一種FcγRIIb基因敲除的MDSC及其作為抗腫瘤藥物的應用的制作方法

本發明屬于免疫學領域，具體涉及一種fcγriib基因敲除的mdsc及其作為抗腫瘤藥物的應用。

背景技術：

腫瘤發生時共同髓系祖細胞分化過程受阻，造成處于不同分化階段的髓系祖細胞及未成熟髓系細胞大量擴增并活化為具有免疫抑制功能的髓源性抑制細胞(myeloid-derivedsuppressorcell,mdsc)，在骨髓、外周血、脾臟、淋巴結和腫瘤組織中大量聚集。mdsc主要通過抑制t細胞發揮其強大的免疫抑制功能，如通過表達精氨酸酶和誘導型一氧化氮合成酶(inos)抑制t細胞增殖；通過分泌il-10或tgf-β誘導調節性t細胞產生。動物實驗和臨床研究均表明，mdsc擴增與多種腫瘤的預后呈負相關，并降低腫瘤免疫治療的效果。因而，調控mdsc的分化及表型功能是腫瘤免疫治療的新策略。新近的研究顯示：在特定情況下，如抗磷脂酰絲氨酸抗體能夠誘導腫瘤組織中mdsc向免疫刺激表型極化；使用shp-1抑制劑，腫瘤組織和脾臟中mdsc均能極化為免疫刺激表型并進行抗腫瘤應答。因此，改變mdsc的極化狀態，使其向免疫刺激表型極化是腫瘤免疫治療的新思路。

技術實現要素：

本發明提供一種fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)的mdsc。

本發明的另一實施方案提供上述fcγriib基因敲除的mdsc的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

給fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)小鼠皮下注射1×10⁶個肺癌細胞株3ll細胞或黑色素瘤細胞株b16f10細胞，3周后無菌分離獲取小鼠脾臟，用無菌針芯將脾臟磨碎，經400目鋼網濾過并收集單細胞，tris-nh4cl裂解紅細胞，pbs洗滌2遍，cd11b磁珠4℃標記15min后，過分選柱陽性選擇cd11b⁺細胞，即可制備得到fcγriib基因敲除的mdsc。

上述制備方法中fcγiirb^-/-小鼠優選c57bl/6背景的小鼠。

上述制備得到的fcγriib基因敲除的mdsc經流式細胞儀檢測cd11b⁺gr-1⁺mdsc純度在90％以上。

本發明的另一實施方案提供上述fcγriib基因敲除的mdsc在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述抗腫瘤藥物優選用于預防和/或治療肺癌、黑色素瘤。

本發明所述的pbs的制備方法：將nacl(16g)、nahpo4(5.78g)、kh2po4(0.27g)和kcl(0.4g)溶于2000ml三蒸水中，用鹽酸調ph至7.4，高壓滅菌，4℃保存備用。

本發明所采用的具體方法是：分別給野生(wildtype,wt)小鼠和fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)小鼠皮下注射1×10⁶個肺癌細胞株3ll細胞或黑色素瘤細胞株b16f10細胞，3周后取小鼠的脾臟，免疫磁珠分選cd11b⁺gr-1⁺mdsc。部分mdsc裂解后檢測精氨酸酶活性，部分mdsc鋪板后24小時，收集上清，檢測上清中一氧化氮(no)、il-10和tnf-α的分泌情況。結果在兩種荷瘤模型中均發現：與wtmdsc相比，fcγiirb^-/-mdsc精氨酸酶活性和il-10分泌明顯下降，inos活性和tnf-α分泌明顯增高，提示fcγriib缺陷誘導mdsc向免疫刺激型極化。為了進一步證實fcγiirb^-/-mdsc具有抗腫瘤效應，分別給wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠皮下注射1×10⁶個3ll細胞，3周后取小鼠的脾臟，磁珠分選wtmdsc和fcγiirb^-/-mdsc，備用。給c57bl/6小鼠皮下注射1×10⁵個3ll細胞，在注射3ll細胞后的第7天、第14天和第21天分別給荷瘤小鼠靜脈過繼回輸wtmdsc和fcγiirb^-/-mdsc，同時設靜脈注射pbs緩沖液的對照。檢測荷瘤小鼠腫瘤的生長情況。結果發現：過繼回輸wtmdsc可促進腫瘤生長，而過繼回輸fcγiirb^-/-mdsc則延緩腫瘤的生長(圖1)，提示fcγiirb^-/-mdsc具有抗腫瘤效應。

本發明首次提出fcγiirb在mdsc向免疫刺激表型極化過程中發揮重要的調控作用，從而影響腫瘤的進展，為研制以fcγiirb為靶標的新型腫瘤防治手段提供基礎。

附圖說明

圖1fcγriib^-/-b16f10荷瘤小鼠mdsc細胞因子分泌情況

圖2fcγriib^-/-3ll荷瘤小鼠mdsc細胞因子分泌情況

圖3fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾臟mdsc具有抗腫瘤效應

圖4fcγriib缺陷降低3ll荷瘤小鼠的死亡率

具體實施方式

為了便于對本發明的進一步理解，下面提供的實施例對其做了更詳細的說明。但是這些實施例僅供更好的理解發明而并非用來限定本發明的范圍或實施原則，本發明的實施方式不限于以下內容。

有關原材料說明：

(1)3ll和b16f10細胞株來自美國菌種保藏中心(americantypeculturecollection,atcc)，由本室保種。

(2)小鼠cd11b分選磁珠購自德國美天妮公司。

(3)il-10和tnf-α的elisa檢測試劑盒購自達科為公司。

(4)c57bl/6小鼠購自揚州大學比較醫學中心。

(5)fcγiirb基因缺陷小鼠來源于美國jackson實驗室，由本室保種。

(6)檢測一氧化氮的griess試劑購自美國sigma公司。

(7)檢測精氨酶酶活性的試劑盒購自美國bioassay公司。

(一)fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾臟mdsc向免疫刺激表型極化

(1)mdsc的獲取

分別給c57bl/6背景的wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠背部皮下注射1×10⁶個3ll細胞或b16f10細胞，3周后無菌分離獲取小鼠脾臟，用無菌針芯將脾臟磨碎，經400目鋼網濾過并收集單細胞，tris-nh4cl裂解紅細胞，pbs洗滌2遍，cd11b磁珠4℃標記15min后，過分選柱陽性選擇cd11b⁺細胞，經流式細胞儀檢測cd11b⁺gr-1⁺mdsc純度在90％以上。

(2)mdsc精氨酸酶和分泌細胞因子檢測

取1×10⁶個mdsc，用細胞裂解液裂解后，利用bioassay公司的精氨酸酶檢測試劑盒檢測精氨酸酶活性。另將磁珠分選得到的mdsc用含10％fbs的1640培養液重懸至1×10⁶/ml的密度，鋪至細胞培養板中，24小時后，收集上清，griess試劑檢測上清中no的水平，elisa法檢測il-10和tnf-α的表達水平。在來源于3ll和b16f10荷瘤小鼠的mdsc中均發現，與wtmdsc相比，fcγiirb^-/-mdsc精氨酸酶活性和il-10分泌明顯下降，inos活性和tnf-α分泌明顯增高(圖1、圖2)，提示fcγriib缺陷誘導mdsc向免疫刺激型極化。

(二)fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾臟mdsc具有抗腫瘤效應

(1)mdsc的獲取

分別給c57bl/6背景的wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠背部皮下注射1×10⁶個3ll細胞，3周后無菌分離獲取小鼠脾臟，用無菌針芯將脾臟磨碎，經400目鋼網濾過并收集單細胞，tris-nh4cl裂解紅細胞，pbs洗滌2遍，cd11b磁珠4℃標記15min后，過分選柱陽性選擇cd11b⁺細胞，經流式細胞儀檢測cd11b⁺gr-1⁺mdsc純度在90％以上。

(2)mdsc過繼回輸給3ll成瘤小鼠

給c57bl/6小鼠皮下注射1×10⁵個3ll細胞，在注射3ll細胞后的第7天、第14天和第21天分別給荷瘤小鼠靜脈過繼回輸(1)中磁珠分選得到的5×10⁶個wtmdsc或fcγiirb^-/-mdsc，同時設靜脈注射pbs的對照。檢測荷瘤小鼠腫瘤的生長情況。結果發現：過繼回輸wtmdsc可促進腫瘤生長，而過繼回輸fcγiirb^-/-mdsc則延緩腫瘤的生長，提示fcγiirb缺陷后的mdsc具有抗腫瘤效應(圖3)。

(3)fcγriib缺陷降低3ll荷瘤小鼠的死亡率

在檢測3ll腫瘤生長情況的同時，我們同樣觀察了wt和fcγiirb-/-荷瘤小鼠的死亡情況。結果發現：與wt小鼠相比，fcγiirb-/-小鼠死亡率明顯下降，提示fcγiirb缺陷對小鼠腫瘤致死有保護作用(圖4)。