是利用多區間作圖法在f2群體檢測與株高有關的qtl，第二步是利用雙向方差分析方法排除具有極顯著兩兩上位性效應的qtl，獲得兩兩間無極顯著上位性互作效應的株高qtl，第三步是利用相關分析檢測這些無極顯著兩兩上位性效應的株高qtl的等位基因之間是否具有統計意義上極顯著的累加效應，如果有極顯著的正相關，則最終得到的株高等位基因具有累積效應，第四步是將攜帶相同數目相同類別等位基因的單株進行歸類，驗證累積效應是否成立；用19個字的一句話概括這4個核心步驟就是：“多區間作圖、雙向方差分析、相關分析、歸類驗證”。
具體實施方式
1.將水稻品種lemont與水稻品種揚稻4號雜交，構建一個包含190個單株的f2代分離群體(水稻品種lemont與水稻品種揚稻4號由中國水稻研究所國家水稻種質資源中期庫提供)。
2.用分布于水稻12條染色體的180個在品種lemont和品種揚稻4號之間具有多態性的分子標記擴增f2分離群體內的190個單株，構建分子標記遺傳圖譜；這180個多態性分子標記主要包括微衛星標記(以字母rm開頭)和插入-缺失標記(以字母d開頭)，這180個分子標記的具體名稱見wenz.h.，etal.mappingquantitativetraitlociforsheathblightdiseaseresistanceinyangdao4rice.geneticsandmolecularresearch，2015年，14卷：1636-1649。
3.2011年夏季在杭州市富陽市中國水稻研究所試驗農場種植這個190個單株的f2代分離群體，在成熟收獲期測量每個單株的株高，利用多區間作圖法檢測與株高相關的數量性狀基因座位(qtl)，共檢測出6個與株高相關的qtl(表1)。
表1.利用水稻品種lemont與水稻品種揚稻4號雜交構建的一個包含190個單株的f2代分離群體，用多區間作圖法檢測出的6個株高qtl，該f2群體于2011年5月播種于杭州富陽中國水稻研究所試驗農場
4.用離每個qtl最相近的分子標記來分別代表每一個株高qtl的基因型，利用雙向方差分析法檢測各個株高qtl兩兩之間是否存在極顯著的互作，結果顯示，表1列出的6個qtl兩兩之間均不存在極顯著的互作，詳細結果見表2至表16。
表2.雙向方差分析證明qph-lemont-1和qph-lemont-3之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表3.雙向方差分析證明qph-lemont-1和qph-yangdao4-4之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表4.雙向方差分析證明qph-lemont-1和qph-yangdao4-6之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表5.雙向方差分析證明qph-lemont-1和qph-lemont-10之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表6.雙向方差分析證明qph-lemont-1和qph-yangdao4-12之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表7.雙向方差分析證明qph-lemont-3和qph-yangdao4-4之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表8.雙向方差分析證明qph-lemont-3和qph-yangdao4-6之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表9.雙向方差分析證明qph-lemont-3和qph-lemont-10之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表10.雙向方差分析證明qph-lemont-3和qph-yangdao4-12之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表11.雙向方差分析證明qph-yangdao4-4和qph-yangdao4-6之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表12.雙向方差分析證明qph-yangdao4-4和qph-lemont-10之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表13.雙向方差分析證明qph-yangdao4-4和qph-yangdao4-12之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表14.雙向方差分析證明qph-yangdao4-6和qph-lemont-10之間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表15.雙向方差分析證明qph-yangdao4-6和qph-yangdao4-12間沒有極顯著互作(p＜0.01)
表16.雙向方差分析證明qph-lemont-10和qph-yangdao4-12間沒有極顯著互作(p＜0.01)
5.計算該f2分離群體190個單株里面每一個單株的6個無極顯著上位性互作效應的株高qtl的累計基因型值，每個單株的累計基因型值計算方法為：將一個qtl的等位基因中具有相對另一個等位基因使株高增高的效應的等位基因的基因型值命名為1，將一個qtl等位基因中具有相對另一個等位基因使株高降低效應的等位基因的基因型值命名為-1，則攜帶純合的兩個株高增高效應的等位基因的基因型值為2，攜帶純合的兩個株高降低效應的等位基因的基因型值為-2，雜合子的基因型值為0；例如，該f2分離群體編號為1號的單株的6個qtl座位的基因型分別為h、ll、ll、yy、ll、yy(h代表雜合基因型，ll代表攜帶2個lemont等位基因，yy代表攜帶2個揚稻4號等位基因)，則這個編號為1號的單株的累計基因型值＝h+ll+ll+yy+ll+yy＝0+0+1+1+(-1)+(-1)+1+1+1+1+1+1＝6。
6.用相關分析檢測這190個單株的這6個無極顯著上位性互作效應的株高qtl的累計基因型值和株高之間是否有極顯著的正相關。相關分析結果顯示，累計基因型值和株高之間有極顯著正相關(p＜0.0001)，相關系數為0.39864。因此，這6個無極顯著上位性互作效應的株高qtl上的12個等位基因就是具有累加效應的株高等位基因。
7.上述步驟檢出的6個qtl共含有12個等位基因，將該f2分離群體190個單株攜帶不同類型等位基因的單株進行歸納，并統計每個類別單株的平均株高，結果顯示，攜帶具有增高效應的等位基因數目越多的單株的平均株高越高，攜帶具有降低效應的等位基因數目越多的單株的平均株高越矮(表17)。表17結果很好驗證了這6個無極顯著上位性互作效應的株高qtl上的12個等位基因確實具有累積效應。
表17.對2011年夏季播種于杭州富陽中國水稻研究所的190個單株的f2分離群體根據每一單株攜帶的等位基因類型進行歸類后統計每個類型單株的平均株高(只統計每個類型單株數大于等于2的單株，每個類型單株數少于2的無重復的單株不作統計)
8.利用該f2群體檢出的12個具有累積效應的等位基因可應用在分子標記輔助育種、研究等位基因之間的關系等領域。
最后，需要指出的是，本發明不僅僅限于以上的實施例子，本領域技術人員從本發明公開內容直接推導或聯想到的所有變通情況，均認為是本發明的保護范圍。