基于亞硫酸氫鹽測序法的FOXP3基因甲基化檢測方法與流程

本發明涉及生物領域，特別涉及一種基于亞硫酸氫鹽測序法的foxp3基因甲基化檢測方法。

背景技術：

foxp3是調節性t細胞(regulatorytcell,treg)的特征性標志，在維持免疫耐受過程中發揮重要作用。近年來研究證實：foxp3基因的表達和蛋白功能的發揮均與表觀遺傳學(如dna甲基化、翻譯后修飾等)密切相關。亞硫酸氫鹽測序法是國內外學者公認的脫氧核糖核酸(dna)甲基化位點檢測金標準，可準確而靈敏地檢測出特定dna序列不同胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cpg)位點的甲基化狀態，但是受實驗過程中諸多因素(如樣本保存條件、基因組dna含量及純度、轉化后基因組dna含量、pcr反應體系、甲基化引物序列、藍白克隆篩選等試驗因素)的影響成功率低下。

技術實現要素：

本發明建立了一種基于亞硫酸氫鹽測序法的foxp3(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor,foxp3)基因甲基化檢測方法。

作為本發明的一個方面，提供了一種基于亞硫酸氫鹽測序法的foxp3基因甲基化檢測方法，包括：

步驟1，用促凝采血管收集人靜脈血4ml，室溫凝固30min，離心1000g×15min，而后分裝1ml血凝塊進1.5mlaxygenpe管，保存于-80℃冰箱中。

步驟2，采用血液基因組dna提取試劑盒提取血凝塊基因組dna。

步驟3，通過0.8％-1.0％的瓊脂糖凝膠電泳初步確定基因組dna完整性、濃度和純度，并將檢測合格的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

步驟4，采用甲基化轉化試劑盒修飾基因組dna，并將修飾好的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

步驟5，在確定的實驗條件下進行甲基化pcr擴增，通過2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)鑒定pcr產物，凝膠成像系統觀察、拍照，并將回收完畢的目的pcr產物置于-20℃冰箱備用；所述確定的實驗條件是：pcr模板量為10μl轉化后的基因組dna，pcr采用50μl反應體系和4μl的25mmol/lmgcl2，擴增產物長度為111bp。

步驟6，pcr產物通過2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)鑒定，凝膠成像系統觀察、拍照。

步驟7，采用dna純化回收試劑盒純化回收步驟5中的18μlpcr產物，通過載體連接將2μlpcr純化回收產物轉化入trans1-t1感受態細菌中，開展藍白克隆斑篩選，并以通用引物(m13f和m13r)做pcr擴增，產物經2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)分離，凝膠成像系統觀察、拍照，以鑒定陽性克隆。

步驟8，選取步驟7中陽性克隆斑中的菌體接種于50μg/ml卡那霉素單抗lb液體培養基中，在37℃恒溫200rpm/min震蕩培養8-12h后，取變渾濁的樣本送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序部進行測序。

優選地，所述步驟5中進行pcr擴增的引物序列為：

f:5’-atttttaggatttgaggttttaata-3’，

r:5’-caaaaaacccactaaaaaactatac-3’。

優選地，所述步驟5中進行甲基化pcr擴增時的反應條件為：

步驟a，94℃預加熱3min；

步驟b，94℃變性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；

步驟c，重復上述步驟b中的循環35次；

步驟d，72℃保持7min后，4℃保存。

優選地，所述步驟5所確定的pcr實驗體系為：4μl的25mmol/lmgcl2。

優選地，所述步驟1中的血液采集方法為用促凝采血管收集人靜脈血。

優選地，所述步驟1中收集的靜脈血在室溫凝固30min，離心1000g×15min，而后分裝1ml血凝塊進1.5mlaxygenpe管。

優選地，所述步驟1中的血凝塊保存條件為：-80℃冰箱。

優選地，所述步驟2中的dna提取試劑盒為：北京市天根生物有限公司血液基因組dna提取試劑盒(貨號：dp348)。

優選地，所述步驟3中的初步確認基因組dna完整性、濃度和純度的方法為：0.8％-1.0％的瓊脂糖凝膠電泳法(130v，40min)。

優選地，所述步驟3中檢測到的基因組dna濃度為：5-20ng/μl。

優選地，所述步驟3中基因組dna保存條件為：-20℃冰箱。

優選地，所述步驟4中用于轉化的基因組dna含量為：100-400ng。

優選地，所述步驟4中甲基化轉化試劑盒為美國天漠公司產品(貨號：d5006)。

優選地，所述步驟4中轉化后的基因組dna保存條件為：-20℃冰箱。

優選地，所述步驟5的pcr模板量為10μl轉化后的基因組dna(即轉化后的全部基因組dna)。

優選地，所述步驟5的甲基化pcr采用50μl反應體系。

優選地，所述步驟5的擴增產物長度為111bp。

優選地，所述步驟5的pcr產物鑒定方法：2.0％的瓊脂糖凝膠電泳法(130v，40min)。

優選地，所述步驟6的用于純化回收試驗的pcr產物體積為18μl。

優選地，所述步驟6的藍白克隆斑篩選試驗所用的試劑盒為：北京全式金生物科技有限公司ta克隆試劑盒(貨號：ct101-02)。

優選地，所述步驟6的用于藍白克隆斑篩選試驗中的pcr純化回收產物的體積為2μl。

優選地，所述步驟6的藍白克隆斑篩選試驗所用的抗生素為卡那霉素。

優選地，所述步驟6鑒定陽性克隆的方法為：通過通用引物(m13f和m13r)做pcr擴增，產物經2％瓊脂糖凝膠電泳法(130v，40min)鑒定。

優選地，所述步驟7陽性克隆培養條件為：在50μg/ml卡那霉素單抗lb液體培養基中37℃恒溫200rpm/min震蕩培養8-12h。

本發明通過完善血液樣本保存條件、基因組dna濃度及純度檢測方法、轉化后基因組dna含量、pcr反應體系中不同成分的終濃度、甲基化引物序列特異性、藍白克隆篩選條件等試驗因素，成功地建立基于亞硫酸氫鹽測序法的foxp3基因甲基化檢測方法，能成功地檢測出foxp3基因啟動子區特定序列5個cpg位點甲基化的程度，從整體上提高試驗的準確性和可重復性。

附圖說明

圖1示意性地示出了樣本基因組dna電泳圖；

圖2示意性地示出了甲基化pcr擴增產物電泳圖；

圖3示意性地示出了藍白克隆斑篩選圖；

圖4示意性地示出了陰性重組子和陽性重組子pcr產物電泳圖；

圖5示意性地示出了foxp3基因啟動子區特定序列測序圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的實施例進行詳細說明，但是本發明可以由權利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。

foxp3是treg細胞的特征性標志，在維持免疫耐受過程中發揮重要作用。近來發現foxp3基因的表達和蛋白功能的發揮均表現為dna序列變異以外的調控機制即表觀遺傳學，包括dna甲基化、組蛋白修飾和翻譯后修飾等。dna甲基化以胞嘧啶甲基化發生頻率最高。胞嘧啶甲基化是指在dna甲基轉移酶的催化下以s-腺苷蛋氨酸為供體將甲基加在胞嘧啶5’的位置上形成5-甲基胞嘧啶的反應。部分位點是胞嘧啶和鳥嘌呤以磷酸酯相連而形成的cpg位點。影響基因表達的cpg位點主要位于基因的啟動子和第一外顯子區域。當特定基因啟動子區cpg位點高甲基化，可直接阻礙轉錄因子與啟動子結合，從而使基因不能轉錄或轉錄水平降低；相反，cpg位點的低甲基化則會導致染色質疏松，從而增加目的dna序列的易接近性，使得特異性轉錄因子更容易與其連接。foxp3基因座含有多個cpg位點。位于啟動子和第一外顯子的cpg位點甲基化程度與foxp3基因的表達密切相關，是t細胞分化過程中許多因子調節的關鍵靶點。

本發明摸索foxp3基因亞硫酸氫鹽測序，成功檢測出人foxp3基因啟動子區特定區域(+2071，+2182)5個cpg位點的甲基化狀態，具體實驗過程如下：

1.材料與方法

1.1材料與試劑

促凝采血管購自廣州健福醫療科技有限公司。

用促凝采血管收集健康工人靜脈血4ml，室溫凝固30min，離心1000g×15min，而后分裝1ml血凝塊進1.5mlaxygenpe管，保存于-80℃冰箱中，以防止基因組dna的降解導致實驗失敗。

血液基因組dna提取試劑盒購自中國北京市天根生物有限公司，卡那霉素和ta克隆試劑盒購自中國北京市全式金生物科技有限公司；

正常熔點瓊脂糖購自西班牙biowest公司；

taq酶、dna甲基化轉化試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別由美國fermentas公司、美國天漠公司和美國omega公司提供；

甲基化pcr引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成；

其余試劑為國產分析級試劑。

1.2甲基化引物設計

結合ncbi數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)和ensembl數據庫(http://asia.ensembl.org/index.html)的資料查找foxp3基因啟動子序列，使用methprimer在線分析軟件(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)進行引物設計，再到bisearch數據庫(http://bisearch.enzim.hu/index.php？m＝genompsearch)驗證引物。引物序列如表1，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

表1foxp3基因甲基化引物信息

1.3基因組dna的制備：

采用血液基因組dna提取試劑盒提取血凝塊基因組dna，通過0.8％-1.0％的瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)初步確定基因組dna完整性、濃度和純度，并將檢測合格的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

1.4基因組dna亞硫酸氫鹽轉化

采用甲基化轉化試劑盒修飾100-400ng基因組dna，并將修飾好的dna樣本置于-20℃冰箱備用。

1.5甲基化pcr擴增

pcr模板量為10μl轉化后的基因組dna(即轉化后的全部基因組dna)，pcr采用50μl反應體系，擴增產物長度為111bp，引物序列及其它組分終濃度均不變，詳見表2。

pcr反應條件：94℃預加熱3min；94℃變性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；重復上述循環35次。然后，72℃保持7min后，4℃保存。

pcr擴展產物均采用2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)分離，凝膠成像系統觀察、拍照。也可根據瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書的操作步驟回收18μl目的pcr產物。將回收完畢的目的pcr產物置于-20℃冰箱待用。

表2甲基化pcr反應體系

1.6目的基因的克隆及篩選

2μl(約50ng)pcr純化回收產物與載體連接，轉化入trans1-t1感受態細菌中，采用卡那霉素抗性，開展藍白克隆斑篩選試驗；以通用引物m13f和m13r做菌落pcr擴增，產物經2％瓊脂糖凝膠電泳(130v，40min)分離，凝膠成像系統觀察、拍照，以鑒定陽性克隆。

1.7測序

選取陽性克隆斑中的菌體接種于50μg/ml卡那霉素單抗lb液體培養基中，37℃恒溫200rpm/min震蕩培養8-12h后，取變渾濁的樣本送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序部進行測序。

2.結果

2.1基因組dna1％瓊脂糖凝膠電泳結果

如圖1所示，大部分樣本甬道在dna標記物15000bp條帶的上方可見明亮的目的條帶，此條帶即基因組dna，其大小與預期結果一致，部分條帶可見拖尾。

其中：

m：dna標記物；

1：樣本基因組dna；

2.2甲基化pcr2％瓊脂糖凝膠電泳結果

空白對照甬道未見條帶，樣本甬道在dna標記物100bp-250bp條帶之間出現明亮而清晰的目的條帶，其長度與foxp3基因甲基化pcr產物長度111bp相吻合，見圖2。

其中：

m：dna標記物；

1：空白對照；

2：樣本甲基化pcr產物；

2.3藍白克隆斑結果

陰性組未見藍斑或白斑，樣本組可見白色或藍色圓形光滑單一菌落。其中，白色菌落為有foxp3基因甲基化pcr產物插入的質粒轉化菌落(陽性重組子)，藍色菌落為空質粒轉化菌落(陰性重組子)，具體詳見圖3。

2.4pcr鑒定陽性克隆分析

陽性重組子(即陽性克隆)的pcr產物長度應為插入的foxp3基因甲基化pcr產物(111bp)和部分t載體(199bp)序列之和，長度應為310bp；陰性重組子(即陰性克隆)的pcr產物長度應為部分t載體序列長度199bp。2％瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，白色菌落甬道在dna標記物250bp和500bp條帶之間出現明亮而清晰的目的條帶，而藍色菌落甬道在dna標記物100bp和250bp條帶之間出現目的條帶，見圖4。這證實白色菌落即陽性重組子，而藍色菌落即陰性重組子。

其中：

m：dna標記物；

1：陰性重組子；

2：陽性重組子；

3：空白對照。

2.5克隆的測序結果

測序結果與人foxp3基因啟動子區特定dna序列(+2071，+2182)比對，目的片段無突變，5個cpg位點的胞嘧啶均未被亞硫酸氫鹽修飾，最后顯示為胞嘧啶，表明該樣本外周血foxp3基因啟動子特定區域所有cpg位點呈現高甲基化，見圖5。

圖5測序后顯示人foxp3基因啟動子區特定序列5個cpg位點高甲基化。

通過上述驗證例可知，本發明研究設計甲基化引物，確定整個實驗過程的各項條件，建立了基于亞硫酸氫鹽測序法的foxp3基因甲基化檢測方法。

發明人采用本發明中的方法反復進行了多次試驗，均可獲得理想的擴增產物。測序結果表明，亞硫酸氫鹽轉化完全，樣本外周血foxp3基因啟動子區特定區域的5個cpg位點均為高甲基化。

可見，本發明建立了亞硫酸氫鹽測序法的foxp3基因甲基化檢測方法。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。