基因修飾的免疫效應細胞和用于擴增免疫效應細胞的工程化細胞的制作方法

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背景

1.發明領域

本文描述的是嵌合抗原受體(car)、表達car的免疫效應細胞以及制備和使用car和cart細胞的方法。還提供了具有增強的治療性質的免疫效應細胞組合物和抗原呈遞細胞。

2.相關領域的描述

臨床級t細胞的效力可通過將基因療法與免疫療法組合以工程化生物制品來提高，所述生物制品具有(i)腫瘤相關抗原(taa)的識別，(ii)輸注后的持久性，(iii)遷移到腫瘤部位的潛力以及(iv)在腫瘤微環境內循環效應子功能的能力的優良潛能。t細胞的此類基因工程可用于重定向細胞的特異性并提供具有抗原靶向的細胞毒性活性的治療組合物。已經顯示這些工程化的t細胞組合物對例如癌癥患者的治療干預是有效的(jena等，2010；till等，2008；porter等，2011；brentjens等，2011；cooper和bollard，2012；kalos等，2011；kochenderfer等，2010；kochenderfer等，2012；brentjens等，2013)。然而，仍然需要允許控制體內持久性的改進的t細胞和car構建體。

發明概述

在第一實施方案中，提供了包含抗原結合結構域、鉸鏈結構域、跨膜結構域和一個或多個細胞內信號傳導結構域的嵌合抗原受體(car)多肽。在一些方面，鉸鏈結構域包含結與fc受體諸如fcγr2a或fcγr1a結合的序列。例如，鉸鏈序列可以包含與fc受體結合的來自人免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd或ige)的fc結構域。在某些方面，鉸鏈結構域(和/或car)不包含野生型人igg4ch2和ch3序列。

在另外的方面，實施方案的car的鉸鏈結構域可包含表現出減少的與fc受體(諸如fcγr2a和/或fcγr1afc受體)結合或基本上無與所述受體結合的序列。在一些方面，鉸鏈結構域包含(i)具有與seqidno：1(突變型igg4-fc序列)相同的至少8個連續氨基酸的人igg4-fc序列，所述序列相對全長野生型igg4-fc具有減少的fc受體結合；或(ii)人cd8a細胞外序列。

在一些方面，鉸鏈結構域可包含具有與seqidno：1(突變型igg4-fc序列)相同的至少8個連續氨基酸的人igg4-fc序列，所述序列具有相對于全長野生型igg4-fc減少的fc受體結合。在一些方面，鉸鏈結構域可包含與seqidno：3(12個氨基酸的間隔子)具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一個方面，鉸鏈結構域可包含與seqidno：3(12個氨基酸的間隔子)相同的序列。在另外的方面，鉸鏈結構域可包含相對于seqidno：3具有不超過1、2或3個氨基酸缺失或取代的序列。

在某些方面，鉸鏈結構域可包含igg4-fc序列，所述序列相對于野生型igg4-fc包含至少一個突變，其降低fc-受體結合。在一些方面，igg4-fc序列可與seqidno：1具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些方面，igg4-fc序列相對于野生型序列可包含l235e或n297q突變。在某些方面，igg4-fc序列相對于野生型序列可包含l235e和n297q突變。在一個方面，igg4-fc序列可與seqidno：1相同，或相對于seqidno：1可包含不超過1個、2個或3個氨基酸缺失或取代。在另一方面，igg4-fc序列i與seqidno：1相同。

在一些方面，鉸鏈結構域可包含cd8a細胞外序列。例如，鉸鏈結構域可包含與seqidno：2的細胞外部分具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可包含與seqidno：2的細胞外部分相同的序列，或相對于seqidno：2的細胞外部分可包含不超過1個、2個或3個氨基酸缺失或取代。在另外的方面，car多肽的鉸鏈結構域包含與seqidno：20具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可以包含與seqidno：20相同的序列，或者相對于seqidno：20可包含不超過1個、2個或3個氨基酸缺失或取代。

在一些方面，跨膜結構域可包含cd8a跨膜結構域。在某些方面，car多肽可包含與seqidno：2的跨膜部分具有至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一個方面，car多肽可包含與seqidno：2的跨膜部分相同的序列，或相對于seqidno：2的跨膜部分可包含不超過1個、2個或3個氨基酸缺失或取代。在某些方面，跨膜結構域可包含cd28、cd8a或cd137的跨膜結構域。在另外的方面，跨膜結構域可包含與seqidno：19具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的cd8a跨膜結構域。在另外的方面，car多肽可包含與seqidno：19相同的跨膜序列，或相對于seqidno：19可包含不超過1個、2個或3個氨基酸缺失或取代。

在一些方面，細胞內細胞信號傳導結構域可包含來自cd3ζ的結構域。例如，實施方案的car多肽可包含與seqidno：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的cd3ζ序列。在另外的方面，car多肽可包含與seqidno：13相同的cd3ζ序列，或相對于seqidno：13可包含不超過1個、2個或3個氨基酸缺失或取代。另外的方面，細胞內細胞信號傳導結構域可包括來自cd28或cd137(4-1bb)的細胞內結構域。例如，car可包含細胞內細胞信號傳導結構域，其包含與seqidno：15或seqidno：17具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在另外的方面，car多肽可包含細胞內細胞信號傳導結構域，其包含與seqidno：15或seqidno：17相同的序列，或相對于seqidno：15或17可包含不超過1個、2個或3個氨基酸缺失或取代。

在各個方面，實施方案的car的抗原結合結構域可包含scfv或抗體的重鏈可變結構域(vh)和輕鏈可變結構域(vl)。在另外的方面，抗原結合結構域可包含第一scfv結構域和第二scfv結構域，其中所述第一或第二scfv結構域之一與第一抗原結合，并且另一結構域結合第二抗原。在一些方面，vl結構域可以相對于vh結構域位于n末端。在某些方面，vh結構域可以相對于vl結構域位于n末端。在某些方面，car多肽還可在輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域之間和/或第一與第二scfv結構域之間包含接頭序列。在一些方面，接頭序列可以是whitlow接頭(seqidno：7)。

在各個方面，抗原結合結構域可結合感染性疾病抗原或癌細胞抗原。癌細胞抗原的實例包括cd19、cd20、ror1、cd22癌胚抗原、甲胎蛋白、ca-125、5t4、muc-1、上皮腫瘤抗原、前列腺特異性抗原、黑素瘤相關抗原、突變p53、突變ras、her2/neu、葉酸結合蛋白、hiv-1包膜糖蛋白gp120、hiv-1包膜糖蛋白gp41、gd2、cd123、cd33、cd138、cd23、cd30、cd56、c-met、間皮素、gd3、herv-k、il-11rα、κ鏈、λ鏈、cspg4、erbb2、egfrviii、vegfr2、組合的her2-her3、組合的her1-her2或組合的her1-her3。在一些方面，癌細胞抗原可以是cd19，car可以是cd19靶向的car。

在另一個實施方案中，提供了編碼根據實施方案的car多肽的核酸分子。在一些方面，編碼car的序列側接轉座子重復序列或病毒ltr。

在另外的實施方案中，提供了包含根據實施方案的car多肽或核酸的分離的免疫效應細胞(例如，t細胞、nk細胞或nkt細胞)。在一些方面，細胞是t細胞或t細胞祖細胞。在另外的方面，細胞是人細胞。在某些方面，細胞組合物可包含低至100個或1,000個細胞。然而，在一些方面，細胞組合物包含至少約10⁴個、10⁵、10⁶個、10⁷個、10⁸個｀10⁹個、10¹⁰個、10¹¹個或更多個表達car的免疫效應細胞。在一些方面，細胞可具有基本相同的遺傳物質。在另外的方面，細胞可以是來源于可以是供體或患者的單個受試者的人類細胞。另一個實施方案提供了藥物組合物，其在藥學上可接受的載體中包含根據實施方案的表達car的細胞群。

在另外的實施方案中，提供了治療受試者(例如，患有癌癥或感染性疾病的受試者)的方法，所述方法包括施用有效量的表達根據實施方案的car多肽的免疫效應細胞。在某些方面，受試者可能患有癌癥。在某些方面，癌癥可以是血液癌癥或實體癌，諸如t細胞all、b-all、cml、結腸癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可能已經經歷了先前的抗癌療法。在一些方面，患者可能處于緩解狀態。在另一方面，患者可能沒有癌癥的癥狀，但包含可檢測的癌細胞。另一方面，受試者可能具有病毒感染(例如，巨細胞病毒(cmv)、愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一個方面，受試者可具有細菌感染。在一個方面，所述疾病可以是敗血癥。

在某些方面，治療受試者的方法包括施用表達car的免疫效應細胞(例如t細胞)，所述car包含具有結合人fc受體的多肽序列的鉸鏈結構域。在一些方面，向例如患病組織的部位局部施用此類免疫效應細胞。在某些方面，局部遞送部位具有減少數目(或基本上沒有)的表達fc受體的細胞。例如，施用部位可存在于受試者的中樞神經系統(例如，腦)、眼或睪丸中。

在一些方面，car多肽可包含結合癌細胞抗原的抗原結合結構域。在某些方面，癌癥可以是乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、胃癌、結直腸癌或胰腺癌。在另外的方面，癌癥表達被car的抗原結合結構域結合的癌細胞抗原。在另外的方面，受試者已被鑒定為具有表達car多肽所結合的癌細胞抗原的癌癥。在另外的方面，先前從受試者分離了免疫效應細胞(例如，t細胞)。

在一些另外的方面，免疫效應細胞(例如，t細胞)可與患者同種異體。在各方面，同種異體細胞可以與或可以不與患者共享hla。另一個方面，免疫效應細胞對于患者可以是自體的。

在另一個實施方案中，提供了一種方法，其包括獲得包含免疫效應細胞或其祖細胞(例如，t細胞或t細胞祖細胞)的細胞樣品，用編碼根據實施方案的car多肽的dna轉染細胞，提供轉基因表達car的細胞，以及在選擇性增強表達car的免疫效應細胞(例如，表達car的t細胞)的增殖的培養基中離體培養轉基因car細胞群。在一些方面，所述方法還包括用轉座子側連的car和轉座酶轉染細胞，所述轉座酶有效地將編碼car的dna整合入細胞的基因組中。在另外的方面，方法包括在轉染前純化或富集樣品中的t細胞。在一些情況下，免疫效應細胞(例如，t細胞或t細胞祖細胞)來源于誘導的多能干細胞或胚胎干細胞。在另外的方面，富集樣品中的細胞包括收集單核細胞級分。在一些情況下，細胞樣品可以來自受試者的臍帶血、淋巴器官或外周血樣品。在一些情況下，可以通過單采或靜脈穿刺獲得細胞樣品。在另外的方面，細胞樣品是免疫細胞的亞群，諸如t細胞的亞群。在一些方面，將轉基因car細胞滅活以用于表達內源t細胞受體和/或內源hla。在另外的方面，獲得細胞樣品包括從第三方獲得細胞。

在一些方面，轉染方法(例如，car構建體的轉染方法)包括將編碼car的dna電穿孔至細胞(例如，t細胞)中。在另外的方面，可使用病毒載體將car構建體轉導入細胞。在一些方面，轉染可以不涉及用病毒感染或轉導細胞。在另外的方面，用編碼膜結合的cγ細胞因子的核酸另外轉染細胞。在一些情況下，膜結合的cγ細胞因子可以是膜結合的il-7、il-15或il-21。在具體方面，膜結合的cγ細胞因子是il-15-il-15rα融合蛋白(例如，諸如seqidno：4的mil-15多肽)。

在另外的方面，編碼car的dna是質粒。在另外的方面，car可由引入細胞的rna編碼。在某些方面，轉座酶可以作為dna表達載體、mrna、多肽或可表達的rna來提供。在具體方面，轉座酶是鮭魚型tc1樣轉座酶(sb)。在另外的具體方面，轉座酶是sb11或sb100x轉座酶。

在實施方案的另外的方面，按照本文詳述的方法培養轉基因car細胞，包括在樹突狀細胞存在的情況下培養轉基因car細胞，或者激活和繁殖刺激表達car的免疫效應細胞的擴增的細胞(aapc)。在另外的方面，aapc包含在aapc表面上表達的car結合抗體或其片段。在一些情況下，aapc可包含激活或共刺激t細胞的另外分子。在一些情況下，所述另外分子可包含膜結合的cγ細胞因子。在另外的方面，滅活或輻照aapc，或已測試其感染性物質并確認其不含感染性物質。在另外的方面，在aapc存在的情況下培養轉基因car細胞包括在包含可溶性細胞因子諸如il-21和/或il-2的培養基中培養轉基因car細胞。可以以約10∶1至約1∶10、約3∶1至約1∶5、約1∶1至約1∶3(免疫效應細胞cfaapc)或可來源于其中的任何范圍的比例培養所述細胞。例如，t細胞和aapc的共培養物可以是約1∶1、約1∶2或約1∶3的比例。

在另外的方面，培養轉基因car細胞群不超過7天、14天、21天、28天、35天或42天。在一些情況下，不在aapc存在的情況下離體培養轉基因細胞。在一些具體情況下，實施方案的方法還包括在轉染和/或培養步驟后富集表達car的免疫效應細胞(例如，t細胞)的細胞群。富集可包括熒光激活細胞分選(facs)和對表達car的細胞的分選。在另外的方面，car表達細胞的分選包括使用car結合抗體。富集還可包括cd56+細胞的耗盡。在實施方案的另外的方面，所述方法還包括冷凍保存轉基因car細胞群的樣品。

在另外的實施方案中，提供了通過任何實施方案的方法制備的表達car的免疫效應細胞(例如，t細胞)群。

在另外的實施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括按照本實施方案的方法產生細胞組合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述細胞組合物。在一些方面，提供了用于治療患有醫學病況的個體的方法，所述方法包括從本文描述的細胞群體提供有效量的細胞的步驟，包括在一些方面不止一次提供，例如間隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在另外的實施方案中，提供了包含編碼靶抗原的第一轉基因和編碼人白細胞抗原(hla)的第二轉基因的工程化抗原呈遞細胞(apc)，所述hla在與靶抗原的表位復合的apc的表面上表達。工程化的apc可以是或可以不是永生化的。在一些方面，工程化的apc是原代細胞或t細胞或t細胞祖細胞。在一些其它方面，工程化的apc是表達αβtcr或γδtcr的t細胞。在某些具體方面，在工程化的apc中表達的hla是hla-a2。在另外的方面，工程化的apc已被測試并被確認為沒有傳染性材料。

在一些方面，實施方案的工程化的apc還可包含編碼共刺激分子的至少第三轉基因。共刺激分子可以是可為膜結合的cγ細胞因子的共刺激細胞因子。在某些方面，共刺激細胞因子是il-15，其可以是或可以不是膜結合的。

在另外的方面，滅活或輻照實施方案的工程化的apc。在一些方面，工程化的apc可包含經編輯的基因以減少或消除抑制基因的表達。在具體方面，抑制性基因是pd-1、lim-3、ctla-4或tcr。

在另外的方面，在實施方案的工程化的apc中表達的靶抗原可以是感染性疾病抗原或腫瘤相關抗原(taa)。靶抗原可以是細胞內或細胞表面抗原。例如，在一些方面，靶抗原是taa，諸如源自腫瘤細胞的亞細胞區室的taa。taa可以是膜結合的、細胞質的、核定位的或甚至由腫瘤細胞分泌的。優選地，與相應的正常組織相比，taa差異表達，從而允許免疫效應細胞優先識別腫瘤細胞。腫瘤抗原可以被松散地分類為癌胚胎的(通常只在胎兒組織和癌性體細胞中表達的)、致癌病毒的(oncoviral)(由致瘤轉化病毒編碼的)、過表達/積累的(由正常和腫瘤組織表達的，表達水平在瘤形成中高度升高)、癌-睪丸的(僅由癌細胞和成體生殖組織諸如睪丸和胎盤表達的)、譜系限制的(主要由單個癌組織型表達的)、突變的(僅由作為遺傳突變或轉錄的改變的結果而產生的癌癥表達的)、翻譯后改變的(糖基化中的腫瘤相關的改變，等等)或獨特型的(高度多態性的基因，其中腫瘤細胞表達特定的“克隆型”，例如，如在因克隆異常而導致的b細胞、t細胞淋巴瘤/白血病中)，任何此類taa可用作根據實施方案的靶抗原。靶抗原的具體實例包括但不限于wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、獨特型、magea3、p53非突變體、ny-eso-1、psma、gd2、cea、melana/mart1、ras突變體、gp100、p53突變體、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、肉瘤易位斷裂點、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受體、細胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mcn、rhoc、trp-2、gd3、巖藻糖基gm1、間皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、ot-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos相關抗原1。其它方面，靶抗原是感染性疾病抗原。

在另外的方面，實施方案的工程化的apc是人細胞。在一些方面，可將工程化的apc的第一和/或第二轉基因整合至細胞的基因組中。另外，在某些方面，所述第一和/或第二轉基因可以側接轉座子重復或病毒ltr。在另外的方面，第一和/或第二轉基因由重組mrna編碼。

在另外的實施方案中，提供了包含根據實施方案的工程化的apc群和具有針對與apc中表達的hla復合的靶抗原的表位的特異性的免疫效應細胞(例如，t細胞)群的細胞培養物。在某些方面，培養物的免疫效應細胞具有與工程化的apc相同的遺傳背景。在具體方面，免疫效應細胞表達與在工程化的apc中表達的hla復合的靶抗原表位結合的t細胞受體(tcr)。在特定方面，tcr是αβtcr。在某些方面，靶抗原是ny-eso-1。在一些具體方面，tcr包含與抗-ny-eso-1-αβtcr(seqidno：28)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與其相同的序列。

在另外的方面，細胞培養物的免疫效應細胞(包括實施方案的工程化的apc)表達嵌合的t細胞受體(car)，其結合與在工程化的apc中表達的hla復合的靶抗原的表位。car可包含結合與在apc中表達的hla復合的靶抗原的表位的抗體可變結構域。在一些具體方面，靶抗原是ny-eso-1。在某些方面，car包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的序列。

在一些方面，實施方案的工程化的apc的細胞培養物可包含刺激免疫效應細胞(例如，t細胞)擴增的培養基。培養基可包含il-21和/或il-2。在具體方面，培養物包含為約10∶1至約1∶10(免疫效應細胞對工程化的apc)的比例。

在另外的實施方案中，提供了藥物組合物，其案在藥學上可接受的載體中包含根據本文所述的實施方的工程化的apc群。

在另外的實施方案中，提供了治療患有疾病的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的根據實施方案的工程化的apc，其中所述apc表達與該疾病相關的靶抗原。在一些方面，受試者患有表達由工程化的apc編碼的靶抗原的癌癥。癌癥可以是骨髓瘤或滑膜肉瘤。在某些方面，癌癥是ny-eso-1陽性癌癥，并且靶抗原是ny-eso-1。

在實施方案的一些方面，先前已從受試者中分離出工程化的apc。在另外的方面，所述方法另外包括向受試者施用抗原特異性免疫效應細胞群，所述免疫效應細胞對與在工程化的apc中表達的hla復合的靶抗原表位具有特異性。可能先前已從受試者中分離出來免疫效應細胞。在另外的方面，免疫效應細胞已被工程化來表達結合與在工程化的apc中表達的hla復合的靶抗原表位的t細胞受體(tcr)。在具體方面，tcr是αβtcr。在一些特定方面，目標抗原是ny-eso-1。在某些方面，tcr包含與抗-ny-eso-1-αβtcr(seqidno：28)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與其相同的序列。

在該實施方案的另外方面，免疫效應細胞表達結合與在工程化的apc中表達的hla復合的靶抗原結合的嵌合t細胞受體(car)。car可包含結合與在工程化的apc中表達的hla復合的靶抗原表位的抗體可變結構域。在一些具體方面，靶抗原是ny-eso-1。在另外的方面，car包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的序列。

在另外的實施方案中，提供了重組car多肽，其包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的序列。在另外的實施方案中，提供了包含與ny-eso-1r-cd28tm-cd137-zcar(seqidno：22)、ny-eso-1r-cd8a-cd28-zcar(seqidno：24)或ny-eso-1r-cd8a-cd137-zcar(seqidno：26)具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或與所述序列相同的car多肽的免疫效應細胞(例如，t細胞)。

在另外的方面，實施方案的方法另外包括富集表達抗原的工程化的apc的細胞群。在一些方面，富集包括熒光激活細胞分選(facs)。在具體方面，富集包括針對抗原表達的分選。

另外的實施方案提供了制備實施方案的工程化的apc的方法，所述方法包括獲得包含apc的細胞樣品并用包含編碼靶抗原的轉基因和編碼人白細胞抗原(hla)的轉基因的核酸轉染細胞，使得所述hla在apc的表面上表達，與靶抗原的表位復合以產生工程化的apc的群體。在某些方面，apc是t細胞或t細胞祖細胞。在另外的方面，所述方法另外包括在轉染前純化或富集樣品中的apc。在特定方面，t細胞或t細胞祖細胞來源于誘導的多能干細胞、胚胎干細胞或造血干細胞。在另外的方面，富集樣品中的t細胞包括收集單核細胞級分。在一些方面，細胞樣品可以來自受試者的臍帶血、淋巴器官或外周血樣品。在某些方面，細胞樣品可通過單采或靜脈穿刺獲得。在另外的方面，細胞樣品是t細胞的亞群。在一些具體方面，滅活轉基因car細胞以用于表達內源t細胞受體和/或內源hla。在特定方面，獲得細胞樣品包括從第三方獲得細胞。

在一些方面，apc的轉染包括將編碼轉基因的dna電穿孔至apc中以產生工程化的apc。在另外的方面，apc可使用病毒載體進行轉導。在一些方面，轉染可以涉及或可以不涉及用病毒感染或轉導細胞。在另外的方面，用編碼膜結合的cγ細胞因子的核酸另外轉染細胞。在某些方面，膜結合的cγ細胞因子可以是膜結合的il-7、il-15或il-21。在具體方面，膜結合的cγ細胞因子是il-15-il-15rα融合蛋白。

在另一方面，apc的轉染另外包括將轉座酶引入細胞，并且其中至少一個轉基因側接轉座子重復序列。在一些方面，轉座酶可以作為dna表達載體、mrna、多肽或可表達的rna來提供。在具體方面，轉座酶是鮭魚型tc1樣轉座酶(sb)。在另外的具體方面，轉座酶是sb11或sb100x轉座酶。

在實施方案的另外方面，生產工程化的apc的方法包括在促進apc增殖的培養基中離體培養工程化的apc細胞群的另外步驟。在一些方面，培養工程化的apc可包括在抗原特異性免疫效應細胞諸如t細胞存在的情況下培養細胞，所述細胞對與在apc中表達的hla復合的靶抗原的表位具有特異性。在某些方面，可從與apc相同的受試者獲得免疫效應細胞。在另外的方面，免疫效應細胞已被工程化來表達結合與在apc中表達的hla復合的靶抗原表位的t細胞受體(tcr)。在特定方面，tcr是αβtcr。在另外的方面，免疫效應細胞已被工程化來表達結合與在apc中表達的hla復合的靶抗原表位的嵌合抗原受體(car)。在一些方面，car可包含結合與在apc中表達的hla復合的靶抗原表位的抗體可變結構域。

在另外的方面，已測試了實施方案的工程化的apc的感染性材料，并且已確認其不含傳染性材料。在一些方面，在免疫效應細胞存在的情況下培養工程化的apc可包括在包含il-21和/或il-2的培養基中培養細胞。在另外的方面，在免疫效應細胞存在的情況下培養工程化的apc可能包括以約10∶1至約1∶10(免疫效應細胞對apc)的比例培養細胞。在某些方面，工程化的apc的培養不超過7天、14天、21天、28天、35天或42天。

在另外的實施方案中，提供了通過本文所述的任何實施方案的方法制備的工程化的apc群體。

在另外的實施方案中，提供了包含工程化的apc和/或抗原特異性免疫效應細胞的細胞組合物。細胞組合物可包含低達100或1,000個細胞。然而，在一些方面，細胞組合物包含至少約10⁴個、10⁵個、10⁶個、10⁷個、10⁸個、10⁹個、10¹⁰個、10¹¹個或更多工程化的apc和/或抗原特異性免疫效應細胞。在一個方面，細胞可具有基本上相同的遺傳物質。在一些方面，細胞可以是來源于單個受試者的人細胞，所述受試者可以是供體或患者。

在另外的實施方案中，提供了包含含有本實施方案的工程化的apc的細胞組合物和藥學上可接受的載體的藥物組合物。

在另外的實施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括施用有效量的包含工程化的apc的細胞群或包含工程化apc的藥物組合物。在一個方面，患者可以是人類患者。在某些方面，所述疾病可以是癌癥。在另外的方面，癌癥可以是血液癌癥或實體癌，諸如t細胞all、b-all、cml、結腸癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可以已經經歷了先前的抗癌療法。在一個方面，患者可處于緩解狀態。在另一個方面，患者可以沒有癌癥的癥狀，但包含可檢測的癌細胞。在另一個方面，所述疾病可以是病毒感染(例如，巨細胞病毒(cmv)、愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一個方面，所述疾病可以是細菌感染。在一個方面，所述疾病可以是敗血癥。

在一些另外的方面，包含工程化的apc的細胞組合物對于患者可以是同種異體的。在各個方面，同種異體細胞組合物可以與或可以不與患者共享hla。在另一個方面，包含工程化的apc的細胞組合物對于患者可以是自體的。

在另外的實施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括產生包含本實施方案的工程化的apc的細胞組合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述細胞組合物。

在一些方面，提供了用于治療具有醫學病況的個體的方法，所述方法包括提供有效量的實施方案的工程化的apc的步驟，包括在一些方面中不止一次地提供，諸如間隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在另外的實施方案中，本文提供了在用于治療目的的基因修飾之后鑒定和選擇高能免疫效應細胞(例如，car+t細胞)的方法。因此，在一個實施方案中，提供了用于選擇具有線粒體備用呼吸容量的經car修飾的免疫效應細胞的方法。在一些方面，該方法包括檢測線粒體報告基因的表達水平，并選擇線粒體報告基因表達水平升高的免疫效應細胞，從而選擇具有線粒體備用呼吸容量的免疫效應物。在一些方面，免疫效應細胞可以是人細胞，例如car-修飾的人t細胞。

在一些方面，根據實施方案使用的線粒體報告基因可以是內源基因。在一些方面，線粒體報告基因可以是外源基因，例如編碼熒光報告蛋白的基因。在一些方面，熒光報告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，用于選擇具有src的免疫效應細胞的方法可以包括流式細胞術或facs。

在某些方面，用src鑒定免疫效應細胞的報告基因的表達可處于核啟動子(例如hef1a)的控制下。在某些方面，報告基因的表達可處于線粒體啟動子的控制之下。在某些方面，表達的報告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，表達的報告蛋白可被引導至細胞表面。在某些方面，報告基因的表達可處于線粒體啟動子的控制之下，并且所表達的報告蛋白被引導至細胞表面。在一些方面，外源報告基因可側接轉座子重復或病毒ltr。在一些方面，外源報告基因可包含在染色體外核酸如mrna或附加型載體中。

在一些方面，可將選擇用于src(例如，經car-修飾的t細胞)的免疫效應細胞離體擴增一段時間，其在一些方面可包括用飼養細胞(諸如含有car配體或結合car的抗體(例如2d3scfv)的活化和繁殖細胞(aapc))培養細胞。在一個方面，aapc可以是轉基因k562細胞。在一個方面，aapc可表達cd137l。在其它方面，aapc還可表達cd19、cd64、cd86或mil15。在某些方面，aapc可表達至少一種抗cd3抗體克隆，諸如，例如okt3和/或ucht1。在一個方面，可滅活(例如輻照)aapc。在一個方面，可能已測試了aapc的感染性物質，并且已確認其不含感染性物質。制備此類aapc的方法是本領域已知的。在一個方面，用aapc培養經car-修飾的t細胞群可包括以約10∶1至約1∶10的、約3∶1至約1∶5、約1∶1至約1∶3(t細胞對aapc)或可從其中導出的任何范圍的比例培養細胞。例如，t細胞和aapc的共培養物可以是約1∶1、約1∶2或約1∶3的比例。在一個方面，培養步驟還可包括利用氨基二膦酸(例如，唑來膦酸)的培養。

在另外的實施方案中，為免疫效應細胞群(例如，經car-修飾的t細胞)提供線粒體備用呼吸容量和藥學上可接受的載體。可以根據本實施例的方法來選擇細胞群。在一些方面，細胞可以是治療上可行的。在一些方面，細胞群可包含至少10個、1x10²個、1x10³個、1x10⁴個、1x10⁵個或1x10⁶個或可從其中導出的任何數目的細胞。在各個方面，細胞可以是nk細胞、天然殺傷t細胞、αβt細胞或γδt細胞。在一個方面，免疫效應細胞可具有基本相同的遺傳物質。在一些方面，免疫效應細胞可以是經car修飾的人t細胞。在一些方面，細胞可以來源于可以是供體或患者的單個受試者。

在另外的實施方案中，提供了治療有此需要的患者的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的具有線粒體備用呼吸容量或就線粒體備用呼吸容量選擇的免疫效應細胞(例如，經car修飾的t細胞)群。在一些方面，所述方法可包括向患者施用約100個至約1×10⁶個細胞或可從其衍生的任何數目的細胞。在某些方面，患者可以是人患者。在某些方面，具有src的免疫效應細胞群對于患者可以同種異體的。在各個方面，同種異體細胞組合物可以與或可以不與患者共享hla。在某些方面，具有src的免疫效應細胞群對患者可以是自體的。在各個方面，所述方法還可包括向患者施用第二療法。

在一些方面，用具有src或就src選擇的免疫效應細胞治療的疾病可以是癌癥。在某些方面，癌癥可以是血液癌癥或實體癌，諸如t細胞all、b-all、cml、結腸癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、腦腫瘤或胰腺癌。在一些方面，患者可以已經歷了先前的抗癌治療。在一個方面，患者可處于緩解狀態。在另一個方面，患者可以沒有癌癥的癥狀，但包含可檢測的癌細胞。在另一個方面，利用具有src的免疫效應細胞治療的疾病可以是病毒感染(例如，巨細胞病毒(cmv)、愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)或人免疫缺陷病毒(hiv))。在另一方面，所述疾病可以是細菌感染。在一個方面，所述疾病可以是敗血癥。

在一個實施方案中，提供了治療患者疾病的方法，所述方法包括根據實施方案產生包含具有src的免疫效應細胞的細胞組合物，并向有此需要的患者施用有效量的所述細胞組合物。在一些方面，提供了用于治療患有醫學病況的個體的方法，所述方法包括提供有效量的具有src的免疫效應細胞的步驟，在一些方面包括不止一次，諸如間隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

在一個實施方案中，提供了包含本實施方案的細胞群的組合物，用于治療患者的疾病。

可對本文所述的任何其它方法或組合物使用在實施方案的方法和/或組合物的上下文中討論的實施方案。因此，關于一種方法或組合物的實施方案也可應用于實施方案的其它方法和組合物。

根據以下詳細描述，實施方案的其它目的、特征和優點將變得顯而易見。然而，應當理解，詳細描述和具體實例僅通過說明的方式給出，因為根據該詳細描述，實施方案的精神和范圍內的各種改變和修改對于本領域技術人員將變得顯而易見。

附圖簡述

圖1：靶向cd19受體的嵌合抗原受體的示例示意圖。car構建體(cd19rcd28)包含cd19結合結構域(vl/vh)、鉸鏈結構域(igg4-fc)、跨膜結構域(cd28tm)和細胞內信號傳導結構域(cd28-cd3ζ)。

圖2a-b：a，圖顯示通過流式細胞術獲得的散點圖，該散點圖顯示在電穿孔后1天和與k562aapc共培養28天后cd19rcd28car在t細胞上的表達。b，圖是通過流式細胞術獲得的散點圖，該散點圖顯示cd19rcd28cart細胞的fc受體(cd32(fcγr2a)、cd64(fcγr1a))的體外結合。

圖3a-b：因fcr結合引起的有限的體內持久性可降低功效。用hrluc⁺nalm6腫瘤注射nsg小鼠，然后單次注射cd19rcd28t細胞(或對照注射)。a，隨著時間的推移通過成像測量與腫瘤相關的生物發光。b，圖表顯示基于測量發光水平的處理或對照動物隨時間推移的腫瘤負荷。

圖4a-h：所述圖顯示了構建和測試的各種car的示意圖。還提供了所選car結構域的序列。對于人igg4鉸鏈區，將鉸鏈從氨基酸cpsc(如seqidno：9所示的全長序列)突變為cppc(如seqidno：10所示的全長序列)，以增強二聚化igg4重鏈的穩定性。人igg4fc(具有氨基酸變化l235e和n297q的eq突變體)是如seqidno：1所示的。人cd8a鏈鉸鏈和跨膜結構域以seqidno：3提供。將來自人igg4fc的12個氨基酸的間隔子從氨基酸cpsc(如seqidno：18所示的)突變成cppc(如seqidno：2所示的)以增強二聚化igg4重鏈(如seqidno：2所示的)的穩定性。對于人cd28跨膜胞質結構域，將人cd28跨膜和胞內結構域從rllh(如seqidno：11所示的全長序列)修飾為rggh(如seqidno：12所示的全長序列)，以改善car的表達。對于人cd28胞質結構域，將人cd28胞內結構域從rllh(如seqidno：16所示的全長序列)修飾為rggh(如seqidno：17所示的全長序列)以改善car的表達。

圖5：該圖顯示通過流式細胞術獲得的散點圖，該散點圖顯示在電穿孔后1天和在與k562aapc共培養28天后，car的各種car在t細胞上的表達。

圖6：該圖顯示通過流式細胞術獲得的散點圖，該散點圖顯示cd19r*cd28cart細胞對fc受體(cd32(fcγr2a)、cd64(fcγr1a))的體外結合減少。

圖7：該圖顯示描繪了在與k562aapc共培養的28天中各種cart細胞的擴增動力學的圖。

圖8：該圖顯示描繪各種cart細胞相對于cd19el-4和nalm-6靶細胞顯示的cd19特異性細胞毒性的圖。

圖9：該圖顯示當與不同靶細胞接觸時，各種cart細胞的cd19特異性ifn-γ產生的圖表。

圖10：該圖顯示用腫瘤(hrluc+nalm-6)注射(i.v.)，然后在第二天用ffluc+car+t細胞注射(i.c.)的nsg小鼠的發光成像。在使用xenogenivis100系列系統分別注射enduren或熒光素后，進行腫瘤和t細胞成像。在確認心內注射(頂行)后立即進行t細胞成像。顯示了表示來自腫瘤產生的hrluc活性隨時間的光子通量的陰影圖像。

圖11：改善car+t細胞控制疾病的體內功效。該圖顯示表示基于圖10中的生物發光測量的腫瘤負荷的圖。如上所述，用hrluc+nalm-6腫瘤注射nsg小鼠，然后單次注射cart細胞。隨著時間的推移測量腫瘤相關生物發光，并顯示所述生物發光。(*)表示相對于僅腫瘤組的至少p＜0.05的顯著性。

圖12：該圖顯示描繪用各種cart細胞處理的nsg小鼠的存活曲線的圖。當與僅腫瘤(無處理)組相比時，計算出顯著性(p值)。

圖13a-d：car⁺t細胞的表征。用cd19r*cd28或cd19rcd8cd28轉座子和sb11轉座酶對pbmc進行電穿孔，并在7天刺激周期中，將其在經輻照的k562抗原呈遞細胞上與il-2和il-21一起共培養28天。在每個刺激周期結束時，對細胞進行計數和表型分型(cd3，car)。(a)在電穿孔后當天(第1天)和共培養28天后，car在cd3⁺t細胞上的表達。(b)顯示擴增動力學的cd3和car+t細胞的推定細胞計數。(c)使用針對cd19^pos靶標(cd19⁺el-4、nalm-6、daudiβ2m)的標準鉻釋放測定法測量cd19特異性細胞毒性。背景裂解通過cd19^negel-4的裂解來描繪。(d)當用表達cd19的各種效應物靶刺激時，car⁺t細胞的ifn-γ的細胞內產生。

圖14a-d：car⁺t細胞對nsg(nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj，nodscidγ)小鼠中的cd19⁺nalm-6細胞系的體內功效。(a-b)在最小殘留疾病模型中，在第0天向nsg小鼠(n＝5/組)注射10⁴個hrluc⁺mkate⁺nalm-6細胞，然后在第1天心內注射t細胞(10⁷/小鼠)。隨時間推移使用enduren活細胞基質，通過源自hrluc⁺nalm-6產的生物發光成像評估腫瘤負荷。(c-d)對于已建立的腫瘤模型，在第0天向nsg小鼠(n＝6/組)注射1.5x10⁴個ffluc⁺egfp⁺nalm-6，并將腫瘤移植5天，評價腫瘤負荷，并在第6天心內注射t細胞(10⁷/小鼠)。隨著時間的推移，使用d-熒光素底物從ffluc⁺nalm-6進行生物發光成像來計算腫瘤通量。顯示了表示光子通量和腫瘤通量隨時間變化的偽彩圖像。

圖15：該圖顯示cart細胞的另外的信號傳導分子。上圖顯示膜結合的il-15/il-15受體(mil15)構建體(構建體的多肽序列如seqidno：4所示)。下圖是由膜結合的il-15/il-15受體(左圖)和car構建體(右圖)提供的信號傳導的示意圖。

圖16：mil15和car的穩定共表達。左上圖顯示了電穿孔后24小時或刺激4(stim4)的mil15+car+t細胞的代表性流動圖(flowplot)。左下圖是顯示表達car或car和mil15的電穿孔細胞的百分比的圖。右上圖，圖顯示抗原撤出后培養中的cart細胞數的變化。在無il-15，添加il-15復合物或利用共表達mil-15和car的細胞的情況下完成研究。右下圖顯示表達mil-15的cart細胞中各種轉錄調節子的表達水平的圖。

圖17a-b：a，該圖顯示用只表達car或表達與mil-15組合的car的ffluc+t細胞注射的小鼠的發光成像。在使用xenogenivis100系列系統分別注射熒光素后進行t細胞成像。陰影圖像表示隨著時間推移來自ffluc+t細胞活性的光子通量。b，左圖，圖顯示在抗原存在的情況下或抗原撤出(wd)后培養mil-15-cart細胞中的因子的表達水平。右圖板顯示在刺激和不刺激的情況下cart細胞和mil-15-cart細胞的直方圖。

圖18：cart細胞對腫瘤生長的體內控制。該圖顯示用hrluc+腫瘤細胞注射的小鼠的發光成像(上圖)和定量(下圖，圖)。如所指示的，某些小鼠還注射了表達car或car和mil-15的t細胞。

圖19：舉例說明用作抗原呈遞細胞的t細胞(t-apc)的示意圖。t細胞自體移植后，以及通過直接和交叉引發改善內源性長期免疫。

圖20：用于遺傳修飾人t細胞以表達腫瘤抗原ny-eso-1的睡美人質粒的圖示。組成型表達由hef1-α啟動子驅動，通過在0.2mg/ml潮霉素下繁殖t細胞來實現選擇。

圖21：用作aapc的k562上的t細胞共刺激分子的表。

圖22：在電轉染共表達flag標記的ny-eso-1和hytk的sb質粒后，在okt3-aapc上共培養的第28天進行的人t-apc的流式細胞術。

圖23：在ny-eso-1⁺t-apc(上)對比k562aapc(下)上擴增的pbmc。

圖24：在ny-eso-1⁺t-apc對比k562aapc上擴增的ny-eso-1⁺cart細胞。

圖25：3次刺激后ny-eso-1⁺t-apc上的抑制分子。

圖26：在aapc存在的情況下繁殖的ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc。

圖27：t-apc擴增。t-apc能夠成功地擴增cart細胞以及源自陽性對照k562的aapc。

圖28：顯示ny-eso-1特異性tcr⁺和car⁺t細胞殺死ny-eso-1⁺u266人多發性骨髓瘤細胞系的鉻釋放測定。在來源于k562的人工活化和繁殖細胞(aapc)上擴增t細胞，所述t細胞表達hla-a02和ny-eso-1⁺。數據表示兩個獨立實驗，其中繁殖9-2-15的ny-eso-1特異性cart細胞，用hla-a2/ny-eso-1t-apc刺激3次，并且用衍生的aapck562刺激2次。9-2-15car含有cd8α莖，而先前的9-2-15car含有igg4莖。

圖29a-29b：圖29a.在經輻照的k562aapc存在的情況下，與對照t細胞一起離體生長的基因修飾的t細胞的tem(透射電子顯微術)圖像。與在相似條件下激活的未修飾的對照細胞(左圖)相比，在經car修飾的細胞(右圖)中看到線粒體數量的增加。圖29b.顯示與在第35天培養中繁殖的經car修飾的t細胞中的線粒體的縮合狀態相比的未修飾的對照t細胞中的線粒體規則正統結構的透射電子顯微術(tem)圖像(比例尺500nm，50,000倍放大)。

圖30：在未共同刺激的情況下的her1-3雙特異性car-t細胞的離體擴增。細胞是未修飾的或用cd28和/或cd137t細胞信號傳導胞內結構域修飾的car。當在培養中不提供共刺激時，相對于含有cd28信號傳導結構域的cart細胞，具有cd137t細胞信號傳導胞內結構域的細胞在培養中存活得更好。用于未經修飾的對照細胞的okt3刺激作用更好可能是因為通過cd3z誘導的較高的信號傳導強度。顯示了在k562aapc存在的情況下離體繁殖的靶向腫瘤抗原her1-3的car-t細胞的tem圖像。還測試了其它腫瘤抗原靶向的car諸如ror1、cd123和c19的該tem圖像。通過nexcelom，使用臺盼藍活/死亡排除法計算有活力的絕對t細胞數。

圖31：熒光蛋白報告基因的sb質粒構建體。grx2是源自glrx2(pubmedid#np_932066.1)的線粒體定位序列。nls是核定位序列(pubmedid#nm_017921)。

圖32：經car修飾的細胞中的eyfp內源性表達的流式細胞術分析。在培養的第35天在無共刺激的情況下生長的cd137-cart細胞中出現具有高eyfp的car+t細胞。cd28-t細胞顯示較少或更暗的eyfp陽性t細胞。流式細胞術基于fc染色(針對car表達)和內源性eyfp(針對線粒體強度)。

圖33a-33b：在無t細胞共刺激的情況下利用經輻照的飼養細胞(k562aapc)擴增的her1-3雙特異性car-t細胞的線粒體生物量。圖33a.顯示線粒體在未修飾的t細胞和經修飾以表達靶向her1-her3(由cd28-cd3z或cd137-cd3zt細胞信號傳導結構域組成)的原型car的t細胞中的分布的透射電子顯微術(tem)圖像(比例尺500nm，15,000倍放大)。圖33b.每個細胞的平均線粒體數量在條形圖中表示。與含有cd28信號傳導結構域的car-t細胞相比，總體上具有cd137t細胞信號傳導結構域的car-t細胞在第21天培養后顯示出生物量的增加。

圖34：高能t細胞(et)的體外細胞毒性。發現就高線粒體質量分選的高能t細胞保留了細胞毒性能力，如通過對腫瘤抗原陽性乳腺癌細胞的特異性殺傷所證明的。數據來自對cr標記的her1-3⁺t細胞(針對對于特定抗原呈陽性的乳腺腫瘤細胞系的)的進行的鉻釋放測定，所述cr標記的her1-3⁺t細胞被具有高eyfp/線粒體強度的cart細胞裂解。

圖35：在最小活化和完全不存在共刺激的情況下，在經輻照的飼養細胞(k562aapc)存在的情況下離體擴增的未修飾的和經car修飾的t細胞的熒光顯微術圖像。含有cd137t細胞信號傳導胞內結構域的car-t細胞顯示較高的線粒體質量分布，如從報告蛋白(eyfp-grx2)內源性發出的熒光信號強度觀察到的。與含有cd28信號傳導結構域的car-t細胞相比，含有cd137t細胞信號傳導胞內結構域的car-t細胞中的代謝活性t細胞數量明顯更高。這是一致的，不論供體或car的類型。

圖36：在經輻射的飼養細胞(k562aapc)存在的情況下生長的離體擴增的經car-修飾的t細胞中的線粒體分布模式。

圖37a-37b：熒光顯微術圖像的綜合形態測量分析顯示基于代表特定信號傳導胞內結構域的基因修飾的t細胞(her1-her3cd137-cd3zt細胞)組內的線粒體強度的經car-修飾的t細胞的異質群體。圖37a.her1-3cd137car⁺t細胞中的eyfp-mito的群體變異。圖37b.her1-3cd137car⁺t細胞中的eyfp-mito的平均強度。

圖38：在通用k562-aapc上生長的car+t細胞的透射電子顯微術(tem)圖像。圖像來自實施例8中所述的研究的第14天。

圖39：ror1-cart細胞在通用k562-aapc上的生長動力學。含有cd28信號傳導的car-t細胞迅速進行凋亡(左圖)，而含有cd137z信號傳導的car-t細胞持續時間更長(右圖)。

詳述

臨床試驗已證明了在已經接受遺傳修飾的t細胞的患者中的抗腫瘤作用。例如，已顯示car-t細胞療法在患有晚期b細胞惡性腫瘤的人類患者中表現出有意義的緩解(maude等，2014)。car-t細胞具有尋求和破壞體內腫瘤細胞所必需的特異性和細胞毒性能力，并且可持續足夠長的時間來阻止復發。最近在幾個于i期臨床試驗中接受治療的患者中，已經顯示了連續殺傷(一個t細胞殺死多個腫瘤細胞而不發生無反應性)的該經典情況(corrigan-curay等，2014)。然而，在car設計、cart細胞胞內結構域、間隔長度用法、scfv的親和力等方面尚未出現統一而明確的臨床相關結果(jena等，2014)。這再次因通過car-t細胞輸注尋求治療的患者群體中的可變腫瘤負荷和腫瘤類型而復雜化。設計治療上有效的car構建體和最終基因修飾的t細胞群的主要挑戰是，這將在腫瘤類型、腫瘤分期和患者群體的整個范圍上減輕臨床相關結果(無顯著毒性)。

本文詳述的研究鑒定了在cart細胞持久性中起作用的關鍵元件，其可影響t細胞的功效和潛在毒性(例如，來自脫靶細胞毒性活性)。具體地，顯示了car多肽被fc受體結合的能力調節t細胞的持久性和抗腫瘤功效。因此，可通過改變在t細胞上表達的car多肽的fc受體結合性質來改變cart細胞功效(和體內持久性)。例如，可將fc受體結合序列(諸如來自人免疫球蛋白恒定區)包含在car中以減少t細胞的持續性并控制t細胞的潛在毒性。相反，可以修飾car多肽以除去fc受體結合元件以增加cart細胞的體內持久性并增強其功效。因此，本文詳述的car多肽、cart細胞和方法允許cart細胞持久性的微調(通過調節fc受體結合)以控制cart細胞療法的功效和毒性。

在另外的實施方案中，提供了包含編碼靶抗原的轉基因和編碼人白細胞抗原(hla)的轉基因的工程化的抗原呈遞細胞(apc)。在一些方面，工程化的apc可另外包含編碼共刺激因子(諸如il-15)的一種或多種轉基因。此類工程化的apc可用于例如用于擴增t細胞(諸如，cart細胞)的離體方法，或可被施用于受試者以在體內刺激抗原特異性t細胞的生長。因此，本文提供的細胞可用于刺激抗原特異性t細胞的生長以用于治療疾病(例如，癌癥)。

本文公開的其它實施方案提供具有src或針對src選擇的免疫效應細胞，其可以提供增強的治療性質。具有高線粒體生物量的細胞在本文中例如被稱為“能量t細胞”或“et細胞”。由于基因修飾的免疫效應細胞的增加的持久性與改善的治療潛力正相關，因此預計免疫細胞諸如能量t細胞表現優于大量基因修飾的t細胞。另外，如果可基于線粒體強度(即備用呼吸容量或src)在輸注前鑒定長期存活的car-t細胞，則可利用多種變量對car設計，從而對car功能的影響。因此，線粒體強度可有助于選擇/分選最佳的連續t細胞殺傷劑而不論car胞內結構域的使用、car構建體的設計、間隔子的長度和scfv的親和力，從而減少翻譯障礙，以優化適合于特定的腫瘤抗原和腫瘤類型的car設計。在多種情況下，在輸注前挑取最好的t細胞(例如，在腫瘤微環境中具有最大存活潛力的那些細胞)可以是有利的。因此，提供了使用報告熒光蛋白(例如，eyfp-grx2)測量car+t細胞的“適合性”的方法，所述報告熒光蛋白是可定量的并與線粒體src相關，其轉而指示遺傳修飾的t細胞在缺氧、無特定營養物用于糖酵解的不利條件下存活的代謝能力，和由高負荷腫瘤抗原引起的活化誘導的細胞死亡。

此外，選擇更少，更具效力的car+t細胞用于輸注可有助于減少或甚至消除輸注后的t細胞相關毒性。限制輸注所需的細胞數量將減輕生長大量難以生長的患者來源的自體t細胞(以用于遺傳修飾)的負擔。例如，在過繼性細胞療法的方法中，使用少量的免疫效應細胞(諸如t細胞)引發高抗腫瘤殺傷可以是非常希望的。使用少量的t細胞可使從經car-修飾的t細胞輸注產生的輸注相關毒性降至最低。此外，如果輸注的細胞在體內存活時間更長，從而可防止腫瘤復發，則這可以是優選的。在這兩種情況下，鑒定、選擇和輸注高能car修飾的t細胞的現有方法將是有益的。

在任何特定批次的經car修飾的t細胞中線粒體分布以及src之間存在異質性。因此，如果仔細選擇，與大量群體相比，較少的細胞可在體內實現相似的結果。這對于腫瘤是有幫助的，在所述腫瘤中(i)car不能區分正常抗原與腫瘤相關抗原，因此較少細胞的輸注是希望的，(ii)由于原始細胞群中固有的畸形，患者來源的自體t細胞的擴增是困難的，(iii)輸注后經car修飾的t細胞在體內的有限持久性是希望的。測定src/線粒體強度的方法可基于使用mito-tracker染料(invitrogen)標記細胞，或其中取回細胞以用于臨床應用是不可能的類似的修飾后方法。測定線粒體強度的其他方法(諸如測量氧氣消耗或細胞外酸化)測量大量細胞的強度而非單個細胞的強度，其也缺乏臨床應用。如本文所提供的，可使用非病毒dna電穿孔法來同時修飾效應細胞(諸如t細胞)以用于car表達和src鑒定。具體地，為了選擇et細胞，可通過睡美人介導的轉座(一種已經適應于臨床翻譯的基于非病毒dna的基因遞送系統)來實現熒光線粒體指導的報告蛋白與car分子一起在細胞中表達。在基因修飾和基于配體刺激的k562的共培養后，et細胞的基于流式細胞術的分選可以在gmp條件下進行，適于翻譯，并且可容易地適應于在診所中使用。總之，可通過將臨床相關方法組合以遺傳修飾t細胞來產生可遞送期望的抗腫瘤功效的代謝活性t細胞(et細胞)，使用具有最少的活化的基于輻照的k562的共培養將其擴增至大量，并基于熒光報告蛋白的表達來鑒定其。

i.定義

如本文中所用，“一個/種(a)”或“一個/種(an)”可指一個/種或多個/種。如在權利要求中所用，當與單詞“包含”一起使用時，單詞“一個/種(a)”或“一個/種(an)”可指一個/種或不止一個/種。

除非明確地指示僅指替代方案，或者替代方案是相互排斥的，否則在權利要求中使用術語“或”用于表示“和/或”，盡管本公開支持僅指替代方案和“和/或”的定義。如本文中所用，“另一”可表示至少第二或更多。

在整個本申請中，術語“約”用于表示值包括用于測定值的裝置、方法的固有誤差變化或存在于研究對象之間的變化。

如本文中所用，術語“抗原”是能夠被抗體或t細胞受體結合的分子。抗原另外地能夠誘導體液免疫應答和/或細胞免疫應答，從而導致b和/或t淋巴細胞產生。

如本文中所用，術語“抗腫瘤有效量”是指在受試者中減少癌細胞或腫瘤生長或減小腫瘤體積或腫瘤細胞數目的表達car的免疫效應細胞的有效量。“抗腫瘤有效量”還可增加預期壽命或減輕與腫瘤或癌癥相關的生理作用的表達car的免疫效應細胞的有效量。

ii.嵌合抗原受體和組分

嵌合抗原受體分子是重組融合蛋白，特征在于它們通過其細胞質尾部中存在的免疫受體激活基序(itam)結合抗原(例如，her1/her3)和轉導激活信號的能力。利用抗原結合部分(例如，由單鏈抗體(scfv)產生的)的受體構建體提供了為“通用的”的另外有利方面，因為它們以不依賴于hla的方式結合靶細胞表面上的天然抗原。

根據實施方案的嵌合抗原受體可通過本領域已知的任何方法產生，盡管優選使用重組dna技術來產生。編碼嵌合抗原受體的幾個區域的核酸序列可通過分子克隆的標準技術(基因組文庫篩選、pcr、引物輔助連接、來自酵母和細菌的scfv文庫、定向誘變等)來制備和組裝成完整編碼序列。可將所得的編碼區插入表達載體中并用于轉化合適的表達宿主(同種異體或自體免疫效應細胞)。

本文所述的car的實施方案包括編碼抗原特異性嵌合抗原受體(car)多肽的核酸，包括包含細胞內信號傳導結構域、跨膜結構域和包含一個或多個信號傳導基序的細胞外結構域的核酸。在某些實施方案中，car可識別由一個或多個抗原之間的共享空間組成的表位。在一些實施方案中，嵌合抗原受體包含：a)細胞內信號傳導結構域，b)跨膜結構域，和c)包含抗原結合結構域的細胞外結構域。任選地，car可包含位于跨膜結構域與抗原結合結構域之間的鉸鏈結構域。在某些方面，實施方案的car還包含將car的表達引導至細胞表面的信號肽。例如，在一些方面，car可包含來自gm-csf的信號肽(參見例如，seqidno：5)。

在某些實施方案中，當存在少量腫瘤相關抗原時，還可將car與膜結合的細胞因子共表達以改善持久性。例如，可將car與膜結合的il-15共表達。

取決于car的結構域和所述結構域中使用的特異性序列的排列，表達car的免疫效應細胞可具有不同水平的針對靶細胞的活性。在一些方面，可將不同的car序列引入免疫效應細胞以產生轉基因細胞，針對升高的src選擇轉基因細胞，以及已測試所選擇的細胞的活性，以鑒定經預測具有最大治療功效的car結構的活性。

a.抗原結合域

在某些實施方案中，抗原結合結構域可包含單克隆抗體的互補決定區、單克隆抗體的可變區和/或其抗原結合片段。在另一個實施方案中，該特異性來源于與受體結合的肽(例如，細胞因子)。“互補決定區(cdr)”是在抗原受體(例如，免疫球蛋白和t細胞受體)蛋白的可變結構域中發現的短氨基酸序列，其與抗原互補，因此為受體提供其針對該特定抗原的特異性。抗原受體的每條多肽鏈含有3個cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。由于抗原受體通常由兩條多肽鏈組成，所以每個抗原受體有6個cdr可以與抗原接觸--每條重鏈和輕鏈含有3個cdr。由于在cdr中發現大多數與免疫球蛋白和t細胞受體相關的序列變異，因此這些區域有時被稱為高變區。在這些可高變區中，cdr3顯示出最大的變異性，因為其是通過vj(在重鏈和tcrαβ鏈的情況下為vdj)的重組而編碼的。

預期car核酸，特別是scfv序列是增強人患者的細胞免疫療法的人基因。在一個具體實施方案中，提供了全長carcdna或編碼區。抗原結合區或結構域可包含來源于特定小鼠或人或人源化單克隆抗體的單鏈可變片段(scfv)的vh和vl鏈的片段。該片段還可以是任何數目的抗原特異性抗體的不同抗原結合結構域。在更具體的實施方案中，該片段是由針對用于人細胞中表達的人密碼子選擇而優化的序列編碼的抗原特異性scfv。在某些方面，car的vh和vl結構域通過接頭序列(諸如whitlow接頭)分離(參見例如，seqidno：20)。還在國際(pct)專利公布第wo/2015/123642號(通過引用并入本文)中提供了可根據實施方案修飾或使用的car構建體。

在一些具體實例中，car的抗原結合結構域特異性結合her2/neu(stancovski等，1993)、erbb2(moritz等，1994)、葉酸結合蛋白(hwu等，1995)、腎細胞癌(weitjens等，1996)和hiv-1包膜糖蛋白gp120和gp41(roberts等，1994)。可被car結合的其它細胞表面靶抗原包括但不限于cd20、癌胚抗原、間皮素、ror1、c-met、cd56、gd2、gd3、α甲胎蛋白、cd23、cd30、cd123、il-11rα、κ鏈、λ鏈、cd70、ca-125、muc-1、egfr和變體、上皮腫瘤抗原等。

在嵌合抗原受體的某些實施方案中，受體的抗原特異性部分(其可被稱為包含抗原結合區的細胞外結構域)包含如上文詳述的her1/her3結合結構域。在一些方面，例如，her1/her3結合結構域包含美國專利公布第2012/0121596號(通過引用并入本文)中提供的序列之一。

b.鉸鏈結構域

在某些方面，實施方案的car多肽可包括位于抗原結合結構域與跨膜結構域之間的鉸鏈結構域。在一些情況下，可將鉸鏈結構域包含在car多肽中以在抗原結合結構域與細胞表面之間提供足夠的距離，或緩解可不利地影響car-基因修飾的t細胞的抗原結合或效應子功能的可能的空間位阻。

在一些情況下，car鉸鏈結構域可來源于人免疫球蛋白(ig)恒定區或其部分(包括ig鉸鏈)，或來源于人cd8α跨膜結構域和cd8a鉸鏈區。在一個方面，car鉸鏈結構域可包含抗體同種型igg4的鉸鏈-ch2-ch3區。在一些方面，可在抗體重鏈ch2結構域中引入點突變以減少car-t細胞或任何其它經car修飾的細胞的糖基化和非特異性fcγ受體結合。

在某些方面，實施方案的car鉸鏈結構域包含igfc結構域，其相對于野生型igfc結構域包含至少一個突變，所述突變減少fc-受體結合。例如，car鉸鏈結構域可包含相對于野生型igg4-fc結構域包含至少一個突變的igg4-fc結構域，所述突變減少fc-受體結合。在一些方面，car鉸鏈結構域包含相對于野生型igg4-fc序列在對應于l235和/或n297的位置處具有突變(諸如氨基酸缺失或取代)的igg4-fc結構域。例如，car鉸鏈結構域可包含相對于野生型igg4-fc序列具有l235e和/或n297q突變的igg4-fc結構域。在另外的方面，car鉸鏈結構域可包含的igg4-fc結構域，所述的igg4-fc結構域在位置l235處具有針對氨基酸的親水性的(諸如r、h、k、d、e、s、t、n或q)或與“e”具有相似性質的(諸如d)的氨基酸取代。在某些方面，car鉸鏈結構域可包含在n297位置處具有針對氨基酸的與“q”具有相似性質的(諸如s或t)的氨基酸取代的igg4-fc結構域。在另外的方面，car鉸鏈結構域相對于野生型igg4-fc序列在對應于l235和/或n297的位置處包含突變，并與seqidno：1或seqidno：10具有約90％同一性。

在某些特定方面，鉸鏈結構域包含與seqidno：1或seqidno：10的igg4-fc結構域、seqidno：20的cd8α細胞外結構域或seqidno：3的合成鉸鏈序列具有約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

c.跨膜結構域

抗原特異性細胞外結構域和細胞內信號轉導域可通過跨膜結構域連接。可用作跨膜結構域的一部分的多肽序列包括但不限于人cd4跨膜結構域、人cd28跨膜結構域、跨膜人cd3ζ結構域或半胱氨酸突變的人cd3ζ結構域或來自其它人跨膜信號傳導蛋白(諸如cd16和cd8以及促紅細胞生成素受體)的其它跨膜結構域。在一些方面，例如，跨膜結構域包含美國專利公布第2014/0274909號或美國專利第8,906,682號(均通過引用并入本文)中提供的序列之一。在某些具體方面，跨膜結構域可與seqidno：19的cd8α跨膜結構域或seqidno：12的cd28跨膜結構域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

d.細胞內信號傳導結構域

實施方案的嵌合抗原受體的細胞內信號傳導結構域負責激活經工程化以表達嵌合抗原受體的免疫細胞的至少一種正常效應子功能。術語“效應子功能”是指分化細胞的特化功能。例如，t細胞的效應可以是溶細胞活性或輔助細胞活性，包括細胞因子的分泌。初始t細胞、記憶或記憶型t細胞中的效應子功能包括抗原依賴性增殖。因此，術語“細胞內信號傳導結構域”是指轉導效應子功能信號并引導細胞進行特化功能的蛋白質的部分。在一些方面，細胞內信號傳導結構域來源于天然受體的細胞內信號傳導結構域。此類天然受體的實例包括t細胞受體的ζ鏈或任何其同源物(例如，η、δ、γ或ε)、mb1鏈、b29、fcriii、fcri和信號傳導分子的組合，諸如cd3ζ和cd28、cd27、4-1bb、dap-10、ox40及其組合，以及其它類似的分子和片段。可使用活化蛋白家族的其它成員的細胞內信號傳導部分，諸如fcγriii和fcεri。關于使用這些替代跨膜和細胞內結構域的t細胞受體的公開內容，參見gross等(1992)，stancovski等(1993)，moritz等(1994)，hwu等(1995)，weijtens等(1996)和hekele等(1996)。雖然通常將使用完整的細胞內信號傳導結構域，但在許多情況下，不必使用完整的細胞內多肽。在細胞內信號傳導結構域的截短部分可被使用的程度上，只要其仍然轉導效應子功能信號，就可使用此類截短部分替代完整鏈。因此，術語“細胞內信號傳導結構域”意欲包括在car與靶標結合時足以轉導效應子功能信號的細胞內信號傳導結構域的截短部分。在一個優選實施方案中，人cd3ζ細胞內結構域用作用于實施方案的car的細胞內信號傳導結構域。

在具體實施方案中，car中的細胞內受體信號傳導結構域例如包括t細胞抗原受體復合物的那些結構域(諸如cd3的ζ鏈)，還有單獨的或與cd3ζ串聯的fcγriii共刺激信號傳導結構域、cd28、cd27、dap10、cd137、ox40、cd2。在具體實施方案中，所述細胞內結構域(其可被稱為細胞質結構域)包含tcrζ鏈、cd28、cd27、ox40/cd134、4-1bb/cd137、fcεriγ、icos/cd278、il-2rβ/cd122、il-2rα/cd132、dap10、dap12和cd40的一種或多種的部分或全部。在一些實施方案中，可在細胞內結構域中使用內源t細胞受體復合物的任何部分。可使用一個或多個細胞質結構域，因為例如所謂的第三代car具有融合在一起以獲得累加或協同作用的至少兩個或三個信號傳導結構域。

在一些實施方案中，car包含另外的其它共刺激結構域。其它共刺激結構域可以包括但不限于cd28、cd27、ox-40(cd134)、dap10和4-1bb(cd137)中的一種或多種。除了由cd3ζ引發的主要信號以外，由插入人car中的人共刺激受體提供的附加信號對于t細胞的完全活化是重要的，并且可以幫助改善體內持久性和過繼性免疫療法的治療成功。

在某些特定方面，細胞內信號傳導結構域包含與seqidno：13的cd3ζ細胞內結構域、seqidno：17的cd28細胞內結構域或seqidno：15的cd137細胞內結構域具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

iii.載體和細胞工程

在具體實施方案中，提供了分離的核酸區段和整合了編碼轉基因的dna序列的表達盒。例如，轉基因可編碼car多肽。在另外的方面，轉基因編碼靶抗原(或其表位)和/或hla多肽。在另外的方面，轉基因編碼線粒體報告轉基因，諸如包含線粒體定位信號的報告多肽(例如，熒光報告蛋白)。

如本領域技術人員將理解的，在一些情況下，可刪除編碼的轉基因末端處的幾個氨基酸的編碼序列。例如，在編碼car的轉基因的情況下，可以刪除car中的抗原結合結構域的幾個氨基酸(通常不超過10個，更通常地不超過5個殘基)的編碼序列，而不影響該分子的特異性或效應物結合親和力。此外，可能期望在轉基因編碼序列的邊界引入少量氨基酸(通常不超過10個，更通常地不超過5個殘基)。氨基酸的缺失或插入可以是由于構建、提供方便的限制性位點、易于操作、改善表達水平等的需要而引起的。另外，由于類似的原因，可發生不同氨基酸對一個或多個氨基酸的取代，通常取代不超過5個轉基因編碼序列(例如，在car的任何結構域中)中的氨基酸。

可以以常規方式制備根據實施方案的轉基因構建體。因為在大多數情況下，可使用天然序列，適當時，可分離和操作天然基因，以便允許各種組分的適當聯接。例如，在car的情況下，可以通過使用聚合酶鏈式反應(pcr)，使用合適的引物來分離編碼嵌合抗原受體的n末端和c末端蛋白質組分的核酸序列，所述引物導致基因的不需要部分的刪除。或者，克隆基因的限制性消化可用于產生嵌合構建體。在任一情況下，可以選擇序列來提供平端化的，或具有互補重疊的限制性位點。

用于制備轉基因構建體的各種操作可以在體外進行，并且在特定實施方案中，使用標準轉化或轉染方法將嵌合構建體引入用于在適當宿主中克隆和表達的載體。因此，在每次操作之后，克隆來自dna序列連接的所得構建體，分離載體，篩選序列以確保序列編碼所需轉基因(例如，嵌合抗原受體)和表達控制序列。可通過限制性分析、測序等來篩選該序列。

實施方案的載體主要被設計來將所需基因遞送至免疫細胞，優選免疫效應細胞(例如，t細胞)或apc，使之處于受調節的真核啟動子的控制之下。可根據實施方案使用的啟動子包括例如mndu3啟動子、cmv啟動子、ef1α啟動子或遍在蛋白啟動子。此外，如果沒有其他原因，載體可含有選擇標記，以便于它們在體外的操作。在其它實施方案中，可以從從dna模板體外轉錄的mrna表達轉基因(例如，car)。

在根據實施方案使用的示例性核酸構建體(多核苷酸)中，將啟動子可操作地連接至編碼實施方案的轉基因的核酸序列，即將它們定位以促進信使rna從編碼該轉基因的dna轉錄。啟動子可具有基因組來源或是合成產生的。用于t細胞的各種啟動子是本領域公知的(例如，marodon等(2003)公開的cd4啟動子))。例如，啟動子可以是組成型或誘導型的，其中誘導與特定細胞類型或特定成熟水平相關。或者，許多公知的病毒啟動子也是合適的。目標啟動子包括β-肌動蛋白啟動子、sv40早期和晚期啟動子、免疫球蛋白啟動子、人巨細胞病毒啟動子、逆轉錄病毒啟動子和friend脾病灶形成病毒啟動子。啟動子可以與增強子相關聯，也可以不與增強子相關聯，其中增強子可天然地與特定啟動子或與不同啟動子相關聯。

編碼轉基因的開放閱讀框的序列可獲自基因組dna來源、cdna來源，或可合成(例如，通過pcr)或其組合。取決于基因組dna的大小和內含子的數量，可能希望使用cdna或其組合，因為已發現內含子穩定mrna或提供t細胞特異性表達(barthel和geldfeld，2003)。此外，還可有利的是使用內源或外源非編碼區穩定mrna。

為了表達實施方案的轉基因，編碼轉基因的核酸序列的天然存在的或內源轉錄起始區域可用于在目標宿主中產生嵌合抗原受體。或者，可使用允許組成型或誘導型表達的外源轉錄起始區(例如，tet-on或tet-off啟動子系統)，其中可根據目標宿主、所需表達水平、目標宿主的性質等控制表達。

同樣地，在一些情況下，可使用將由轉基因編碼的多肽引導至細胞表面的信號序列。在一些情況下，信號序列是存在于轉基因的天然形式中的信號序列。任選地，在一些情況下，可能需要將該序列與不同的信號序列交換。然而，選定的信號序列應與用于表達轉基因的細胞(例如，t細胞)的分泌途徑相容，以使得轉基因存在于細胞表面。

類似地，終止區可由轉基因的天然形式的天然存在或內源轉錄終止區提供。或者，終止區可來源于不同的來源導。在大多數情況下，終止區的來源通常被認為對于重組蛋白的表達不至關重要的，并且可以使用多種終止區，而不會不利地影響表達。

預期可將轉基因構建體，諸如car表達構建體作為裸露dna或于合適的載體中引入受試者自己的細胞(或引入來自不同供體受試者的細胞)。使用裸dna通過電穿孔來穩定轉染細胞諸如t細胞的方法是本領域已知的。參見例如，美國專利第6,410,319號(通過引用并入本文)。裸露dna通常是指以用于表達的正確取向包含在質粒表達載體中的本實施方案的編碼轉基因(例如，嵌合抗原受體)的dna。有利地，裸露dna的使用可減少產生表達實施方案的轉基因的細胞所需的時間。

在另外的方面，可使用基于轉座子的系統將轉基因構建體引入細胞，以介導轉基因(例如，car)構建體整合至細胞的基因組dna中。通常，此類方法將涉及將(i)編碼轉座酶(或轉座酶多肽)的第一載體和(ii)編碼側連轉座子重復序列的所需轉基因表達元件的第二載體引入細胞。轉座子或轉座元件包括在其上游和下游具有末端重復序列的(短)核酸序列，并編碼有助于將核酸切除并插入靶dna序列的酶。幾種轉座子/轉座酶系統已適用于異源dna序列的遺傳插入，包括睡眠美人(sb)，來自魚的tc1/mariner樣元件(其在多種脊椎動物培養細胞系和胚胎干細胞中以及在體內表現出轉座活性(ivics等，1997))。在美國專利第6,489,458號、第7,148,203號、第8,227,432號、美國專利公布第2011/0117072號；mates等，2009中和ivics等，1997中(所述專利、專利公布和文獻的每一篇通過引用整體并入本文)提供了另外的轉座酶和轉座子系統。

或者，可使用病毒載體(例如，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體或慢病毒載體)將轉基因引入細胞。根據實施方案的方法使用的合適載體在受試者的細胞中是非復制的。已知大量基于病毒的載體，其中在細胞中維持的病毒拷貝數足夠低以維持細胞的存活力。舉例說明性載體包括本文公開的pfb-neo載體以及基于hiv、sv40、ebv、hsv或bpv的載體。

iv.免疫效應細胞

在某些方面，本文所述的實施方案包括制備和/或擴增抗原特異性重定向的免疫效應細胞(例如，t細胞、nk細胞或nkt細胞)的方法，其包括用含有編碼car的dna(或rna)構建體的表達載體轉染細胞，然后，任選地，用飼養細胞、重組抗原或受體的抗體刺激細胞以引起細胞增殖。在某些方面，經工程化以表達car的細胞(或細胞群)是干細胞、ips細胞、免疫細胞或這些細胞的前體。下面描述的方法涉及用于car表達的t細胞(或其它免疫細胞)工程的具體實例。

免疫效應細胞的來源包括同種異體和自體來源。在一些情況下，免疫效應細胞可從干細胞或誘導多能干細胞(ipsc)分化而來。因此，可從臍帶血、外周血、人胚胎干細胞或ipsc分離根據實施方案的用于工程的細胞。例如，同種異體t細胞可被修飾來包括嵌合抗原受體(并且任選地，缺乏功能性tcr)。在一些方面，免疫效應細胞是原代人t細胞，諸如來源于人外周血單核細胞(pbmc)的t細胞、用g-csf刺激后收集的pbmc、骨髓或臍帶血。轉染或轉導(例如，利用car表達構建體)后，可立即輸注細胞或可以儲存細胞。在某些方面，在轉染后，可將細胞離體繁殖數天、數周或數月，在基因轉移入細胞后約1天、2天、3天、4天、5天或更長時間內繁殖為大量群體。在另外的方面，轉染后，克隆轉染子，離體擴增顯示存在單一整合的或以附加體維持的表達盒或質粒以及表達嵌合抗原受體的克隆。選擇用于擴增的克隆顯示出特異性識別和裂解表達抗原的靶細胞的能力。重組t細胞可通過用il-2或結合常用γ-鏈的其它細胞因子(例如，il-7、il-12、il-15、il-21等)刺激來擴增。可通過在人工抗原呈遞細胞上刺激擴增重組t細胞。可在人工抗原呈遞細胞上，或用與t細胞表面上的cd3交聯的抗體(諸如okt3)擴增重組t細胞。可在人工抗原呈遞細胞上或用結合t細胞表面上的cd52的抗體(例如campath)刪除重組t細胞的亞群。在另一方面，可被冷凍保存遺傳修飾的細胞。

在另外的方面，已選擇了實施方案的免疫效應細胞的高線粒體備用呼吸容量(src)。如本文中所用，“具有高線粒體src的免疫效應細胞”是指具有比相應的平均免疫效應細胞(例如，t細胞)更高的線粒體活性或線粒體數目的免疫效應細胞(例如，t細胞)。因此，在一些方面，實施方案的細胞組合物包含具有高線粒體src的免疫效應細胞群，例如具有高線粒體src的表達car的t細胞群。

具有高線粒體src的免疫效應細胞(諸如cd8⁺t細胞)可在應激條件(諸如高腫瘤負荷、缺氧、缺乏用于糖酵解的營養物或抑制性細胞因子環境)下相對于具有較低src的細胞表現出增加的存活率。此外，選擇用于高線粒體src的免疫效應細胞甚至可在應激條件下保留細胞毒活性。因此，通過選擇具有高線粒體src的免疫效應細胞，可產生用于治療和用于car構建體測試的改善的細胞組合物。

在一個方面，提供了包含可用于測定轉基因效應細胞的線粒體src的報告分子的轉基因免疫效應細胞。例如，轉基因細胞可包含與線粒體定位信號連接的報告多肽。例如，報告子可以是熒光多肽，諸如增強的黃色熒光蛋白(yfp)或增強的綠色熒光蛋白(egfp)，線粒體定位信號可來自谷氧還蛋白(grx2)。在本文中，熒光報告子鑒定了具有高線粒體src的car+t細胞。例如，可基于強度熒光分選表達報告子的轉基因細胞，并輸注其以在體內殺傷腫瘤。同樣地，可測試轉基因細胞的靶細胞的離體殺傷，以測定例如候選car多肽的治療功效。

在一些方面，根據實施方案使用的線粒體報告基因可以是內源基因。在另外的方面，線粒體報告基因可以是外源基因，諸如編碼熒光報告蛋白的基因。在一些方面，熒光報告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，用于選擇具有高src的免疫效應細胞的方法可包括流式細胞術或facs。

在某些方面，用于鑒定具有src的免疫效應細胞的報告基因的表達可處于核啟動子(例如，hef1a)的控制之下。在某些方面，報告基因的表達可處于線粒體啟動子的控制之下。在某些方面，表達的報告蛋白可包含線粒體定位序列。在某些方面，表達的報告蛋白可被引導至細胞表面。在某些方面，報告基因的表達可處于線粒體啟動子的控制之下，并且表達的報告蛋白可被引導至細胞表面。在一些方面，外源報告基因可側接轉座子重復序列或病毒ltr。在一些方面，可將外源報告基因包含在染色體外核酸諸如mrna或附加型載體中。

v.用于繁殖免疫效應細胞的方法

在一些情況下，將實施方案的免疫效應細胞(例如，t細胞)與活化和繁殖細胞(aapc)共培養以幫助細胞擴增。例如，抗原呈遞細胞(apc)可用于制備實施方案的治療性組合物和細胞治療產品。關于抗原呈遞系統的制備和使用的一般指導，參見例如，美國專利第6,225,042號、第6,355,479號、第6,362,001號和第6,790,662號、美國專利申請公布第2009/0017000號和第2009/0004142號，以及國際公布第wo2007/103009號，所述專利或申請公布的每一篇通過引用并入。

在一些情況下，將aapc與最佳長度的肽一起溫育，這允許所述肽直接結合于mhc分子而無需額外的加工。或者，細胞可以表達目標抗原(即，在不依賴于mhc的抗原識別的情況下)。此外，在一些情況下，apc可表達通常與特定car多肽或多種car多肽結合的抗體(例如，通用活化和繁殖細胞(uapc))。此類方法公開于國際((pct)專利公布第wo/2014/190273號(其通過引用并入本文)中。除了肽-mhc分子或抗原以外，aapc系統還可包含至少一種外源性輔助分子。可使用輔助分子的任何合適數量和組合。輔助分子可選自多種輔助分子諸如共刺激分子和粘附分子，示例性共刺激分子包括cd70和b7.1(b7.1以前稱為b7，也稱為cd80)，除其它以外，其與t細胞表面的cd28和/或ctla-4分子結合，從而影響例如t細胞擴增、th1分化、短期t細胞存活和細胞因子分泌，諸如白細胞介素(il)-2(參見kim等，2004)。粘附分子可包括碳水化合物結合糖蛋白，諸如選擇蛋白、跨膜結合糖蛋白諸如整聯蛋白、鈣依賴性蛋白諸如鈣粘蛋白，和單次跨膜免疫球蛋白(ig)超家族蛋白，諸如細胞間粘附分子(icam)，其促進，例如，細胞間或細胞與基質的接觸。示例性粘附分子包括lfa-3和icam，諸如icam-1。在例如美國專利第6,225,042號、第6,355,479號和第6,362,001號(通過引用并入本文)中例舉了用于選擇、克隆、制備和表達示范性輔助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技術、方法和試劑。

被選擇成為aapc的細胞優選在細胞內抗原加工、細胞內肽運輸和/或細胞內mhci類或ii類分子-肽負載中具有缺陷，或者是變溫的(即，對溫度攻擊不如哺乳動物胞系敏感)，或具有缺陷和變溫特性。優選地，被選擇成為aapc的細胞也缺乏表達至少一種針對外源mhci類或ii類分子和被引入細胞的輔助分子組分的內源對應物(例如，如上所述的內源mhci類或ii類分子和/或內源輔助分子)的能力。此外，aapc優選在它們的修飾(以產生aapc)之前保留由細胞具有的缺陷和變溫特性。示例性aapc構建與抗原加工(tap)缺陷型細胞系諸如昆蟲細胞系相關的轉運蛋白或來源于其。示例性變溫昆蟲細胞系是果蠅細胞系，諸如schneider2細胞系(參見例如schneider1972)。在美國專利第6,225,042號、第6,355,479號和第6,362,001號中提供了用于schneider2細胞的制備、生長和培養的舉例說明性方法。

在一個實施方案中，還將aapc經受凍融循環。在示例性的凍融循環中，可通過使含有aapc的合適容器與適量的液氮、固體二氧化碳(即，干冰)或類似的低溫材料接觸來冷凍aapc，以使得冷凍迅速發生。然后，通過從低溫材料中取出aapc并暴露于環境室溫條件下，或通過其中使用溫水浴或溫暖的手以促進較短的解凍時間的促進解凍法來將冷凍的apc解凍。另外，可冷凍aapc，并在解凍之前將其儲存延長的時期。還可將冷凍的aapc解凍，然后在進一步使用之前凍干。優選地，在含有經歷凍融循環的aapc的介質中不存在可不利地影響凍融過程的防腐劑，諸如二甲基亞砜(dmso)、聚乙二醇(peg)和其它防腐劑，或所述防腐劑基本上被去除，諸如通過將aapc轉移至基本上不含此類防腐劑的介質中。

在另外的實施方案中，可通過交聯使異種核酸和對于aapc是內源的核酸失活，以使得在滅活后基本上無細胞生長、核酸復制或表達。在一個實施方案中，在外源mhc和輔助分子表達后，在此類分子在aapc表面上呈遞后，以及在用所選擇的肽或多種肽負載所呈遞的mhc分子后的點上滅活aapc。因此，此類滅活和選擇的肽負載的aapc，雖然基本上不能增殖或復制，但保留所選擇的肽呈遞功能。優選地，交聯還產生基本上不含污染性微生物諸如細菌和病毒的aapc，而不顯著降低aapc的抗原呈遞細胞功能。因此，交聯維持重要的aapc功能，同時有助于減輕對使用aapc開發的細胞治療產品的安全性的擔憂。關于與交聯和aapc相關的方法，參見例如美國專利申請公布第20090017000號，其通過引用并入本文。

在某些情況下，可通過在用作治療劑之前，使用熒光報告蛋白，使用facs基于它們的線粒體強度(或細胞的總線粒體含量)來分選經car修飾的細胞。

vi.工程化的抗原呈遞細胞

在某些實施方案中，還提供了工程化的抗原呈遞細胞(apc)。可以例如，如上所述，使用此類細胞來離體繁殖免疫效應細胞。在另外的方面，工程化的acp本身可被施用于患者，從而在體內刺激免疫效應細胞的擴增。實施方案的工程化的apc本身可用作治療劑。在一些實施方案中，工程化的apc可用作治療劑，其可刺激對于靶抗原是特異的內源免疫效應細胞的活化和/或增加對于靶抗原是特異的過繼轉移的免疫效應細胞的活性或持久性。

如本文中所用，術語“工程化的apc”是指包含至少編碼人白細胞抗原(hla)的第一轉基因的細胞。suvch工程化的apc還可包含用于表達抗原的第二轉基因，以使得抗原存在于與hla復合的apc表面上。在一些方面，工程化的apc可以是呈遞抗原的細胞類型(例如，樹突狀細胞)。在另外的方面，可以從通常不呈遞抗原的細胞類型(諸如t細胞或t細胞祖細胞(稱為“t-apc”))產生工程化的apc。因此，在一些方面，實施方案的工程化的apc包含編碼靶抗原的第一轉基因和編碼hla的第二轉基因，以使得hla在與靶抗原的表位復合的工程化的apc表面上表達。在某些特定方面，在工程化的apc中表達的hla是hla-a、hla-b、hla-c或hla-drb1。在另外的方面，在工程化的apc中表達的hla是hla-a2。

在一些方面，實施方案的工程化的apc還可包含至少編碼共刺激分子的第三轉基因。共刺激分子可以是可為膜結合的cγ細胞因子的共刺激細胞因子。在某些方面，共刺激細胞因子是il-15，諸如膜結合的il-15。在一些其它方面，工程化的apc可包含編輯的(或刪除的)基因。例如，可以編輯抑制性基因諸如pd-1、lim-3、ctla-4或tcr，以減少或消除該基因的表達。

實施方案的工程化的apc可包含編碼任何目標靶抗原的轉基因。例如，靶抗原可為感染性疾病抗原或腫瘤相關抗原(taa)。靶抗原可以是細胞內或細胞表面抗原。例如，在一些方面，靶抗原是taa，諸如源自腫瘤細胞的亞細胞區室的taa。taa可以是膜結合的、細胞質的、核定位的或甚至由腫瘤細胞分泌的。在一些方面，與相應的正常組織相比，taa差異表達，從而允許免疫效應細胞優先識別腫瘤細胞。靶抗原的具體實例包括但不限于wt1、muc1、lmp2、hpve6e7、egfrviii、her-2/neu、獨特型、magea3、p53非突變體、ny-eso-1、psma、gd2、cea、melana/mart1、ras突變體、gp100、p53突變體、蛋白酶3(pr1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、psa、htert、肉瘤易位斷裂點、epha2、pap、ml-iap、afp、epcam、erg(tmprss2ets融合基因)、na17、pax3、alk、雄激素受體、細胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mcn、rhoc、trp-2、gd3、巖藻糖基gm1、間皮素、psca、magea1、sle(a)、cyp1b1、plac1、gm3、boris、tn、globoh、etv6-aml、ny-br-1、rgs5、sart3、stn、碳酸酐酶ix、pax5、ot-tes1、精子蛋白17、lck、hmwmaa、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-1、fap、pdgfr-β、mad-ct-2和fos相關抗原1。

在一些具體方面，實施方案的工程化的apc是被經工程化以用作抗原呈遞細胞的t細胞(稱為“t-apc”)。具體地，實施方案的t-apc包含編碼靶抗原的第一轉基因和編碼hla的第二轉基因。因此，t-apc可以呈現編碼的抗原，諸如taa。例如，本文例舉的t-apc包含編碼ny-es0-1抗原和hla-a2的轉基因。因此，這些細胞可用于離體或體內(在被施用于患者之后)繁殖ny-eso-1特異性免疫效應細胞。此外，本文所例舉的t-apc可被進一步工程化來表達另外的共刺激分子，特別是膜結合的il-15(mil-15)。所述額外的共刺激分子進一步改善靶抗原特異性免疫效應細胞的產生并增加這些細胞的持久性。

vii.治療應用

在一些方面，實施方案的嵌合抗原受體構建體和細胞通過減小這些受試者中的腫瘤的尺寸或阻止腫瘤的生長或再生長，應用于患有或懷疑患有癌癥的受試者。因此，本文提供的實施方案還涉及這樣的方法，所述方法通過將本實施方案的嵌合抗原受體構建體引入受試者的分離的t細胞并將所述轉化的t細胞重新引入受試者中(從而實現抗腫瘤反應以減少或消除受試者中的腫瘤)來減少受試者中的腫瘤生長或阻止腫瘤形成。可使用的合適的t細胞包括細胞毒性淋巴細胞(ctl)或具有需要破壞的t細胞受體的任何細胞。如本領域技術人員所公知的，各種方法可容易地獲得用于從受試者中分離這些細胞。例如，使用細胞表面標志物表達或使用市售的試劑盒(例如，來自pierce，rockford，ill的isocell^tm)。

一旦確定轉染的或轉導的免疫效應細胞(例如，t細胞)能夠以所需的調節和期望的水平將嵌合抗原受體表達為表面膜蛋白，則可確定嵌合抗原受體在宿主細胞中是否具有提供所需的信號誘導的功能。隨后，將所述轉導的免疫效應細胞重新引入或施用于受試者以激活受試者中的抗腫瘤反應。為了便于施用，可用還可以是藥學上可接受的適當的載體或稀釋劑將根據實施方案的轉導的t細胞制備成藥物組合物或制成適于在體內施用的植入物。制備此類組合物或植入物的方法已在本領域中進行了描述(參見例如，remington′spharmaceuticalsciences，第16版，mack，編輯(1980))。適當時，可以以通常的方式將轉導的t細胞配制成半固體或液體形式的制劑，諸如膠囊、溶液、注射劑、吸入劑或氣溶膠。本領域已知的方法可用于在其到達靶組織或器官之前防止或最小化組合物的釋放和吸收，或確保組合物的定時釋放。然而，理想地使用不會影響表達嵌合抗原受體的細胞的藥學上可接受的形式。因此，理想地，可將轉導的t細胞制成含有平衡鹽溶液，優選hanks平衡鹽溶液或生理鹽水的藥物組合物。

在某些實施方案中，將實施方案的表達car的細胞遞送至有此需要的個體，諸如患有癌癥或感染的個體。然后細胞增強個體的免疫系統以攻擊相應的癌癥或病原體感染的細胞。在一些情況下，給個體提供一個或多個劑量的抗原特異性car細胞。在其中給個體提供兩個或更多個劑量的抗原特異性car細胞的情況下，施用之間的持續時間應足以允許在個體中繁殖的時間，并且在具體實施方案中，劑量之間的持續時間為1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天。用于獲得治療作用的合適劑量為例如優選在一系列給藥周期中每劑量至少10⁵個或約10⁵個至約10¹⁰個細胞。示例性給藥方案由4個一周的遞增劑量的給藥周期組成，始于第0天的至少約10⁵個細胞，例如在起始患者內劑量遞增方案的數周內逐漸增加至高達約10¹⁰個細胞的目標劑量。合適的施用模式包括靜脈內、皮下、腔內(例如通過儲存器進入裝置)、腹膜內注射和至腫瘤塊內的直接注射。

實施方案的藥物組合物(例如，包含表達car的t細胞)可以單獨使用或與用于治療癌癥的其它良好建立的試劑組合使用。無論單獨遞送還是與其它藥物組合遞送，實施方案的藥物組合物可通過各種途徑遞送至哺乳動物，特別是人體內的各個部位，以獲得特定作用。本領域技術人員將認識到，盡管可使用不止一種途徑來施用，但特定途徑可提供比另一種途徑更直接且更有效的反應。例如，真皮內遞送可用于治療黑素瘤。局部或全身性遞送可通過將制劑施用(包括敷用或滴注)入體腔、吸入或吹入氣霧劑，或通過腸胃外導入(包括肌內、靜脈內、肝門靜脈內、肝內、腹膜、皮下或真皮內施用)來實現。

實施方案的組合物可以以單位劑量形式提供，其中每個劑量單位，例如注射液，單獨地或與其它活性劑適當組合地含有預定量的組合物。本文所用的術語單位劑型是指適合作為人和動物受試者的單位劑量的物理上離散的單位，每個單位單獨地或與其它活性劑組合地含有預定量(以足以在適當的情況下與藥學上可接受的稀釋劑、載體或媒介物結合產生所需作用的量計算的)的實施方案的組合物。實施方案的新型單位劑型的規格取決于特定受試者中的與藥物組合物相關的特定藥效學。

理想地，有效量或足夠數量的分離的轉導的t細胞存在于組合物中并被引入受試者中，以使得建立長期特異性的抗腫瘤反應來減少腫瘤的尺寸或消除腫瘤增長或再生長，否則將不產生此類治療。理想地，當與其中不存在轉導的t細胞的在其它方面相同的條件相比，重新引入到受試者中的轉導的t細胞的量導致腫瘤尺寸的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％減小。如本文中所用，術語“抗腫瘤有效量”是指減少受試者的癌細胞或腫瘤生長的表達car的免疫效應細胞的有效量。

因此，所施用的轉導的免疫效應細胞(例如，t細胞)的量應考慮給藥途徑，并且應當使得足夠數量的轉導的免疫效應細胞被引入以達到所需的治療反應。此外，包含在本文所述的組合物中的每種活性劑的量(例如，每待接觸的每種細胞的量或每一定體重的量)可在不同的應用中變化。通常，轉導的t細胞的濃度理想地應該足以在被治療的受試者中提供至少約1×10⁶至1×10⁹個轉導的t細胞，甚至更理想地，約1×10⁷至約5×10⁸個轉導的t細胞，雖然可使用高于，例如大于5×10⁸個細胞，或低于，例如小于1×10⁷個細胞的任何合適的量。給藥方案可基于良好建立的基于細胞的療法(參見例如，topalian和rosenberg，1987；美國專利第4,690,915號)，或者可采用替代的連續輸注策略。

這些值提供了在優化實施方案的方法時由實踐者使用的轉導的t細胞的范圍的一般指導。此類范圍在本文中的引述絕不排除較高或較低量的組分的使用，這在特定應用中可能是有必要的。例如，實際劑量和時間安排可取決于組合物是否與其它藥物組合物組合施用，或取決于藥代動力學、藥物處置和代謝的個體差異而變化。本領域技術人員可以根據特定情況的緊急情況進行任何必要的調整。

vii.實施方案的試劑盒

可將本文所述的任何組合物包含在試劑盒中。在一些實施方案中，在試劑盒中提供同種異體cart細胞，所述試劑盒還可包括適合于擴增細胞的試劑，諸如培養基、apc、工程化的apc、生長因子、抗體(例如，用于分選或表征cart細胞)和/或編碼轉基因諸如靶抗原、hla、線粒體報告子、car或轉座酶的質粒。

在非限制性實例中，嵌合抗原受體表達構建體、用于產生嵌合抗原受體表達構建體的一種或多種試劑、用于表達構建體的轉染的細胞和/或獲得用于表達構建體的轉染的同種異體細胞的一種或多種儀器(此類儀器可以是注射器、移液管、鑷子和/或任何此類醫學上認可的裝置)。

在一些實施方案中，在試劑盒中提供了用于消除內源性tcrα/β表達的表達構建體，產生構建體的一種或多種試劑，和/或在試劑盒中提供了car+t細胞。在一些實施方案中，包括編碼鋅指核酸酶的表達構建體。

在一些方面，試劑盒包含用于細胞的電穿孔的試劑或裝置。

試劑盒可包含一種或多種適當等分的實施方案的組合物或產生實施方案的組合物的試劑。可將試劑盒的組分包裝在水性介質中或以凍干形式包裝其。試劑盒的容器裝置可包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其它容器裝置，其中可以放置組分(優選適當地等分的)。當試劑盒中存在不止一種組分時，則試劑盒通常還將含有第二、第三或其它附加容器，可將附加組分分開放置在所述容器中。然而，可將組分的各種組合包含在小瓶中。實施方案的試劑盒通常還將包括用于容納嵌合抗原受體構建體的裝置和用于商業銷售的嚴密封閉的任何其它試劑容器。此類容器可包括例如注射或吹塑塑料容器(將所需小瓶保留在其中)。

viii.實施例

通過參考以下實施例進一步詳細描述本發明的實施方案。提供這些實施例僅是為了說明的目的，并且除非另有說明，否則不旨在限制。因此，本發明絕不應被解釋為限于以下實施例，而應理解為包括由于本文提供的教導而變得顯而易見的任何和所有變化。

實施例1-fc受體對car的結合與快速cart細胞清除有關

研究了fc受體與car多肽結合在cart細胞持久性中的作用。對于初步研究，研究了被靶向cd19受體的car構建體。cart細胞表達cd19rcd28構建體，其包含cd19結合結構域(vl/vh)、鉸鏈結構域(igg4-fc)、跨膜結構域(cd28tm)和細胞內信號傳導結構域(cd28-cd3ζ)(參見圖1)。使用介導構建體的基因組整合(參見例如，國際(pct)申請第pct/us14/38005號，通過引用并入本文)的基于睡美人的轉座子系統(sleepingbeauty-basedtransposonsystem)，經由電穿孔將car構建體引入細胞。然后通過流式細胞術分析產生的cart細胞以評估car多肽表達。發現car多肽在轉染后高效表達，并且在與k562aapc共培養28天后，高比例的所得細胞群對于car表達呈陽性(圖2a)。流式細胞術研究還表明，一部分cart細胞在體外被fcγr2a結合，表明fc受體的結合可能在體內影響casrt細胞，并且可在持久性cart細胞中起作用。

也在攜帶cd19陽性腫瘤的小鼠中完成了研究。簡言之，用海腎熒光素酶(hrluc)⁺nalm6腫瘤細胞注射nsg小鼠，然后單次注射cd19rcd28t細胞(或對照注射)。經由隨時間推移的成像測量與腫瘤細胞相關的生物發光。如圖3a-b所示，雖然cart細胞最初能夠控制腫瘤生長(第21天時間點)，但在注射后第28天，即使在處理的動物中，腫瘤的外生長也是非常明顯的。該作用可能與例如因fcr結合引起的t細胞的體內持久性相關。因此，通過包含fc受體結合元件，可以限制car多肽的體內持久性(和潛在毒性)。

實施例2-具有減少的fc受體結合的car多肽

已產生不同cart細胞構建體的陣列來調節fc受體與cart細胞的結合。測試的構建體示于圖4中。具體地，在許多不同的跨膜和細胞內/信號傳導結構域的背景中測試了不同的鉸鏈序列。圖5中所示的流式細胞術研究表明，所有測試的構建體在轉染的t細胞(如上所述，通過電穿孔，使用用于整合car受體構建體的基于睡美人的轉座子系統完成轉染、)中高效表達。同樣地，在與k562aapc共培養28天后，高比例的所得t細胞呈car受體陽性(圖5)。與k562aapc共培養的cart細胞擴增的動力學示于圖7中，并證明所有cart細胞以相似的效率擴增。

接下來，通過流式細胞術測試cart細胞的體外fc受體結合。如圖6所示，當包含人igg4鉸鏈序列的cart細胞被fc受體(具體地被fcγr2a)結合時，表達具有l235e和n297q取代的突變型igg4鉸鏈的細胞顯示出顯著更少的對fc受體的結合。

然后評估表達每種測試的car構建體的cart細胞的靶向cd19陽性腫瘤細胞的能力。在圖8-9所示的研究中，在離體實驗中測試cart細胞裂解靶細胞(圖8)或響應于靶細胞產生ifnγ(圖9)的能力。在這些研究之后進行體內實驗，以測定各種cart細胞控制小鼠中的外植腫瘤的外生長的功效。簡言之，如上所述，用腫瘤(hrluc+nalm-6)注射(i.v.)nsg小鼠，然后在第二天用螟娥螢火蟲(p.pyralis)熒光素酶(ffluc)+car+t細胞注射(i.c.)所述小鼠。在使用ivis100系列系統分別注射enduren或熒光素后進行腫瘤和t細胞成像。小鼠的成像示于圖10中。在每種情況下，在施用后立即對t細胞成像以確認心內注射(頂行)。陰影圖像表示來自腫瘤來源的hrluc活性隨時間推移的光子通量。也將來自這些研究的發光數據繪圖，并將其示于圖11中。最后，圖12顯示了描繪用各種cart細胞處理的nsg小鼠的存活曲線的圖。這些研究的結果表明，與攜帶野生型igg4鉸鏈序列的cart-細胞相比，表達減少fc受體結合的構建體(即，eq突變型igg4鉸鏈、cd8a鉸鏈或12個氨基酸的間隔子鉸鏈)的cart細胞中的每一種具有更大的功效。具體地，這些構建體在小鼠中顯示改善的對腫瘤細胞生長的控制，并延長了治療的動物的存活時間。因此，這些研究表明，通過減少fc受體結合，可以顯著增強cart細胞的體內持久性和抗腫瘤功效。

實施例3-附加的car結構研究

使用被靶向cd19受體的car構建體進行附加研究。與初始研究相似，用cd19r*cd28或cd19rcd8cd28轉座子及sb11轉座酶對pbmc進行電穿孔，并在7天的刺激周期中與il-2和il-21一起在經輻照的克隆1上共培養28天。在每個刺激周期結束時，對細胞進行計數和表型分型(cd3，car)(圖13a-d)。

在這些研究之后進行體內實驗以在nsg(nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj，nodscidγ)小鼠中針測定各種cart細胞針對cd19⁺nalm-6細胞系的功效。研究了最小殘留疾病(mrd)模型和建立的腫瘤模型兩者。在mrd模型中，在第0天注射10⁴個細胞的hrluc⁺mkate⁺nalm-6注射nsg小鼠，然后在第1天心肌內注射t細胞(10⁷/小鼠)。隨時間的推移，使用enduren活細胞基質，通過來源于hrluc⁺nalm-6的生物發光成像評價腫瘤負荷(圖14a)。在建立的腫瘤模型中，在第0天向nsg小鼠注射1.5x10⁴個ffluc⁺egfp⁺nalm-6，并將腫瘤移植5天，評價腫瘤負荷，并在第6天心內注射t細胞(10⁷/小鼠)。隨時間的推移，使用d-熒光素底物，使用來自ffluc⁺nalm-6的生物發光成像計算腫瘤通量。顯示了表示隨時間推移的光子通量和腫瘤通量的偽彩圖像(圖14c)。也將這些研究的發光數據繪圖，并對于每一個模型分別將其示于圖14b和14d中。

實施例4-mil-15共表達cart細胞功效和持久性的作用

在自體或同種異體小鼠模型中進行cart細胞輸注后，監測細胞因子il-2、il-4、il-7、il-9和il-15的水平。探究另外的信號傳導構建體以改善持久性。圖15顯示膜結合的il-15/il-15受體(mil15)構建體。將mil-15構建體與car在t細胞中共表達。圖16中的數據(參見例如，左圖)顯示car和mil15在絕大多數電穿孔的細胞上共表達。圖16中呈現的另外的數據表明，當與car共表達時，mil-15能夠在抗原撤出后使cart細胞在培養中免于下降(參見圖16，右上圖)。

隨后在體內確認表明car-mil-15t細胞的持久性增強的細胞培養結果。對于這些研究，向小鼠注射表達單獨的car或與mil-15組合的car的ffluc+t細胞。注射熒光素后進行t細胞成像。如圖17b所示，mil-15-cart細胞在體內表現出延長的持久性。進一步的體內研究檢查了表達mil-15的cart細胞在控制腫瘤生長方面的有效性。這些研究使用已建立的腫瘤模型來完成，并且在腫瘤植入(i.v.注射的)6天后，如所指示的，注射(i.c.)遺傳修飾的t細胞。

實施例5-t細胞的遺傳修飾

離體繁殖t細胞以用作抗原呈遞細胞(t-apc)來呈遞腫瘤相關抗原(taa)ny-eso-1。睡美人(sb)系統(hackett等，2010)適應于遺傳修飾t細胞(圖20)(cooper等，2005)。這涉及兩個步驟：(i)表達sb轉座子[即，重定向t細胞特異性的嵌合抗原受體(car)(jin等，2011；kebriaei等，2012)]和sb轉座酶的dna質粒的電轉移和(ii)在共表達cd64(fc受體)、cd86、cd137l和膜結合的白細胞介素(il)-15的突變蛋白(mil-15，圖21)的來源于k562細胞系的設計者人工抗原呈遞細胞(aapc)上穩定表達整合體的t細胞的繁殖和擴增。為了強化ny-eso-1免疫原的表達，用潮霉素選擇培養物中的t-apc，因為質粒sb表達盒共表達潮霉素磷酸轉移酶(hy)與胸苷激酶(hytk)的融合物(圖20)。在殺細菌濃度的潮霉素b存在的情況下，通過用經γ輻照的負載有okt3的aapc連續刺激來繁殖遺傳修飾的t細胞(圖20)。通過使用病毒抗原甲型流感mp1，t細胞可在體外和體內用作t-apc(cooper等，2005)。在該實施例中，將t細胞工程化以表達ny-eso-1(融合至flag標記的hytk)(圖22)，并在人工抗原呈遞細胞(aapc)(圖26)存在的情況下，使用sb系統繁殖ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc(hackett等，2010)。

實施例6-評價工程化的t細胞

本文所述實施方案的mil15⁺ny-eso-1⁺t-apc，當與pbmc共培養時，能夠產生ny-eso-1五聚體陽性t細胞，并且能夠擴增能夠在體外殺死骨髓瘤細胞的ny-eso-1⁺cart細胞(圖23和24)。然而，來自t-apc的cd137l活化的不存在以及來自lag3表達的增加的抑制可能已導致共培養3周后觀察到的減弱的反應(圖25)。lag3表達隨著t-apc的每次刺激而增加，并且可以是耗盡的替代物。

圖28進一步說明這些結果，所述結果顯示ny-eso-1特異性tcr⁺和car⁺t細胞對ny-eso-1⁺u266人多發性骨髓瘤細胞系的殺傷。在來源于k562的人工活化和繁殖細胞(aapc)上擴增t細胞，并且所述t細胞表達hla-a02和ny-eso-1⁺。所顯示的數據代表兩個獨立實驗，其中繁殖9-2-15的ny-eso-1特異性cart細胞，用hla-a2/ny-eso-1t-apc刺激3次，并用衍生的aapck562刺激2次。9-2-15car含有cd8α莖，而先前的car含有igg4莖。增加的刺激導致骨髓瘤細胞的裂解增加。

還評價ny-eso-1⁺mil-15⁺hla-a2⁺t-apc的呈現taa的能力。這通過pbmc與自體t細胞的共培養來實現，所述自體t細胞先前已被遺傳修飾來表達ny-eso-1特異性αβtcr。使用t-apc成功地在數值上擴增ny-eso-1五聚體⁺t細胞。類似地，還修飾了k562來源的aapc以呈現ny-eso-1，并將其用于選擇性地活化和繁殖ny-eso-1特異性遺傳修飾的t細胞(作為陽性對照)。該陽性對照不能像t-apc那樣在pbmc中誘導免疫。還在hla的背景中研究了使用識別ny-eso-1來源的肽的嵌合抗原受體(car)來重定向t細胞的特異性。t-apc能夠成功地擴增cart細胞以及陽性對照k562來源的aapc(圖27)。

實施例7-src/線粒體強度的測定

所有細胞(癌細胞和原代細胞)均具有響應于可用代謝物將它們的線粒體從正統構型轉換至縮合狀態以及反之亦然的能力(krauss等，2001)。與在類似的離體培養條件下生長的模擬電穿孔的對照t細胞相比，在經car-修飾的t細胞中，線粒體形狀是不同的(圖29a和29b)。當在共刺激不存在的情況下，將用cd28信號傳導結構域修飾的t細胞與用cd137t細胞信號傳導結構域修飾的細胞進行比較時，某些經car-修飾的t細胞具有縮合狀態線粒體的觀察變得驚人(圖30)。因此，離體生長的未修飾和經修飾的t細胞的代謝需求和消耗模式是不同的，并且當在特異性共刺激不存在的情況下離體繁殖細胞時變得突出。與此同時，在小鼠模型中顯示，在cd8+t細胞中維持線粒體功能和src(備用呼吸容量)對感染后穩定的cd8⁺記憶t細胞形成是關鍵的(pearce等，2013；vanderwindt等，2012)。src被描述為可用于在細胞中在增加的工作或應激的條件下產生能量的額外線粒體容量，并且被認為對于長期細胞存活和功能是重要的。在體外進行了一系列實驗以確定具有高線粒體強度的t細胞與具有規律線粒體質量的t細胞相比，是否能夠更好地存活，從而在體內更有效。

遺傳修飾t細胞以表達熒光報告蛋白。使用如前所述的睡美人介導的轉座(rushworth等，2014)，開發熒光報告蛋白eyfp-grx2(圖31)并在t細胞上表達。質粒eyfp-grx2-sb編碼在hef1a啟動子控制下表達的融合蛋白eyfp-mito，將所述質粒全部嵌入睡美人(sb)載體主鏈中。sb載體ir/dr序列有助于由從第二質粒pcmv-kan-sb11表達的酶sb11(轉座酶)引導的編碼具有線粒體定位序列(grx2)的熒光蛋白的轉基因的轉座。與熒光蛋白報告子和sb11一起，再表達兩種質粒，一種質粒編碼對于腫瘤相關抗原(諸如her1-3、ror1、cd19或cd123)是特異的嵌合抗原受體(car)，且一種質粒含有與將熒光蛋白引導至細胞核的核定位序列(nls)融合的第二熒光蛋白mcherry(即，mcherry-nls-sb)。使用人t-細胞核轉染試劑盒(amaxa/lonza)和電穿孔裝置(lonza)，通過電穿孔將所有組合的四種質粒遞送至細胞。表達熒光蛋白質粒的載體圖的示意圖描繪于圖31中。

car⁺t細胞的產生。通過sb介導的轉座和dna轉移(通過對pbmc來源的t細胞電穿孔進行的)的類似方法產生靶向特異性腫瘤相關抗原的嵌合抗原受體陽性t細胞。設計具有靶向b細胞惡性腫瘤上的cd19和/或ror1、白血病干細胞(急性髓樣白血病)上的cd123或egfr陽性乳腺癌上的her1-3的特異性的car+t細胞，并通過電穿孔的類似方法將其在t細胞上表達。每個car被設計來含有t細胞共刺激胞內結構域cd28或4-1bb(cd137)以及cd3z。每個car含有經修飾的igg4-fc莖，其用作支架來在細胞表面上突出與t細胞信號傳導胞內結構域融合的scfv。使用fc-莖特異性抗體確認car在t細胞表面上的表達。

設計和產生car種類的方法(參見例如，國際(pct)專利公布第wo/2015/123642號，其通過引用并入本文)是已知的，但預測哪些體外或動物試驗將鑒定出在人中輸注時具有優異治療潛力的car設計仍然是一個挑戰。目前，研究者通常依賴于以下測試的陣列來推進用于診所的car結構：對活化誘導的細胞死亡(aicd)和car介導的增殖的抗性、殺傷和細胞因子產生。本文中教授的是鑒定可具有改善的治療潛力的car設計的單一測試。cd8⁺記憶t細胞(但非cd8⁺效應t細胞)具有顯著的線粒體備用呼吸容量(src)。記憶細胞，與效應細胞不同，具有獨特組的代謝需求。在高腫瘤負荷期間應激增加的情況下，遺傳修飾的t細胞的線粒體從正統結構轉換為縮合形式(圖29b和33a-33b)。然而，只有一些細胞保留了轉換回原始正統線粒體結構的靈活性，這是t效應細胞的性能特征(characteristicfeature)。具有高線粒體src的t細胞能夠在與高腫瘤負荷相關的不利條件(諸例如缺氧、缺乏用于糖酵解的營養物和抑制性細胞因子環境)下存活，但仍然可以保留它們的細胞毒性能力(圖34)。此類細胞毒性t細胞在本文中被定義為“高能細胞”，其可以是體內腫瘤的最佳系列殺傷劑。

car⁺t細胞的離體擴增。將car-t細胞與表達car特異性配體(2d3scfv，參見例如，pct申請第pct/us2014/039365號)的經輻照的k562hla^cneg細胞一起共同培養，并且外源性添加il2但不存在共刺激(rushworth等，2014)。在car-t細胞的遺傳修飾后，以1∶2(1car-t細胞：2aapc)的比例添加經輻照的、活化和繁殖的(aapc)飼養細胞(圖30)。

鑒定并在數值上擴增了可在人體試驗中長期體內存活的具有代謝活性的高能car⁺t細胞。這通過使用介導基因轉移的睡美人(sb)系統來實現。在經輻照的“通用”活化和繁殖細胞(k562-uapc)上共同培養已經歷從sb系統(編碼car和sb轉座酶)進行的兩種dna質粒的電轉移的t細胞。為了鑒定具有參與“高能”代謝的能力的遺傳修飾的t細胞，同時也對命名為eyfp-grx2-sb的第三sbdna種類進行電穿孔。該sb轉座子表達融合蛋白eyfp-2a-grx2并含有線粒體定位序列。熒光報告子鑒定了具有額外線粒體備用呼吸容量(src)的car⁺t細胞。這些細胞可基于eyfp熒光的強度來分選，并將其輸注以用于體內腫瘤殺傷。

流式細胞術。按照標準分選程序在lsr-fortessa流式細胞儀(bd)上基于eyfp的內源表達，分選car-t的高線粒體強度，而無需任何染色標志物(圖32)。

顯微術。將經car修飾的細胞固定在1％多聚甲醛溶液中，并使用標準程序通過透射電子顯微術進行分析。使用leicadmi6000倒置熒光顯微鏡和metamorph成像軟件(7.8版)定量經car修飾的和未修飾的t細胞的熒光強度，以確定高線粒體強度的經car修飾的t細胞(et-細胞)是否具有額外的線粒體備用呼吸容量(圖35、36、37a和37b)。

具有高eyfp表達的car可具有旁路細胞凋亡、上調car⁺t細胞中的抗凋亡基因的必要特征，并且在體內持久以達到臨床相關的抗腫瘤作用。可能期望從電轉移的體外轉錄的mrna種類瞬時表達報告基因和/或表達可用于順磁珠基選擇的細胞表面分子(例如，截短的神經生長因子受體)。代替針對某些car設計的人應用的排序，該方法提供了一種途徑，通過該途徑可在體外篩選大量不同的car分子(例如，如由ez-car系統產生的)的報告基因(例如，eyfp)的共同表達，從而基于期望的線粒體src選擇所述car分子。

實施例8-4-1bb(cd137)介導的t細胞信號傳導

car⁺t細胞的基因修飾和離體繁殖引起改變的線粒體代謝，并且4-1bb介導的t細胞信號傳導促進car⁺t細胞在有挑戰性的培養環境中更好地存活。

比較靶向ror1或her1-3的兩種不同的car，以測定信號傳導結構域對限制性培養條件下的car-t細胞生長的作用。如前所述，在睡美人(sb)載體主鏈上建立car構建體。car在各自的載體構建體中使用cd28-cd3z信號傳導結構域或cd137(4-1bb)-cd3z信號傳導結構域。除了靶向單獨的腫瘤抗原之外，car主鏈如先前針對cd19特異性car所述的還保持不變，所述cd19特異性car利用靶向腫瘤抗原的小鼠scfv和人igg4fc來源的莖連接car與跨膜和信號傳導結構域。先前已描述了靶抗原，即cll上的ror1(deniger等，plosone，2015)和乳腺腫瘤上的her1-3(jena等，ash，2014)。在sb介導的基因修飾之后，在經輻照的通用活化和繁殖細胞上繁殖car-t細胞(uapc；rushworth等，jimmunothrer.2014)。如實施例7中所述，研究car-t細胞的生長動力學、線粒體結構和線粒體形態學。

與cd137-cd3z信號傳導相比，含有cd28-cd3z信號傳導的car-t細胞的生長和存活較差，與所用的轉座子負載或靶抗原無關(圖38和39)。在本研究中共測試了總共3種不同的car，即含有cd28z或cd137z信號傳導的cd19-car、her1-3car、ror1⁺car。在通用aapc上活化并擴增所有car，其中t細胞僅通過car-莖經由嵌合在k562細胞上的scfv配體進行信號傳導。在特異性共刺激不存在的情況下，含有cd28信號傳導的car-t細胞迅速進行細胞凋亡，而含有cd137z信號傳導的car-t細胞持續更長的時間，并且始終顯示增加的線粒體質量(通過共焦顯微術觀察到高eyfp強度)。

在cd28z-car-t細胞中線粒體數量很少且幾乎沒有分布，而cd137z-car-t細胞記錄了更亮和更高水平的eyfp信號。這證明了線粒體的高備用呼吸容量(src)，并提供了cd137z-cart細胞在限制性培養環境中存活的機理證據。

***

雖然本文已經顯示和描述了本發明的優選實施方案，但對于本領域技術人員顯而易見的是，此類實施方案僅以示例的方式提供。在不脫離本發明的情況下，本領域技術人員現將會想到許多變型、變化和替代。應當理解，本文所述的本發明的實施方案的各種替代方案可用于實施本發明。以下權利要求旨在限定本發明的范圍，并且在這些權利要求及其等同物的范圍內的方法和結構由些覆蓋。

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序列表

<110>得克薩斯州大學系統董事會

<120>基因修飾的免疫效應細胞和用于擴增免疫效應細胞的工程化的細胞

<130>utfc.p1251wo

<140>未知的

<141>2015-11-05

<150>us62/075,561

<151>2014-11-05

<150>us62/075,642

<151>2014-11-05

<150>us62/075,667

<151>2014-11-05

<150>us62/169,979

<151>2015-06-02

<160>28

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>230

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4fc區

<400>1

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151015

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202530

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<213>智人

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<210>3

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4鉸鏈區

<400>3

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1510

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>4

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151015

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180185190

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195200205

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<400>5

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<210>6

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<213>人工序列

<220>

<223>合成vl結構域

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65707580

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<210>7

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<213>人工序列

<220>

<223>whitlow接頭肽

<400>7

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151015

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<210>8

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<213>人工序列

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<223>合成vh結構域

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lysmetasnserleuglnthraspaspthralailetyrtyrcysala

859095

lyshistyrtyrtyrglyglysertyralametasptyrtrpglygln

100105110

glythrservalthrvalserser

115120

<210>9

<211>230

<212>prt

<213>智人

<400>9

gluserlystyrglyproprocysprosercysproalaprogluphe

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserleuglylysmet

225230

<210>10

<211>230

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成igg4鉸鏈

<400>10

gluserlystyrglyproprocysproprocysproalaprogluphe

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserleuglylysmet

225230

<210>11

<211>68

<212>prt

<213>智人

<400>11

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysargser

202530

argleuleuhisserasptyrmetasnmetthrproargargprogly

354045

prothrarglyshistyrglnprotyralaproproargasppheala

505560

alatyrargser

<210>12

<211>68

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成cd28跨膜結構域

<400>12

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpvalargserlysargser

202530

argglyglyhisserasptyrmetasnmetthrproargargprogly

354045

prothrarglyshistyrglnprotyralaproproargasppheala

505560

alatyrargser

<210>13

<211>112

<212>prt

<213>智人

<400>13

argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly

151015

glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr

202530

aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

354045

proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys

505560

asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg

65707580

argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala

859095

thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

100105110

<210>14

<211>27

<212>prt

<213>智人

<400>14

phetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrserleu

151015

leuvalthrvalalapheileilephetrpval

2025

<210>15

<211>42

<212>prt

<213>智人

<400>15

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

151015

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

202530

proglugluglugluglyglycysgluleu

3540

<210>16

<211>41

<212>prt

<213>智人

<400>16

argserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>17

<211>41

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成cd28細胞質結構域

<400>17

argserlysargserargglyglyhisserasptyrmetasnmetthr

151015

proargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyralapro

202530

proargaspphealaalatyrargser

3540

<210>18

<211>12

<212>prt

<213>智人

<400>18

gluserlystyrglyproprocysprosercyspro

1510

<210>19

<211>32

<212>prt

<213>智人

<400>19

phealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcysgly

151015

valleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysasnhisargasn

202530

<210>20

<211>43

<212>prt

<213>智人

<400>20

lysprothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothr

151015

ilealaserglnproleuserleuargproglualacysargproala

202530

alaglyglyalavalhisthrargglyleuasp

3540

<210>21

<211>2037

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成car寡核苷酸

<400>21

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgtgagctgccccaccccgcctttctgctg60

atcccccagtccgagctgacccagcccagatccgtgtccggctccccaggccagtccgtg120

accatctcctgcaccggcaccgagagggacgtgggcggctacaactacgtgtcctggtat180

cagcagcaccccggcaaggcccccaagctgatcatccacgacgtgatcgagaggtcctcc240

ggcgtgcccgacaggttctccggctccaagtccggcaacaccgcctccctgaccatcagc300

ggactgcaggccgaggacgaggccgactactactgctggtccttcgctggcggctactac360

gtgttcggcaccggaaccgacgtgaccgtgctgggcagcacctccggcagcggcaagcct420

ggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaagtgcagctgctggaatccggcggaggactg480

gtgcagccaggcggctccctgagactgtcttgcgccgcctccggcttcaccttctccacc540

taccagatgtcctgggtgcgccaggccccaggcaagggcctggaatgggtgtccggaatc600

gtgtcctctggcggctccaccgcctacgccgactccgtgaagggcaggttcaccatctcc660

agagacaactccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgagggccgaggacacc720

gccgtgtactactgtgccggcgagctgctgccctactacggcatggacgtgtggggccag780

ggcaccaccgtgaccgtgtcctccgagagcaagtacggccctccctgccccccttgccct840

gcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacacc900

ctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggac960

cccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaag1020

ccccgggaggagcagttcaatagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcac1080

caggactggctgaacggcaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaagggcctgcccagc1140

agcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgggagccccaggtgtacacc1200

ctgccccctagccaagaggagatgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctggtgaag1260

ggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaac1320

tacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaggctg1380

accgtggacaagagccggtggcaggagggcaacgtctttagctgctccgtgatgcacgag1440

gccctgcacaaccactacacccagaagagcctgtccctgagcctgggcaagatgttctgg1500

gtgctggtcgtggtgggtggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttc1560

atcatcttttgggtgaagagaggccggaagaaactgctgtacatcttcaagcagcccttc1620

atgcggcccgtgcagaccacccaggaagaggacggctgcagctgccggttccccgaggaa1680

gaggaaggcggctgcgaactgcgggtgaagttcagccggagcgccgacgcccctgcctac1740

cagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggccggagggaggagtacgac1800

gtgctggacaagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagccccggagaaagaac1860

cctcaggagggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgag1920

atcggcatgaagggcgagcggcggaggggcaagggccacgacggcctgtaccagggcctg1980

agcaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga2037

<210>22

<211>679

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成car多肽

<400>22

metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro

151015

alapheleuleuileproglnsergluleuthrglnproargserval

202530

serglyserproglyglnservalthrilesercysthrglythrglu

354045

argaspvalglyglytyrasntyrvalsertrptyrglnglnhispro

505560

glylysalaprolysleuileilehisaspvalilegluargserser

65707580

glyvalproaspargpheserglyserlysserglyasnthralaser

859095

leuthrileserglyleuglnalagluaspglualaasptyrtyrcys

100105110

trpserphealaglyglytyrtyrvalpheglythrglythraspval

115120125

thrvalleuglyserthrserglyserglylysproglyserglyglu

130135140

glyserthrlysglygluvalglnleuleugluserglyglyglyleu

145150155160

valglnproglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphe

165170175

thrpheserthrtyrglnmetsertrpvalargglnalaproglylys

180185190

glyleuglutrpvalserglyilevalserserglyglyserthrala

195200205

tyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasnser

210215220

lysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthr

225230235240

alavaltyrtyrcysalaglygluleuleuprotyrtyrglymetasp

245250255

valtrpglyglnglythrthrvalthrvalsersergluserlystyr

260265270

glyproprocysproprocysproalaproglupheleuglyglypro

275280285

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

290295300

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserglngluasp

305310315320

progluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

325330335

alalysthrlysproargglugluglnpheasnserthrtyrargval

340345350

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

355360365

tyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproserserileglulys

370375380

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

385390395400

leuproproserglngluglumetthrlysasnglnvalserleuthr

405410415

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

420425430

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

435440445

aspseraspglyserphepheleutyrserargleuthrvalasplys

450455460

serargtrpglngluglyasnvalphesercysservalmethisglu

465470475480

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserleugly

485490495

lysmetphetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyr

500505510

serleuleuvalthrvalalapheileilephetrpvallysarggly

515520525

arglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargproval

530535540

glnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheprogluglu

545550555560

glugluglyglycysgluleuargvallyspheserargseralaasp

565570575

alaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasn

580585590

leuglyargarggluglutyraspvalleuasplysargargglyarg

595600605

aspproglumetglyglylysproargarglysasnproglnglugly

610615620

leutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrserglu

625630635640

ileglymetlysglygluargargargglylysglyhisaspglyleu

645650655

tyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhis

660665670

metglnalaleuproproarg

675

<210>23

<211>1488

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成car寡核苷酸

<400>23